Name: microinjection of western corn rootworm, diabrotica virgifera virgifera, embryos for germline transformation, or crispr/cas9 genome editing
Uploaded: 2018-04-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing at JoVE.com

Эта работа была поддержана грант от Монсанто кукурузы Rootworm знаний исследовательская программа, предоставить номер AG/1005 (в леях и МК) и запуск средства MDL от NCSU. ФК была поддержана от грантов от Монсанто кукурузы Rootworm знание программы исследований (AG/1005) и национального научного фонда, предоставьте номер MCB-1244772 (MDL). Авторы заявляют не конкурирующие интересы. ФК и MDL задумана и разработана экспериментов; FC, PW и SP выполненных экспериментов; ФК и MDL проанализированы результаты; и ФК, нг и MDL написал рукопись. Мы благодарим Тереза о ' Лири, Уильям Klobasa и Стефани Горски за их квалифицированную помощь в скрининг WCR. Мы также благодарим д-р французский Уэйд (USDA-ARS, север центральной сельскохозяйственных научно-исследовательская лаборатория, Брукингс, SD) для поставок яиц для создания лаборатории колоний и обеспечения воспитания протоколы.

1. колонии уровень воспитания WCR взрослых
<ol><li>Получить достаточное количество WCR взрослых (500-1000) от надежной компании или научно-исследовательских лаборатории (см. Таблицу материалов для примера) и место в клетке3 30 см. Примечание: Настоятельно рекомендуется использова...

<ol>
	<li>Gray, M. E., Sappington, T. W., Miller, N. J., Moeser, J., Bohn, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+and+Invasiveness+of+Western+Corn+Rootworm:+Intensifying+Research+on+a+Worsening+Pest.">Adaptation and Invasiveness of Western Corn Rootworm: Intensifying Research on a Worsening Pest.</a> Annual Review of Entomology. 54, 303-321 (2009).</li><li>Gassmann, A. J., Petzold-Maxwell, J. L., Keweshan, R. S., Dunbar, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field-evolved+resistance+to+Bt+maize+by+western+corn+rootworm.">Field-evolved resistance to Bt maize by western corn rootworm.</a> PLoS One. 6 (7), e22629 (2011).</li><li>Gray, M. E., Levine, E., Oloumi-Sadeghi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+to+crop+rotation:+western+and+northern+corn+rootworms+respond+uniquely+to+a+cultural+practice.">Adaptation to crop rotation: western and northern corn rootworms respond uniquely to a cultural practice.</a> Recent research developments in entomology. 2, 19-31 (1998).</li><li>Meinke, L. J., Siegfried, B. D., Wright, R. J., Chandler, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+Susceptibility+of+Nebraska+Western+Corn+Rootworm+(Coleoptera:+Chrysomelidae)+Populations+to+Selected+Insecticides.">Adult Susceptibility of Nebraska Western Corn Rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae) Populations to Selected Insecticides.</a> Journal of Economic Entomology. 91 (3), 594-600 (1998).</li><li>Roselle, R., Anderson, L., Simpson, R., Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Annual report for 1959, cooperative extension work in entomology. , (1959).</li><li>Wright, R., Meinke, L., Siegfried, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corn+rootworm+management+and+insecticide+resistance+management.">Corn rootworm management and insecticide resistance management.</a> Proceedings. , 45-53 (1996).</li><li>Baum, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+coleopteran+insect+pests+through+RNA+interference.">Control of coleopteran insect pests through RNA interference.</a> Nat Biotechnol. 25 (11), 1322-1326 (2007).</li><li>Velez, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+for+Successful+Parental+RNAi+as+An+Insect+Pest+Management+Tool+in+Western+Corn+Rootworm,+Diabrotica+virgifera+virgifera.">Parameters for Successful Parental RNAi as An Insect Pest Management Tool in Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera.</a> Genes (Basel). 8 (1), (2016).</li><li>Alves, A. P., Lorenzen, M. D., Beeman, R. W., Foster, J. E., Siegfried, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+as+a+method+for+target-site+screening+in+the+Western+corn+rootworm,+Diabrotica+virgifera+virgifera.">RNA interference as a method for target-site screening in the Western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera.</a> J Insect Sci. 10, 162 (2010).</li><li>Rangasamy, M., Siegfried, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+RNA+interference+in+western+corn+rootworm+Diabrotica+virgifera+virgifera+LeConte+(Coleoptera:+Chrysomelidae)+adults.">Validation of RNA interference in western corn rootworm Diabrotica virgifera virgifera LeConte (Coleoptera: Chrysomelidae) adults.</a> Pest Management Science. 68 (4), 587-591 (2012).</li><li>Khajuria, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parental+RNA+interference+of+genes+involved+in+embryonic+development+of+the+western+corn+rootworm,+Diabrotica+virgifera+virgifera+LeConte.">Parental RNA interference of genes involved in embryonic development of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera LeConte.</a> Insect Biochem Mol Biol. 63, 54-62 (2015).</li><li>Cooley, L., Kelley, R., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+of+the+Drosophila+genome+with+single+P+elements.">Insertional mutagenesis of the Drosophila genome with single P elements.</a> Science. 239 (4844), 1121-1128 (1988).</li><li>Robertson, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stable+genomic+source+of+P+element+transposase+in+Drosophila+melanogaster.">A stable genomic source of P element transposase in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 118 (3), 461-470 (1988).</li><li>Spradling, A. C., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+Cloned+P+Elements+into+Drosophila+Germ+Line+Chromosomes.">Transposition of Cloned P Elements into Drosophila Germ Line Chromosomes.</a> Science. 218 (4570), 341-347 (1982).</li><li>O'Kane, C. J., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+in+situ+of+genomic+regulatory+elements+in+Drosophila.">Detection in situ of genomic regulatory elements in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (24), 9123-9127 (1987).</li><li>Lukacsovich, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-tagging+gene+trap+of+novel+genes+in+Drosophila+melanogaster.">Dual-tagging gene trap of novel genes in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 157 (2), 727-742 (2001).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+Gene+Expression+as+a+Means+of+Altering+Cell+Fates+and+Generating+Dominant+Phenotypes.">Targeted Gene Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Horn, C., Offen, N., Nystedt, S., Hacker, U., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac-based+insertional+mutagenesis+and+enhancer+detection+as+a+tool+for+functional+insect+genomics.">piggyBac-based insertional mutagenesis and enhancer detection as a tool for functional insect genomics.</a> Genetics. 163 (2), 647-661 (2003).</li><li>Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+of+Drosophila+with+the+CRISPR/Cas9+system.">Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system.</a> Cell Rep. 4 (1), 220-228 (2013).</li><li>Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+cipher+governs+DNA+recognition+by+TAL+effectors.">A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors.</a> Science. 326 (5959), 1501 (2009).</li><li>Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+chromosomal+cleavage+and+mutagenesis+in+Drosophila+using+zinc-finger+nucleases.">Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).</li><li>Jeggo, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+breakage+and+repair.">DNA breakage and repair.</a> Adv Genet. 38, 185-218 (1998).</li><li>Gantz, V. M., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing.+The+mutagenic+chain+reaction:+a+method+for+converting+heterozygous+to+homozygous+mutations.">Genome editing. The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations.</a> Science. 348 (6233), 442-444 (2015).</li><li>Windbichler, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+homing+endonuclease-based+gene+drive+system+in+the+human+malaria+mosquito.">A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito.</a> Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).</li><li>Branson, T. F., Jackson, J. J., Sutter, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Method+for+Rearing+Diabrotica+virgifera+virgifera+(Coleoptera,+Chrysomelidae).">Improved Method for Rearing Diabrotica virgifera virgifera (Coleoptera, Chrysomelidae).</a> Journal of Economic Entomology. 81 (1), 410-414 (1988).</li><li>Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+superfamily+genes+in+Tribolium+castaneum+and+the+use+of+a+Tubulin+promoter+to+drive+transgene+expression.">Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression.</a> Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 749-755 (2008).</li><li>Chu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transformation+of+the+western+corn+rootworm,+Diabrotica+virgifera+virgifera.">Germline transformation of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera.</a> Insect Mol Biol. , (2017).</li><li>Ingolia, T. D., Craig, E. A., McCarthy, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+of+three+copies+of+the+gene+for+the+major+Drosophila+heat+shock+induced+protein+and+their+flanking+regions.">Sequence of three copies of the gene for the major Drosophila heat shock induced protein and their flanking regions.</a> Cell. 21 (3), 669-679 (1980).</li><li>Berghammer, A. J., Klingler, M., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+marker+for+transgenic+insects.">A universal marker for transgenic insects.</a> Nature. 402 (6760), 370-371 (1999).</li><li>Branson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+selection+of+a+non-diapause+strain+of+Diabrotica+virgifera+(Coleoptera:+Chrysomelidae).">The selection of a non-diapause strain of Diabrotica virgifera (Coleoptera: Chrysomelidae).</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 19 (2), 148-154 (1976).</li><li>Handel, K., Grunfelder, C. G., Roth, S., Sander, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tribolium+embryogenesis:+a+SEM+study+of+cell+shapes+and+movements+from+blastoderm+to+serosal+closure.">Tribolium embryogenesis: a SEM study of cell shapes and movements from blastoderm to serosal closure.</a> Dev Genes Evol. 210 (4), 167-179 (2000).</li><li>Handler, A. M., James, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Insect transgenesis: methods and applications. , (2000).</li><li>Lorenzen, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac-based+insertional+mutagenesis+in+Tribolium+castaneum+using+donor/helper+hybrids.">piggyBac-based insertional mutagenesis in Tribolium castaneum using donor/helper hybrids.</a> Insect Mol Biol. 16 (3), 265-275 (2007).</li><li>Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+CRISPR-mediated+gene+targeting+and+transgene+replacement+in+the+beetle+Tribolium+castaneum.">Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum.</a> Development. 142 (16), 2832-2839 (2015).</li><li>Phuc, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late-acting+dominant+lethal+genetic+systems+and+mosquito+control.">Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control.</a> BMC Biol. 5, 11 (2007).</li><li>Horn, C., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgene-based,+embryo-specific+lethality+system+for+insect+pest+management.">A transgene-based, embryo-specific lethality system for insect pest management.</a> Nat Biotechnol. 21 (1), 64-70 (2003).</li></ol>

Хотя микроинъекции WCR с двуцепочечных РНК с целью RNAi сообщил9, это первый протокол к внедрению наилучшей практики для microinjecting precellular WCR эмбрионов, критический процесс для проведения преобразования микрофлорой и/или Геном ТРИФОСФАТЫ/Cas9 редактирования в этот вид. Успешный ми?...

Западный кукурузный rootworm (WCR), под эгидой эгидой, является важным вредитель кукурузы1. Интересно, что, как представляется, преодолеть управления WCR меры более быстрыми темпами, чем большинство сельскохозяйственных вредителей, поскольку они не только адаптировать физиологически, но и поведенчески2,3,4,5, 6. за последнее десятилетие, РНК-интерференции (RNAi), мощный функциональный геномной инструмент, исследована как потенциальный метод управления WCR7,8и также был использован как средство для изучения функции гена9. Однако хотя интерференции часто производится путем микроинъекции двуцепочечной РНК (dsRNA) в других видов, РНК-интерференции на основе инъекций встречается редко в ВЦС. В самом деле есть лишь несколько сообщений о RNAi через микроинъекции двуцепочечной ДНК в ВЦС9. Причина что WCR может достичь высокого уровня генов нокдаун через проглатывание dsRNA7,10, даже позволяя исследования эмбриональных эффекты кормления двуцепочечной ДНК матери11. Хотя этот метод делает WCR отличная тема для функционального геномного анализа через РНК-интерференции, он замедлился прогресс в разработке методологий для эмбриональных микроинъекции в этот вид.
Несмотря на мощь интерференции есть несколько недостатков. Например не все гены одинаково реагировать на РНК-интерференции. Эта изменчивость может сделать интерпретации результатов функциональной геномики пробирного сложнее. Кроме того РНК-интерференции является временным и не создавать наследственные мутации. С другой стороны микрофлорой трансформации, другой функциональной геномной инструмент, может генерировать наследственные мутации через вставки элемента заметно транспонированная в геном,12-13. Это делает преобразование микрофлорой отличным инструментом для создания мутантных штаммов для использования в долгосрочных генетических исследований. Преобразование может также использоваться для спасения мутация, обеспечивая функциональную копию гена мутант генома14. Кроме того преобразование микрофлорой является краеугольным камнем широкий спектр молекулярно-генетических методов. Помимо выбивания и/или спасать функции гена, микрофлорой преобразование может использоваться для enhancer треппинга15, Джин треппинга16, на основе Gal4 внематочная выражение17и генома общесистемной мутагенеза18.
Совсем недавно были разработаны инструменты, которые позволяют редактирования сложных генома. Эти инструменты включают транскрипции Activator-Like эффектор Nucleases (TALEN) и ТРИФОСФАТЫ/Cas9-нуклеиназы системы19,20. Преимуществом этих новых инструментов является, что они предлагают исследователям возможность побудить двуцепочечной ДНК перерыв в практически в любом месте в течение почти любой генома. После индуцированного, эти перерывы могут быть отремонтированы, не гомологичных концах прихода, который можно ввести, удаления или вставки в целевых генов, или через ориентированные на гомологии ремонт, который в присутствии инженерных конструкции, могут катализировать Замена всего генов или генетических регионах21,22. Однако эти методы требуют микроинъекции ДНК, РНК и белков в очень молодых эмбрионов.
Важно отметить, что в отличие от двуцепочечных РНК, используемые для RNAi, нуклеиновых кислот и белков, используемые для микрофлорой преобразования и изменения генома не может пересекать легко клеточных мембран. Таким образом микроинъекции плазмида ДНК, мРНК и/или белки должны осуществляться на этапе-синцитиальный бластодермы (т.е. до cellularizes насекомых эмбриона). Это делает время инъекции решающим фактором. Например в Drosophila melanogaster, эмбрионы должны вводиться в течение двух часов после того, как яйца откладывают12. Таким образом Разработка успешной эмбриональных микроинъекции протокола для WCR должны учитывать наилучшие условия для женщин яиц, а также лучший метод для сбора достаточного количества precellular эмбрионов.
Попытка привлечь широкий спектр молекулярных генетических инструменты на WCR биологии требует разработка методов для сбора и microinjecting precellular WCR эмбрионов. Здесь мы предоставляем подробные инструкции, наряду с советы и уловки, чтобы помочь другим использовать методы на основе преобразования в ВЦС исследования. Помимо предоставления WCR трансгенные технологии для использования в функциональных геномных исследований, эти методы также позволяют мощных новых стратегий управления вредителей как ген диск23,24 должны быть опробованы в этом экономически важных Пешт.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1155">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Qualitative Filter Paper (Black)</td>
			<td style="width:189px;">Ahlstrom</td>
			<td style="width:287px;">8613-0900</td>
			<td style="width:339px;">For egg microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 oz Containers&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Anny&#39;s Plastic Tableware</td>
			<td>ASET101</td>
			<td>Egg container</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drosophila Agar Type II</td>
			<td style="width:189px;">Apex</td>
			<td style="width:287px;">66-103</td>
			<td>Substrate for WCR egg-laying dish</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Featherweight Forceps&#160;</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td style="width:287px;">4748</td>
			<td>Handling larvae and pupae&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clorox Regular-Bleach1</td>
			<td style="width:189px;">Clorox</td>
			<td style="width:287px;">44600-30770</td>
			<td>Wash corn and dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trucker&#39;s Favorite Yellow</td>
			<td>Coor Farm Supply</td>
			<td>502</td>
			<td>Corn for feeding WCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Microinjection System (Homemade)</td>
			<td style="width:189px;">NA</td>
			<td style="width:287px;">Parts &#38; instructions available upon request</td>
			<td>Controls injection pressure (0-20 psi)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Elmer&#39;s Non-toxic Glue</td>
			<td>Elmer&#39;s Products, Inc.</td>
			<td style="width:287px;">E304</td>
			<td>Glue eggs on filter paper</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">epTIPS Microloader Tips</td>
			<td style="width:189px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:287px;">C2554691</td>
			<td>Backfilling needle loading tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Tissue Culture Dishes</td>
			<td style="width:189px;">Falcon</td>
			<td>25383-103</td>
			<td>Sprouting corn /150 x 25 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fisherbrand&#160;Quantitative-Grade Filter Paper Circles</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td>S47576C</td>
			<td>Making agar dish for egg-lay/9cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sparkleen</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:287px;">04-320-4</td>
			<td>Wash dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Plain Microscope Slides</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:287px;">12-549-3</td>
			<td>Holding filter paper and eggs for microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Western Corn Rootworm w/o Pollen Substitute</td>
			<td style="width:189px;">Frontier Agricultural Sciences&#160;</td>
			<td>F9766B</td>
			<td>WCR adult artificial diet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cotton Balls, Large</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>51-101</td>
			<td>Close the flask</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Globe Scientific 3.0 mL Small Bulb Transfer Pipettes</td>
			<td>Globe Scientific</td>
			<td>137035</td>
			<td>Collect and transfer eggs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Leica</td>
			<td>M165 FC&#160;</td>
			<td>WCR screening</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DsRed Filter Set for Fluorescence Stereomicroscope</td>
			<td style="width:189px;">Leica</td>
			<td>DSR</td>
			<td>Excitation filter: 510-560 nm, emission filter: 590-650 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGFP filter</td>
			<td style="width:189px;">Leica</td>
			<td>GFP2</td>
			<td>Excitation filter: 440&#8211;520 nm, emission filter: 510 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BugDorm</td>
			<td>MegaView Science</td>
			<td>DP1000_5P</td>
			<td>Cage for adult colony</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Miniature Paint Brush</td>
			<td style="width:189px;">MyArtscape</td>
			<td>MAS-102-MINI</td>
			<td>Liner 2/0&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Joystick Micromanipulator</td>
			<td style="width:189px;">Narishige</td>
			<td style="width:287px;">MN-151</td>
			<td>Micromanipulator and needle holder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">Microscope XY Stage</td>
			<td style="width:189px;">Olympus</td>
			<td style="width:287px;">265515</td>
			<td style="width:339px;">Microscope stage (adapted for use with stereoscope)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Grade 90 Cheesecloth</td>
			<td style="width:189px;">Online Fabric Store</td>
			<td>CHEE90</td>
			<td>For egg-lay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic paraffin film&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td>PM-996</td>
			<td>Seal agar dish after microinjection/Roll size 4 in. x 125 ft</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Percival Incubator</td>
			<td style="width:189px;">Percival&#160;</td>
			<td style="width:287px;">I41VLH3C8</td>
			<td>WCR growing chamber (insect rearing incubator)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Narrow Mouth Erlenmeyer Flasks</td>
			<td style="width:189px;">VWR</td>
			<td>4980-300-PK</td>
			<td>Water container for adult colony&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Griffin Low Form Beakers</td>
			<td style="width:189px;">VWR</td>
			<td>1000-600-PK</td>
			<td>For egg wash</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Braided Cotton Rolls</td>
			<td>Richmond Dental Cotton Co.</td>
			<td>605-3599</td>
			<td>Use in water supply for adult colony&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri Dishes (35x10mm)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>CLS430588-500EA</td>
			<td>For diet plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:287px;">143-78-8</td>
			<td>Microinjection buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laser-based Micropipiette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-2000/G</td>
			<td>Needle puller/Heat = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Premium Topsoil</td>
			<td>The Scotts Company</td>
			<td style="width:287px;">71130758</td>
			<td>Soil for cron growing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reloc Zippit 2 Mil Zipper Bags</td>
			<td>United States Plastic Corporation</td>
			<td>48342</td>
			<td>Bag agar dish after microinjection/5x7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri Dishes (100x15m)</td>
			<td style="width:189px;">VWR</td>
			<td style="width:287px;">89038-968</td>
			<td>Making agar dish for egg-lay/ 100 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6 oz Containers</td>
			<td style="width:189px;">Webstaurantstore</td>
			<td>128E506</td>
			<td>WCR single pair mating chamber&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">38 oz Containers</td>
			<td style="width:189px;">Webstaurantstore</td>
			<td>128NC888</td>
			<td>Larvae rearing box/38 oz</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ChoiceHD 16 oz. Microwavable Translucent Plastic Deli Container</td>
			<td style="width:189px;">Webstaurantstore</td>
			<td>128HRD16</td>
			<td>Larvae rearing box/16 oz</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Microinjection Scope&#160;</td>
			<td style="width:189px;">Wild Heerbrugg</td>
			<td style="width:287px;">WILD-M8</td>
			<td style="width:339px;">Microinjection scope outfited with an XY stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Standard Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>Microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">Adult Western Corn Rootworms</td>
			<td style="width:189px;">North Centeral Aqricultural reasearch Laboratory</td>
			<td style="width:287px;">Non-diapase strain</td>
			<td>Request from Dr. Bryan Wade French&#39;s lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Plasmid DNA Midi Kit</td>
			<td style="width:189px;">Qiagen</td>
			<td>12143</td>
			<td>Purification of injection-ready plasmid DNAs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection of western corn rootworm, diabrotica virgifera virgifera, embryos for germline transformation, or crispr/cas9 genome editing

Rootworm Западный кукурузный (WCR) является важным вредителей кукурузы и хорошо известна своей способностью быстро приспосабливаться к стратегиям управления вредителей. Хотя система РНК-интерференции (RNAi) оказалась мощным инструментом для изучения биологии WCR, он имеет свои ограничения. Конкретно, РНК-интерференции, сам является несохраняемым(т.е. не привести к долгосрочной Менделевское наследование связанных фенотип), и он требует, зная последовательность ДНК гена целевого объекта. Последний может иметь ограничения если фенотип интерес контролируется плохо сохраняется, или даже Роман генов, потому что будет сложной задачей выявления полезной цели, если не невозможно. Таким образом количество инструментов WCR в геномной панели инструментов должен быть расширен путем разработки методов, которые могут быть использованы для создания стабильной мутантных штаммов и включения последовательности независимые обследования WCR генома. Здесь мы подробно методы, используемые для сбора и microinject precellular WCR эмбрионов с нуклеиновыми кислотами. В то время как протоколы, описанные здесь, направлены на создание трансгенных WCR, ТРИФОСФАТЫ/Cas9-геном редактирования может также быть выполнена с использованием тех же протоколов, с той лишь разницей, что состав раствора вводят в эмбрионы.

Важным соображением при разработке этого протокола был стадии эмбрионального развития в то время микроинъекции. В частности преобразование микрофлорой требует микроинъекции НОО до эмбриональных cellularization. Это потому, что НОО не может пересекать легко клеточных мембр...

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing at JoVE.com

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Микроинъекции Западной кукуруза Rootworm, под эгидой содействие, эмбрионы для преобразования микрофлорой, или изменения генома ТРИФОСФАТЫ/Cas9

Здесь мы представляем протоколы для сбора и microinjecting precellular Западный кукурузный rootworm эмбрионов для целей выполнения функциональных геномной анализы как микрофлорой преобразования и редактирования ТРИФОСФАТЫ/Cas9-генома.

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Вирусный наночастиц для<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Изображения опухоли

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Микроинъекция раны Анализ и<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Локализация эпидермального ран реагирования журналистам в<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Эмбрионы.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Гидрогель наночастиц Заготовка плазмы или мочи для обнаружения Низкие Белки изобилии

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Эффективное создание и редактирование фидер свободный IPSCs от человеческих клеток поджелудочной железы, с использованием системы ТРИФОСФАТЫ Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

Производство генетически Золотой сирийских хомяков Pronuclear инъекции комплекса ТРИФОСФАТЫ/Cas9

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis

Долговечный чтения последовательности для анализа всей геномной ДНК

Third generation single-molecule DNA sequencing technologies offer significantly longer read length that can facilitate the assembly of complex genomes ...

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a Multiplex Геном Редактирование Saccharomyces cerevisiae и создание дрожжевого искусства пикселей

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...

Measuring the Spin-Lattice Relaxation Magnetic Field Dependence of Hyperpolarized [1-13C]pyruvate

Measuring the Spin-Lattice Relaxation Magnetic Field Dependence of Hyperpolarized [1-13C]pyruvate

Измерение спин-латеттической релаксации Магнитное поле зависимость гиперполяризованных No 1-13C pyruvate

The fundamental limit to in vivo imaging applications of hyperpolarized 13C-enriched compounds is their finite spin-lattice relaxation times. Various ...

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Микроинъекция кукурузного сеялки, Peregrinus maidis, эмбрионов для редактирования генома CRISPR/Cas9

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the ...

Liquid Chromatography Coupled to Refractive Index or Mass Spectrometric Detection for Metabolite Profiling in Lysate-based Cell-free Systems

Жидкостная хроматография в сочетании с показателем преломления или масс-спектрометрическим обнаружением для профилирования метаболитов в бесклеточных системах на основе лизата

Engineering cellular metabolism for targeted biosynthesis can require extensive design-build-test-learn (DBTL) cycles as the engineer works around the ...