Name: use of two dimensional semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis to confirm size heterogeneity of amyloid or amyloid-like fibers
Uploaded: 2018-04-26T14:30:00
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Este trabajo es apoyado por una beca para la S.H.-A. de NIH/NCATS (TL1TR001104), una Fundación de Welch conceder (I-1827) y una subvención R01 de NIGMS (RGM120502A) a Z.W. Z.W. es el Virginia Murchison Linthicum erudito en investigación médica y la prevención del cáncer e Instituto de investigación de Texas erudito (R1222).

1. preparar las muestras
<ol><li>Amiloide de cultura 2 x 106 produciendo las células de cáncer de colon HT-29 en un plato de cultivo de tejidos de 10 cm en 10 mL de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) con suero bovino fetal 10% y penicilina-estreptomicina. Las células de cultivos durante la noche en una incubadora de 37 ° C con 5% CO2.<ol>
<li>Después de que las células crecen al 80% de confluencia, lavan las células con 10 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Añadir 3 m...

<ol>
	<li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease.">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature medicine. 10, 10-17 (2004).</li><li>Hou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAVS+forms+functional+prion-like+aggregates+to+activate+and+propagate+antiviral+innate+immune+response.">MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response.</a> Cell. 146, 448-461 (2011).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIP1/RIP3+necrosome+forms+a+functional+amyloid+signaling+complex+required+for+programmed+necrosis.">The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis.</a> Cell. 150, 339-350 (2012).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLKL+forms+disulfide+bond-dependent+amyloid-like+polymers+to+induce+necroptosis.">MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 7450-7459 (2017).</li><li>Uptain, S. M., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prions+as+protein-based+genetic+elements.">Prions as protein-based genetic elements.</a> Annual review of microbiology. 56, 703-741 (2002).</li><li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis.">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Sipe, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nomenclature+2014:+Amyloid+fibril+proteins+and+clinical+classification+of+the+amyloidosis.">Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis.</a> Amyloid : the international journal of experimental and clinical investigation : the official journal of the International Society of Amyloidosis. 21, 221-224 (2014).</li><li>Eisenberg, D. S., Sawaya, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Studies+of+Amyloid+Proteins+at+the+Molecular+Level.">Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level.</a> Annual review of biochemistry. 86, 69-95 (2017).</li><li>Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+mediates+necrosis+signaling+downstream+of+RIP3+kinase.">Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase.</a> Cell. 148, 213-227 (2012).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+interacting+protein+kinase-3+determines+cellular+necrotic+response+to+TNF-alpha.">Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha.</a> Cell. 137, 1100-1111 (2009).</li></ol>

El aspecto más crítico de la SDD-edad 2D es que las condiciones de electroforesis son las mismas para la primera y la segunda dimensión. La capacidad para detectar una fuerte línea diagonal a 45° (lo que indica que no se ha producido ninguna disociación o degradación) depende de las fibras de migrar de manera idéntica durante electroforesis. Usando diferentes condiciones, por ejemplo cambiando la tensión o la longitud de tiempo de ejecución, se oscurecen estos resultados. También, como es el caso de tradiciona...

La formación de fibras amiloides debido a mal plegamiento de proteínas ha sido conocida para jugar un papel en condiciones patológicas como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Huntington1. Más recientemente, la formación de fibras amiloides o amiloide-como se ha demostrado que una parte de vías de señalización en los seres humanos, incluyendo durante la respuesta inmune innata antiviral2 y necroptosis3,4y en organismos inferiores como levadura5,6. Por lo tanto, la capacidad para detectar estas fibras en el laboratorio es importante. Actualmente, hay tres maneras principales para detectar amiloide y las fibras de amiloide-como: el uso de tintes, EM y SDD-edad.
El uso de tintes, como el rojo Congo o tioflavina T, ofrece la ventaja de ser rápida y fácilmente detectable mediante microscopía o espectroscopia7. Sin embargo, la detección por microscopía, en el caso de Congo rojo, proporciona ninguna especificidad acerca de que las proteínas constituyen las fibras, o el tamaño de las fibras. Del mismo modo, el uso de la espectroscopia para detectar rojo Congo o Thioflavin T Unión a complejos de proteínas proporciona sólo un resultado positivo o negativo.
EM proporciona pruebas concluyentes de la presencia de fibras y también información cuantitativa acerca de la fibra longitud y diámetro8. Sin embargo, este método requiere purificación muy estricta. Además, la EM es una técnica especializada que utiliza el equipo costoso.
SDD-edad se ha utilizado para detectar resistente SDS mega Dalton complejos incluyendo las fibras de amiloide o amiloide-como. Ofrece muchas ventajas. En primer lugar, no requiere la purificación de las fibras y es fácil de realizar9. En segundo lugar, proporciona información cualitativa sobre el tamaño de las fibras, como el tamaño relativo y la cantidad de heterogenicidad de la fibra. Por último, porque el borrar occidental puede realizarse después de la electroforesis, es fácil de detectar la presencia de cualquier proteína que se encuentra un anticuerpo, aunque cabe señalar que debido a SDD-edad es semi-desnaturalización, algunos epitopos pueden permanecer oculto que complica la detección de anticuerpos.
Recientemente, receptor interacción proteína quinasa 1 (RIPK1) y 3 (RIPK3) se han divulgado para formar fibras amiloides para servir como plataformas de señalización durante la necroptosis, forma programada de necrosis3. Mientras que de estudiar estas fibras, nuestro laboratorio demostró que otra proteína asociada a la necroptosis, mezclado quinasa de linaje como dominio (MLKL), también forma las fibras de amiloide-como4. Sin embargo, en el examen con SDD-edad, el tamaño de las fibras MLKL apareció distinto de las fibras RIPK1 y RIPK3, que parecían idénticas entre sí (figura 1). Esto fue inesperado porque es bien sabido que MLKL se une a RIPK1/RIPK3 para formar la necroptosis señalización complejo llamado el necrosome10.
Hay al menos dos explicaciones. En primer lugar, dos fibras de amiloide-como totalmente distintas pueden formar durante la necroptosis, RIPK1/RIPK3 con uno y el otro MLKL que contiene. En segundo lugar, sólo un tipo de amiloide-como las fibras que contienen RIPK1/RIPK3/MLKL pueden formarse durante la necroptosis, pero la Asociación de MLKL con otras proteínas es débil lo suficiente que disocia en SDD-edad.
Para hacer frente a esto, proponemos realizar una edad SDD bidimensional (2D). SDD-edad-stable amiloide o fibras de amiloide-como tienen el mismo patrón de migración durante la electroforesis de la primera y la segunda dimensión. Esta será detectable después de la transferencia de las proteínas a una membrana y realizar un Western blot. Fibras estables exhiben un patrón diagonal fuerte. Cualquier desviación de esto sugeriría que las fibras se someten a cambios debido a la electroforesis de SDS.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >gel electrophoresis unit</td>
			<td >Fisher</td>
			<td >HE99XPRO</td>
			<td >appratus for gel running.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >agrose</td>
			<td >VWR</td>
			<td >97062-250</td>
			<td>For agarose gel.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >paper tower</td>
			<td >Fisher</td>
			<td >19-120-2484</td>
			<td>for transfering</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >filter paper</td>
			<td >VWR</td>
			<td >21427-386</td>
			<td>for transfering</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PVDF membrane</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >162-0177</td>
			<td>for transfering</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >blocking milk powder</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1706404XTU</td>
			<td>for blocking in Western blot</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MLKL antibody</td>
			<td >Genetex</td>
			<td >GTX107538</td>
			<td>rabbit anti-MLKL antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RIPK1 antibody</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >610459</td>
			<td>mouse anti-RIPK1 antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RIPK3 antibody</td>
			<td >gift from Dr. Xiaodong Wang</td>
			<td ></td>
			<td>rabbit anti-RIPK3. See refenence 11.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-Rabbit-HRP</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A6154</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECL</td>
			<td >Fisher</td>
			<td >WBKLS0500</td>
			<td>Western chemiluminescent HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >X-ray film</td>
			<td >Fisher</td>
			<td >F-BX810</td>
			<td>for Western blot result</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D6429</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >fetal bovine serum</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >F4135</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >penicilin-streptomycin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P4333</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin solution</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T4049</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS for tissue culture</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D8662</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >recombinant TNF</td>
			<td >made in our lab</td>
			<td ></td>
			<td>for inducing necroptosis. See reference 11.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >smac-mimetic</td>
			<td >gift from Dr. Xiaodong Wang</td>
			<td ></td>
			<td>for inducing necroptosis. See reference 11.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ZVAD-FMK</td>
			<td >ApexBio</td>
			<td >A1902</td>
			<td>for inducing necroptosis. See reference 11.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Counter</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td>1450102</td>
			<td>Model TC20; for counting cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pierce&#8482; BCA Protein Assay Kit</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >23225</td>
			<td>for measuring protein concentration in cell lysates</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell lifter</td>
			<td >Fisher</td>
			<td >07-200-364</td>
			<td>to remove cells from dish</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lysis Buffer (1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td >20 mL 1 M Tris pH 7.4 
			10 mL glycerol 
			30 mL 5 M NaCl 
			840 mL ddH2O 
			10 mL Triton-X100 
			(protease and phosphates inhibitors as desired)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10X TAE (1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td >48.4 g Tris base 
			11.42 mL glacial acetic acid 
			20 mL 0.5M EDTA pH 8 
			ddH20 to 1 L</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4X SDD-AGE loading buffer (50 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td >5 mL 10X TAE 
			10 mL glycerol 
			4 mL 20% SDS 
			0.5 mL 10% bromophenol blue 
			31 mL ddH2O</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TBS Transfer Buffer (1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td >20 mL 1 M Tris pH 7.4 
			30 mL 5 M NaCl 
			950 mL ddH2O</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBST Wash Buffer (1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td >100 mL 10xPBS 
			800 mL ddH2O 
			1 mL Tween20</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10X PBS (10 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td >800 g NaCl 
			20 g KCl 
			144 g Na2HPO4&#183;2H2O 
			24 g KH2PO4 
			add ddH2O to 10 L</td>
		</tr>
		</tbody>
</table>

use of two dimensional semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis to confirm size heterogeneity of amyloid or amyloid-like fibers

Fibras amiloides o amiloide-como han sido asociadas con muchas enfermedades humanas y ahora se están descubriendo importantes para muchas vías de señalización. La capacidad de detectar fácilmente la formación de estas fibras en diferentes condiciones experimentales es esencial para la comprensión de su función potencial. Muchos métodos se han utilizado para detectar las fibras, pero no sin algunos inconvenientes. Por ejemplo, microscopía electrónica (EM), o tinción con rojo Congo o Thioflavin T a menudo requiere purificación de las fibras. Por otra parte, la electroforesis en gel de agarosa detergente la desnaturalización (SDD-edad) permite la detección de las fibras de amiloide-como SDS-resistente en los extractos de célula sin purificación. Además, permite la comparación de la diferencia de tamaño de las fibras. Más importante aún, puede utilizarse para identificar proteínas específicas dentro de las fibras por borrar occidental. Es mucho menos tiempo y más fácilmente accesible a un mayor número de laboratorios. SDD-edad resultados a menudo muestran grados variables de heterogeneidad. Plantea la pregunta de si parte de la heterogeneidad resulta de la disociación de la proteína del compleja durante la electroforesis en presencia de SDS. Por esta razón, hemos empleado una segunda dimensión de SDD-edad para determinar si la heterogeneidad de tamaño vista en SDD-edad es realmente consecuencia de la heterogeneidad de fibra en vivo y no un resultado de la degradación o la disociación de algunas de las proteínas durante el electroforesis. Este método permite la confirmación rápida y cualitativa que las fibras de amiloide o amiloide-como no están disociando parcialmente durante el proceso de SDD-edad.

Después de la inducción de la necroptosis, RIPK1 y RIPK3 mostraron patrones de amiloide-como casi idénticos (carriles 2 y 4, figura 1). Sin embargo, las fibras MLKL fueron más heterogéneas y parecen ser más pequeño que las fibras RIPK1/RIPK3 (carril 6, figura 1). Nos impulsó a desarrollar el método SDD-edad 2D para hacer frente a la posibilidad o MLKL forma fibras RIPK1/RIPK3-independiente MLKL simplemente se disocia de ...

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Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

Uso de dos electroforesis del Gel de la agarosa detergente semi desnaturalización Dimensional para confirmar la heterogeneidad de tamaño de las fibras amiloides o amiloide-como

Aquí utilizamos electroforesis en agarosa semi desnaturalización bidimensional para confirmar la presencia de fibras de amiloide como de tamaño heterogéneo y excluir la posibilidad de que la heterogeneidad de tamaño es debido a la disociación de las fibras amiloides en el gel proceso en ejecución.

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

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