Name: use of two dimensional semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis to confirm size heterogeneity of amyloid or amyloid-like fibers
Uploaded: 2018-04-26T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers at JoVE.com

Bu eser için bir arkadaş grubu tarafından desteklenen S.H.-A. NIH/NCATS (TL1TR001104), Welch Vakfı Hibe (I-1827) ve NIGMS (RGM120502A) Z.W. Z.W. bir R01 hibe'tıbbi araştırma ve kanser önleme ve Texas akademik ve Araştırma Enstitüsü (R1222) Virginia Murchison Linthicum uzman olduğunu.

1. hazırlayın örnekleri
<ol><li>Kültür 2 x 106 amiloid HT-29 kolon kanser hücrelerinin 10 ml, Dulbecco'nın modifiye kartal orta (% 10 fetal sığır serum ve penisilin-streptomisin içeren DMEM) 10 cm doku kültürü tabak içinde üreten. Kültür hücreleri 37 ° C kuluçka %5 CO2gece.<ol>
<li>Sonra % 80 confluency için hücrelerin büyümesine, fosfat tamponlu tuz (PBS) 10 mL hücrelerle yıka. 3 mL tripsin çözeltisi ekleyin ve 3 dk 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>Hücreleri yemek t...

<ol>
	<li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease.">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature medicine. 10, 10-17 (2004).</li><li>Hou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAVS+forms+functional+prion-like+aggregates+to+activate+and+propagate+antiviral+innate+immune+response.">MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response.</a> Cell. 146, 448-461 (2011).</li><li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIP1/RIP3+necrosome+forms+a+functional+amyloid+signaling+complex+required+for+programmed+necrosis.">The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis.</a> Cell. 150, 339-350 (2012).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MLKL+forms+disulfide+bond-dependent+amyloid-like+polymers+to+induce+necroptosis.">MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 7450-7459 (2017).</li><li>Uptain, S. M., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prions+as+protein-based+genetic+elements.">Prions as protein-based genetic elements.</a> Annual review of microbiology. 56, 703-741 (2002).</li><li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis.">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Sipe, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nomenclature+2014:+Amyloid+fibril+proteins+and+clinical+classification+of+the+amyloidosis.">Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis.</a> Amyloid : the international journal of experimental and clinical investigation : the official journal of the International Society of Amyloidosis. 21, 221-224 (2014).</li><li>Eisenberg, D. S., Sawaya, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Studies+of+Amyloid+Proteins+at+the+Molecular+Level.">Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level.</a> Annual review of biochemistry. 86, 69-95 (2017).</li><li>Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).</li><li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+mediates+necrosis+signaling+downstream+of+RIP3+kinase.">Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase.</a> Cell. 148, 213-227 (2012).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+interacting+protein+kinase-3+determines+cellular+necrotic+response+to+TNF-alpha.">Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha.</a> Cell. 137, 1100-1111 (2009).</li></ol>

En önemli bir özelliği, 2D SDD-yaş Elektroforez koşullar birinci ve ikinci boyutu için aynı olmasıdır. Benzer bir şekilde her iki sırasında geçiş lifleri 45 ° (hiçbir ayrılma veya bozulma oluştuğunu gösteren), keskin bir çapraz çizgi bağlıdır algılama yeteneğini electrophoreses. Farklı koşullar, örneğin voltaj veya çalışma süreyi değiştirme kullanarak bu sonuçlar karanlık olacak. Geleneksel 1 D için olduğu gibi bu amiloid ve amiloid benzeri lifleri bozabilir olacaktır Ayrıca, SD...

Protein misfolding nedeniyle amiloid lifleri oluşumu, Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı ve Huntington hastalığı1gibi patolojik koşullarda bir rol oynamaya uzun bilinmektedir. Daha yakın zamanlarda, amiloid veya amiloid benzeri liflerin oluşumu sinyal yolları insanlar Anti-yayılmacı doğuştan gelen bağışıklık yanıtı2 necroptosis3,ve4sırasında dahil olmak üzere ve daha düşük organizmalar bir parçası olmak için gösterilen Maya5,6gibi. Bu nedenle, bu elyaf laboratuarda algılama yeteneğini önemlidir. Şu anda, amiloid ve amiloid benzeri lifler algılamak için üç ana yolu vardır: Boyalar, EM ve SDD-yaş kullanımı.
Boya, Kongo kırmızısı veya Thioflavin T, gibi kullanımı hızlı ve kolayca detectable mikroskopi veya spektroskopisi7kullanarak olmanın avantajı sunuyor. Ancak, mikroskopi, Kongo kırmızısı, söz konusu olduğunda tarafından hangi proteinleri oluşturan lifler veya boyutu lifler, hiçbir özgüllük algılar. Benzer şekilde, Kongo kırmızısı veya Thioflavin T bağlayıcı protein kompleksleri için algılamak için spektroskopisi kullanımı yalnızca bir pozitif veya negatif sonuç sağlar.
EM lifleri ve aynı zamanda lif uzunluğu ve çapı8hakkında kantitatif bilgi varlığının kesin kanıt sağlar. Ancak, bu yöntem çok sıkı arıtma gerektirir. Ayrıca, EM pahalı ekipman kullanan bir özel bir tekniktir.
SDD-yaş SDS dayanıklı mega Dalton protein kompleksleri amiloid veya amiloid benzeri lifler de dahil olmak üzere tespit etmek için kullanılmıştır. Birçok avantaj sunar. İlk olarak, arıtma liflerinin gerektirmez ve peform9için kolaydır. İkinci olarak, göreli boyutu ve fiber heterogenicity miktarı dahil olmak üzere liflerinin boyutu hakkında Nitel bilgi sağlar. Western Blot Elektroforez sonra gerçekleştirilen çünkü son olarak, bu SDD-yaş yarı denaturing olduğu için bazı epitopları hangi gizli kalmasını unutulmamalıdır, ancak kendisi için herhangi bir proteinin bir antikor olduğunu var olup olmadığını belirlemek kolaydır algılama antikor tarafından olmak zordur.
Son zamanlarda, reseptör etkileşen protein kinaz 1 (RIPK1) ve 3 (RIPK3) bildirilmiştir formu amiloid lifleri için platformlar necroptosis sırasında nekroz3programlanmış bir tür sinyal olarak hizmet etmek için. Bu iplikler okurken, bizim laboratuvar lineage kinaz etki alanı gibi (MLKL), karışık başka bir necroptosis ilişkili protein de amiloid benzeri lifler4kurdu gösterdi. Ancak, SDD-yaş ile incelenmesi üzerine, MLKL lifleri boyutunu birbirlerine (şekil 1) aynı çıktı RIPK1 ve RIPK3 lifler farklı çıktı. MLKL necroptosis necrosome10denilen karmaşık sinyal oluşturmak için RIPK1/RIPK3 için bağlar tanınmış olduğundan bu beklenmedik bir şeydi.
En az iki açıklaması vardır. İlk olarak, iki tamamen farklı amiloid benzeri lifler necroptosis sırasında bir içeren RIPK1/RIPK3 ve diğer içeren MLKL şeklinde. İkinci olarak, tek bir içeren RIPK1/RIPK3/MLKL necroptosis ama MLKL ilişkilendirmesiyle diğer proteinler sırasında oluşmuş amiloid benzeri lifler zayıf yeterince SDD-yaş sırasında ayrışıp türüdür.
Bu sorunu çözmek için bir iki boyutlu (2D) SDD yaşından öneriyorum. SDD-yaş-kararlı amiloid veya amiloid benzeri lifler aynı geçiş desen birinci ve ikinci boyut Elektroforez sırasında olacaktır. Bu tespit bir membran proteinleri aktarma ve Western blot taşıma sonra olacak. İstikrarlı elyaf keskin köşegen desen sergileyecek. Bu herhangi bir sapma lifler SDS-Elektroforez nedeniyle değişiklikleri meydana öneririz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >gel electrophoresis unit</td>
			<td >Fisher</td>
			<td >HE99XPRO</td>
			<td >appratus for gel running.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >agrose</td>
			<td >VWR</td>
			<td >97062-250</td>
			<td>For agarose gel.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >paper tower</td>
			<td >Fisher</td>
			<td >19-120-2484</td>
			<td>for transfering</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >filter paper</td>
			<td >VWR</td>
			<td >21427-386</td>
			<td>for transfering</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PVDF membrane</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >162-0177</td>
			<td>for transfering</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >blocking milk powder</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >1706404XTU</td>
			<td>for blocking in Western blot</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MLKL antibody</td>
			<td >Genetex</td>
			<td >GTX107538</td>
			<td>rabbit anti-MLKL antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RIPK1 antibody</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >610459</td>
			<td>mouse anti-RIPK1 antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RIPK3 antibody</td>
			<td >gift from Dr. Xiaodong Wang</td>
			<td ></td>
			<td>rabbit anti-RIPK3. See refenence 11.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-Rabbit-HRP</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >A6154</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ECL</td>
			<td >Fisher</td>
			<td >WBKLS0500</td>
			<td>Western chemiluminescent HRP substrate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >X-ray film</td>
			<td >Fisher</td>
			<td >F-BX810</td>
			<td>for Western blot result</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D6429</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >fetal bovine serum</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >F4135</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >penicilin-streptomycin</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >P4333</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin solution</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >T4049</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS for tissue culture</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >D8662</td>
			<td>for cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >recombinant TNF</td>
			<td >made in our lab</td>
			<td ></td>
			<td>for inducing necroptosis. See reference 11.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >smac-mimetic</td>
			<td >gift from Dr. Xiaodong Wang</td>
			<td ></td>
			<td>for inducing necroptosis. See reference 11.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ZVAD-FMK</td>
			<td >ApexBio</td>
			<td >A1902</td>
			<td>for inducing necroptosis. See reference 11.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell Counter</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td>1450102</td>
			<td>Model TC20; for counting cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pierce&#8482; BCA Protein Assay Kit</td>
			<td >Thermo Scientific</td>
			<td >23225</td>
			<td>for measuring protein concentration in cell lysates</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell lifter</td>
			<td >Fisher</td>
			<td >07-200-364</td>
			<td>to remove cells from dish</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lysis Buffer (1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td >20 mL 1 M Tris pH 7.4 
			10 mL glycerol 
			30 mL 5 M NaCl 
			840 mL ddH2O 
			10 mL Triton-X100 
			(protease and phosphates inhibitors as desired)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10X TAE (1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td >48.4 g Tris base 
			11.42 mL glacial acetic acid 
			20 mL 0.5M EDTA pH 8 
			ddH20 to 1 L</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4X SDD-AGE loading buffer (50 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td >5 mL 10X TAE 
			10 mL glycerol 
			4 mL 20% SDS 
			0.5 mL 10% bromophenol blue 
			31 mL ddH2O</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TBS Transfer Buffer (1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td >20 mL 1 M Tris pH 7.4 
			30 mL 5 M NaCl 
			950 mL ddH2O</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBST Wash Buffer (1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td >100 mL 10xPBS 
			800 mL ddH2O 
			1 mL Tween20</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10X PBS (10 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td >800 g NaCl 
			20 g KCl 
			144 g Na2HPO4&#183;2H2O 
			24 g KH2PO4 
			add ddH2O to 10 L</td>
		</tr>
		</tbody>
</table>

use of two dimensional semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis to confirm size heterogeneity of amyloid or amyloid-like fibers

Amiloid Dil veya amiloid benzeri lifler birçok insan hastalıkları ile ilişkili olan ve şimdi birçok sinyal yolları için önemli olduğunu keşfetti edilmektedir. Kolayca bu elyaf çeşitli deneysel koşullarda oluşumu algılama yeteneğini potansiyel işlevleri anlamak için önemlidir. Pek çok yöntem lifler, algılamak için kullanılan ama bazı dezavantajları olmadan olmaz. Örneğin, elektron mikroskobu (EM) veya Kongo kırmızısı veya Thioflavin T ile sık sık boyama arıtma liflerinin gerektirir. Öte yandan, yarı denaturing deterjan özel Jel Elektroforez (SDD-yaş) hücre özleri arıtma olmadan SDS dayanıklı amiloid benzeri lifler algılanmasını sağlar. Buna ek olarak, boyut farkı liflerinin karşılaştırmasını sağlar. Daha da önemlisi, Western Blot tarafından spesifik proteinlerin lifler içinde tanımlamak için kullanılabilir. Daha az zaman alıcı ve labs daha geniş bir dizi için daha kolay erişilebilir. SDD-yaş sonuçları genellikle değişken heterojenite derecesini gösterir. Protein kompleksi SDS huzurunda Elektroforez sırasında ayrılma heterojenite parçası oluşur olup olmadığını sorusunu gündeme getiriyor. Bu nedenle, ikinci bir boyut SDD-ÇAĞINDA görülen boyutu heterojenite gerçekten fiber heterojenite vivo içinde bir sonucu ve bozulma ya da ayrılma sırasında proteinlerin bazı değil bir sonucu olup olmadığını belirlemek için SDD-Age istihdam Elektroforez. Bu yöntem, amiloid veya amiloid benzeri liflerin kısmen SDD-yaş işlemi sırasında dissociating değil hızlı, nitel onay sağlar.

Sonra necroptosis indüksiyon, RIPK1 ve RIPK3 hemen hemen aynı amiloid benzeri desenler (şerit 2 ve 4, şekil 1) gösterdi. Ancak, MLKL lifler daha heterojen ve RIPK1/RIPK3 lifleri (lane 6, şekil 1) küçük olmak gibiydi. Bizi ister MLKL RIPK1/RIPK3-bağımsız lifler oluşturur ya da MLKL sade bir şekilde büyük RIPK1/RIPK3/MLKL lifleri SDD-yaş sırasında ayrışıp. olasılığını adrese 2D SDD-yaş yöntem geliştirm...

Watch this Scientific Journal Video about Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers at JoVE.com

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

İki boyutlu yarı denaturing deterjan özel Jel Elektroforez amiloid veya amiloid benzeri liflerin boyutu heterojen onaylamak için kullanımı

Burada biz iki boyutlu yarı denaturing özel Jel Elektroforez amiloid benzeri lifler türdeş olmayan boyutta varlığını doğrulamak ve amiloid liflerinin ayrışma sırasında jel boyutu heterojenite kaynaklanmaktadır olasılığını dışlamak için kullanın koşma oluşum.

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Characterization of Multi-subunit Protein Complexes of Human MxA Using Non-denaturing Polyacrylamide Gel-electrophoresis

Denatüre edici olmayan poliakrilamid jel elektroforez kullanılarak insan mxa Çok alt birim protein kompleksleri karakterizasyonu

The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral ...

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Analiz için Protein-tRNA Agaroz Jel Retardasyon Testleri<em&gt; K</em<sup&gt; 6</sup&gt; Threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

We demonstrate methods for the expression and purification of tRNA(UUU) in Escherichia coli and the analysis by gel retardation assays of the binding of ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Mitokondriyal Elektron Nakil Zincirinin Süper Komplekslerinin Yerli Elektroforez, In-Jel Testleri ve Elektroelüsyon ile İncelenmesi

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

Deterjan çözünmez Protein toplamları--dan insan öldükten sonra beyin zenginleştirme

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

Protein-RNA Komplekslerinin Geliştirilmiş Algılaması için Yatay Jel Elektroforezi

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis

DNA polimeraz etkinliği tahlil Akrilamid Jel Elektroforez tarafından görüntülenmiştir yakın kızılötesi floresan etiketli DNA'yı kullanarak

For any enzyme, robust, quantitative methods are required for characterization of both native and engineered enzymes. For DNA polymerases, DNA synthesis ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Membran proteinlerinin Hofstede deterjan duyarlı tespiti

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Analysis of AtHIRD11 Intrinsic Disorder and Binding Towards Metal Ions by Capillary Gel Electrophoresis and Affinity Capillary Electrophoresis

AtHIRD11 içsel bozukluğu ve bağlama kapiller Jel Elektroforez ve benzeşme kapiler Elektroforez Metal iyonları doğru Analizi

Plants are strongly dependent on their environment. In order to adjust to stressful changes (e.g., drought and high salinity), higher plants evolve ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Thylakoid membran Protein kompleksleri tarafından mavi yerli jel elektroforez Analizi

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Rekombinant füzyon protein flüoresan proteaz tahlil Platform ve onların jel Renaturation kullanımı

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...