Name: use of two dimensional semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis to confirm size heterogeneity of amyloid or amyloid-like fibers
Uploaded: 2018-04-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers at JoVE.com

Dette arbejde støttes af et stipendium for S.H.-A. fra NIH/NCATS (TL1TR001104), en Welch Foundation giver (I-1827) og et R01 tilskud fra NIGMS (RGM120502A) til Z.W. Z.W. er Virginia Murchison Linthicum Scholar i medicinalforskning og forebyggelse af kræft og Research Institute af Texas Scholar (R1222).

1. forberede prøverne
<ol><li>Kultur 2 x 106 amyloid producerer HT-29 tyktarmskræft celler i en 10-cm vævskultur parabol i 10 mL af Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) som indeholder 10% føtal bovint serum og penicillin-streptomycin. Kultur celler natten over i et 37 ° C kuvøse med 5% CO2.<ol>
<li>Efter cellerne vokser til 80% confluency, vaske cellerne med 10 mL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Tilsættes 3 mL Trypsin og inkuberes ved 37 ° C i 3 min.</li>
		<li>Når cellerne ...

<ol>
	<li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease.">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature medicine. 10, 10-17 (2004).</li><li>Hou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAVS+forms+functional+prion-like+aggregates+to+activate+and+propagate+antiviral+innate+immune+response.">MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response.</a> Cell. 146, 448-461 (2011).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIP1/RIP3+necrosome+forms+a+functional+amyloid+signaling+complex+required+for+programmed+necrosis.">The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis.</a> Cell. 150, 339-350 (2012).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLKL+forms+disulfide+bond-dependent+amyloid-like+polymers+to+induce+necroptosis.">MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 7450-7459 (2017).</li><li>Uptain, S. M., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prions+as+protein-based+genetic+elements.">Prions as protein-based genetic elements.</a> Annual review of microbiology. 56, 703-741 (2002).</li><li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis.">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Sipe, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nomenclature+2014:+Amyloid+fibril+proteins+and+clinical+classification+of+the+amyloidosis.">Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis.</a> Amyloid : the international journal of experimental and clinical investigation : the official journal of the International Society of Amyloidosis. 21, 221-224 (2014).</li><li>Eisenberg, D. S., Sawaya, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Studies+of+Amyloid+Proteins+at+the+Molecular+Level.">Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level.</a> Annual review of biochemistry. 86, 69-95 (2017).</li><li>Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+mediates+necrosis+signaling+downstream+of+RIP3+kinase.">Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase.</a> Cell. 148, 213-227 (2012).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+interacting+protein+kinase-3+determines+cellular+necrotic+response+to+TNF-alpha.">Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha.</a> Cell. 137, 1100-1111 (2009).</li></ol>

Det mest kritiske aspekt af de 2D SDD-alder er at de elektroforese betingelser er de samme for den første og anden dimension. Evnen til at opdage en skarp diagonal linje på 45° (der angiver, at ingen dissociation eller nedbrydning er opstået) afhænger af fibrene migrere Ansoegningsformularen under begge electrophoreses. Ved hjælp af forskellige betingelser, for eksempel ændre spændingen eller længden på kørselstidspunktet, vil skjule disse resultater. Også, som det er tilfældet for traditionelle 1D SDD-alder...

Dannelsen af amyloid fibre på grund af protein misfoldning har længe været kendt at spille en rolle i patologiske tilstande som Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom og Huntingtons sygdom1. Senere, dannelsen af amyloid eller amyloid-lignende fibre har vist sig at være en del af signaling veje hos mennesker, herunder under anti-viral medfødte immunrespons2 og necroptosis3,4, og i lavere organismer som gær5,6. Derfor, evnen til at opdage disse fibre i laboratoriet er vigtigt. I øjeblikket, er der tre måder at opdage amyloid og amyloid-lignende fibre: brugen af farvestoffer, EM og SDD-alder.
Brugen af farvestoffer, som Congo rød eller Thioflavin T, tilbyder fordelen at være hurtig og let kan påvises ved hjælp af enten mikroskopi eller spektroskopi7. Påvisning af mikroskopi, i tilfælde af Congo rød, giver imidlertid ingen specificitet som proteiner består af fibrene, eller størrelsen af fibrene. Ligeledes giver brugen af spektroskopi til at opdage Congo rød eller Thioflavin T binding til proteinkomplekser kun et positivt eller negativt resultat.
EM giver afgørende beviser for tilstedeværelsen af fibre og ligeledes kvantitative oplysninger om fiber længde og diameter8. Denne metode kræver imidlertid meget strenge rensning. Derudover er EM en specialiseret teknik, der bruger dyrt udstyr.
SDD-alder er blevet brugt til at registrere SDS-resistente mega Dalton proteinkomplekser herunder amyloid eller amyloid-lignende fibre. Det giver mange fordele. Først, det kræver ikke rensning af fibre og er let at peform9. For det andet giver det kvalitative oplysninger om størrelsen af de fibre, herunder relative størrelse og mængde af fiber heterogenicity. Endelig fordi Western blotting kan udføres efter elektroforese, er det let at påvise tilstedeværelsen af et protein, der er et antistof, selvom det skal bemærkes, at fordi SDD-alder er semi-denaturering, nogle epitoper kan forblive skjult som komplicerer påvisning af antistof.
For nylig, receptor interagerende protein kinase 1 (RIPK1) og 3 (RIPK3) er blevet rapporteret til form amyloid fibre til at tjene som signalering platforme under necroptosis, en programmeret form af nekrose3. Mens de studerer disse fibre, viste vores lab, at en anden necroptosis-forbundet protein, blandet lineage kinase domæne-lignende (MLKL), også dannet amyloid-lignende fibre4. Men efter undersøgelse med SDD-alder, størrelsen af MLKL fibrene syntes adskiller sig fra den RIPK1 og RIPK3 fibre, der syntes identisk med hinanden (figur 1). Dette var uventet, fordi det er velkendt, at MLKL binder sig til RIPK1/RIPK3 til at danne den necroptosis signalering komplekse kaldet necrosome10.
Der er mindst to forklaringer. Første to helt adskilte amyloid-lignende fibre kan danne under necroptosis, en indeholdende RIPK1/RIPK3 og de andre indeholder MLKL. For det andet er kun én type af amyloid-lignende fibre indeholdende RIPK1/RIPK3/MLKL kan dannes under necroptosis, men sammenslutningen af MLKL med de andre proteiner svage nok, som det tager under SDD-alder.
For at løse dette, foreslår vi udfører et todimensionelt (2D) SDD-alder. SDD-alder-stabil amyloid eller amyloid-lignende fibre vil have den samme migration mønster under første og anden dimension elektroforese. Dette vil kunne påvises efter overførsel af proteiner på en membran og udfører en vestlige skamplet. Stabil fibre vil udstille en skarp diagonal mønster. Enhver afvigelse fra dette tyder på, at fibrene undergå ændringer som følge af SDS-elektroforese.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >gel electrophoresis unit</td>
			<td >Fisher</td>
			<td >HE99XPRO</td>
			<td >appratus for gel running.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >agrose</td>
			<td >VWR</td>
			<td >97062-250</td>
			<td>For agarose gel.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >paper tower</td>
			<td >Fisher</td>
			<td >19-120-2484</td>
			<td>for transfering</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >filter paper</td>
			<td >VWR</td>
			<td >21427-386</td>
			<td>for transfering</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PVDF membrane</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >162-0177</td>
			<td>for transfering</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >blocking milk powder</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1706404XTU</td>
			<td>for blocking in Western blot</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MLKL antibody</td>
			<td >Genetex</td>
			<td >GTX107538</td>
			<td>rabbit anti-MLKL antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RIPK1 antibody</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >610459</td>
			<td>mouse anti-RIPK1 antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RIPK3 antibody</td>
			<td >gift from Dr. Xiaodong Wang</td>
			<td ></td>
			<td>rabbit anti-RIPK3. See refenence 11.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-Rabbit-HRP</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A6154</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECL</td>
			<td >Fisher</td>
			<td >WBKLS0500</td>
			<td>Western chemiluminescent HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >X-ray film</td>
			<td >Fisher</td>
			<td >F-BX810</td>
			<td>for Western blot result</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D6429</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >fetal bovine serum</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >F4135</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >penicilin-streptomycin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P4333</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin solution</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T4049</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS for tissue culture</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D8662</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >recombinant TNF</td>
			<td >made in our lab</td>
			<td ></td>
			<td>for inducing necroptosis. See reference 11.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >smac-mimetic</td>
			<td >gift from Dr. Xiaodong Wang</td>
			<td ></td>
			<td>for inducing necroptosis. See reference 11.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ZVAD-FMK</td>
			<td >ApexBio</td>
			<td >A1902</td>
			<td>for inducing necroptosis. See reference 11.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Counter</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td>1450102</td>
			<td>Model TC20; for counting cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pierce&#8482; BCA Protein Assay Kit</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >23225</td>
			<td>for measuring protein concentration in cell lysates</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell lifter</td>
			<td >Fisher</td>
			<td >07-200-364</td>
			<td>to remove cells from dish</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lysis Buffer (1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td >20 mL 1 M Tris pH 7.4 
			10 mL glycerol 
			30 mL 5 M NaCl 
			840 mL ddH2O 
			10 mL Triton-X100 
			(protease and phosphates inhibitors as desired)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10X TAE (1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td >48.4 g Tris base 
			11.42 mL glacial acetic acid 
			20 mL 0.5M EDTA pH 8 
			ddH20 to 1 L</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4X SDD-AGE loading buffer (50 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td >5 mL 10X TAE 
			10 mL glycerol 
			4 mL 20% SDS 
			0.5 mL 10% bromophenol blue 
			31 mL ddH2O</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TBS Transfer Buffer (1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td >20 mL 1 M Tris pH 7.4 
			30 mL 5 M NaCl 
			950 mL ddH2O</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBST Wash Buffer (1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td >100 mL 10xPBS 
			800 mL ddH2O 
			1 mL Tween20</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10X PBS (10 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td >800 g NaCl 
			20 g KCl 
			144 g Na2HPO4&#183;2H2O 
			24 g KH2PO4 
			add ddH2O to 10 L</td>
		</tr>
		</tbody>
</table>

use of two dimensional semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis to confirm size heterogeneity of amyloid or amyloid-like fibers

Amyloid eller amyloid-lignende fibre har været forbundet med mange menneskelige sygdomme, og nu bliver opdaget at være vigtig for mange signaling veje. Evnen til at let påvise dannelsen af disse fibre under forskellige forsøgsbetingelser er afgørende for at forstå deres potentielle funktion. Mange metoder har været anvendt til at opdage fibre, men ikke uden ulemper. For eksempel, kræver elektronmikroskopi (EM) eller farvning med Congo rød eller Thioflavin T ofte rensning af fibrene. På den anden side tillader semi-denaturering vaskemiddel Agarosen gelelektroforese (SDD-alder) detektering af SDS-resistente amyloid-lignende fibre i celle ekstrakter uden rensning. Desuden, det giver mulighed for sammenligning af størrelse forskellen af fibre. Vigtigere er, kan det bruges til at identificere specifikke proteiner i fibrene af Western blotting. Det er mindre tidskrævende og mere let tilgængelige for en bredere række labs. SDD-alder resultater viser ofte variable graden af heterogenitet. Det rejser spørgsmålet om en del af heterogenitet resultater fra dissociation af protein kompleks under elektroforese i overværelse af SDS. Derfor har vi ansat en anden dimension af SDD-alder til at bestemme, hvis størrelse heterogenitet set i SDD-alder er virkelig et resultat af fiber heterogenitet i vivo og ikke et resultat af enten nedbrydning eller dissociation af nogle af proteinerne under elektroforese. Denne metode giver mulighed for hurtig, kvalitativ bekræftelse af, at den amyloid eller amyloid-lignende fibre ikke delvis adskilles under SDD-alder-processen.

Efter necroptosis induktion viste RIPK1 og RIPK3 næsten identisk amyloid-lignende mønstre (baner 2 og 4, figur 1). Dog MLKL fibre blev mere heterogene og syntes at være mindre end RIPK1/RIPK3 fibre (lane 6, figur 1). Der foranledigede os til at udvikle metoden 2D SDD-alder for at behandle muligheden om MLKL danner RIPK1/RIPK3-uafhængige fibre eller MLKL blot tager fra de store RIPK1/RIPK3/MLKL fibre under SDD-alder.
<p cl...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers at JoVE.com

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

Brugen af to-dimensionelle semi-denaturering vaskemiddel Agarosen gelelektroforese at bekræfte størrelse heterogenitet af Amyloid eller Amyloid-lignende fibre

Her bruger vi to-dimensionelle semi-denaturering Agarosen gelelektroforese at bekræfte tilstedeværelsen af amyloid-lignende fibre af heterogene størrelse og udelukke muligheden for, at størrelse heterogenitet skyldes dissociation af amyloid fibre under gel kørende proces.

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

Karakterisering af Multi-subunit proteinkomplekser af menneskelig MxA Brug ikke-denaturering Polyacrylamid Gel-elektroforese

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for Analysen af<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -threonylcarbamoyladenosin TcdA-funktion

We demonstrate methods for the expression and purification of tRNA(UUU) in Escherichia coli and the analysis by gel retardation assays of the binding of ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Analyse af superkomplekser af den mitokondrieelektron transportkæde med indfødte elektroforese, in-gel analyser og elektrolysering

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

Berigelse af Detergent-uopløselige Protein aggregater fra Postmortem menneskehjerne

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Horisontal gelelektroforese til forbedret påvisning af protein-RNA-komplekser

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

DNA Polymerase aktivitet Assay ved hjælp af nær-infrarødt fluorescerende mærket DNA visualiseret af acrylamid Gel elektroforese

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Påvisning af vaskemiddel-følsomme interaktioner mellem Membranproteiner

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

Analyse af AtHIRD11 iboende lidelse og bindende mod metalioner af kapillar gelelektroforese og affinitet kapillær elektroforese

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Analyse af tylakoid membran proteinkomplekser af blå indfødte gelelektroforese

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Brug af rekombinant Fusion proteiner i et fluorescerende Protease Assay Platform og deres i-gel genopretning

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...