Name: generation of native, untagged huntingtin exon1 monomer and fibrils using a sumo fusion strategy
Uploaded: 2018-06-27T13:30:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy at JoVE.com

تم تمويل هذا العمل أساسا من المنح المقدمة من مؤسسة يعقدها و "مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية". ونشكر الدكتور صوفي فيفيغ لإجراء مناقشات مفيدة أثناء تطوير هذا النظام الجديد للتعبير وأعضاء آخرين من مجموعة لاشويل لتقاسم خبراتها مع هذا النظام التعبير وملاحظاتهم الإدخال وقيمة. ونشكر أيضا الأستاذ أوليفر هانتشيل لتوفير بلازميد ULP1. يشكر المؤلفون الدكتور جون وارنر باء والدكتور يونس ك. تانجاراج لاستعراض نقدي لهذه المخطوطة

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح مع محتويات هذه المادة.

في هذا البروتوكول، وقد اوجزنا إجراء فعال للحصول على كميات مليغرام من أصلي، تمييز Httex1 التي تحتوي على بقايا الجلوتامين 23 أو 43. وقد تحقق ذلك بالإعراب عن Httex1 كالتحام المحطة طرفية ج له6-العلامة السومو، التي تستخدم لعزل البروتين الانصهار من الخلية ليستي ايماك وهو المشقوق قبل تنقية [هبلك] من Httex1. بينما قد استخدمت استراتيجية السومو في إنتاج العديد من البروتينات الأخرى، لدينا أسلوب يظهر أن خصائص فريدة من نوعها السومو يمكن استخدامها أيضا لتوليد جوهريا اضطرابه، المعرضة للتجميع، بروتين أميلويدوجينيك التي أثبتت سابقا أن تكون الصعوبة بمكان التعامل معها وتنتج43،44. نقدم بروتوكول التي واضحة وسهلة الاستخدام وقابلة للمقارنة لوضع بروتوكول للجيل من البروتين "تصرفت بشكل جيد". سولوبيليزيس الانصهار السومو وتستقر Httex1 أثناء التعبير والخطوة تنقية ايماك. الانقسام سابق لأوانه للعلامة، كما لاحظت مع استراتيجية انتئين10 والتجميع لم تعد مشكلة.
البروتينات اضطرابه جوهريا عرضه للتدهور. في حين تدهور الطرفي ن في منطقة N17 ليست قضية استخدام هذا البروتوكول، يمكن أن تحدث ترونكيشنز في دلتا نهر اللؤلؤ Httex1. كما أن البروتينات مبتوراً متشابهة جداً إلى Httex1 في هيدروفوبيسيتي، تهمة، وحجم، وإزالتها بالوسائل الكروماتوغرافي التحدي، وبالتالي فمن الأفضل لمنع تكونها في المقام الأول. تخرج عن كثب للبروتوكول، تعمل دائماً على الجليد واستخدام كمية كافية من مثبطات البروتياز ينبغي أن تساعد الحفاظ على مستوى من الملاحظ اقتطاع منخفضة للغاية. تطبيق علامة انصهار في ج-محطة Httex1 يمكن إزالة truncations في دلتا نهر اللؤلؤ بسهولة كما سيفقد البروتين مبتوراً علامة تقارب كذلك. ومع ذلك، إذا كان التسلسل الأصلي الذي يحتاج إلى الإبقاء على هذا الخيار لا يمكن تطبيقها كما Httex1 ينتهي مع برولين والأفضل من معرفتنا هناك لا علامات الانصهار ج-محطة معروفة للحث على الانقسام وتراسلس وكفاءة بعد برولين.
الجزء الأكثر أهمية من البروتوكول هو التعامل مع Httex1 حررتها بعد انشقاق العلامة سومو ULP1. يجب تنقية البروتين مباشرة بالبرنامج العادي-[هبلك]. لحسن الحظ، وهذا هو فعل تتسم بالكفاءة والسرعة التي عادة ما يتم الانتهاء في 10-20 دقيقة في 4 درجات مئوية. وفي المقابل، المطلوب الاستراتيجية انتئين عدة ساعات للانقسام كاملة من انتئين، مما يتطلب مفاضلة بين الانقسام غير مكتملة وبداية التجميع من أجل تعظيم العائد. Workup سريع مطلوب للمسخ Httex1، كما أنها ستبدأ بتجميع بتركيز عال نسبيا في رد فعل الانقسام، بينما البديل 23Q مستقرة لفترة أطول. أثناء تنقية RP-[هبلك]، ميزة أخرى من السومو يصبح واضحا: حين انتئين دناب Ssp هو مسعور، وتتمسك بقوة بالعمود، سومو هو أكثر ماء والتيس تماما من العمود عكس المرحلة C4. على الرغم من أن ULP1 تجارية مكلفة جداً، يمكن أن تنتج البروتين بسهولة في عالية الغلة بعد29من البروتوكولات نشرت سابقا.
لا يمكن أن تكون الأهمية القصوى لتطبيق بروتوكول تفصيل قبل استخدام Httex1 التشديد. البروتينات polyQ المجففة بالتبريد مثل Httex1 مستقرة ويمكن أن تكون مخزنة في فترات طويلة، ولكن ليست تماما للذوبان في المياه والمخازن المؤقتة. يمكن أن يكون وجود ليغومرات بريفورميد أو ييفات أثر كبير على حركية التجميع والخصائص الفيزيائية ل البروتين45. يسمح البروتوكول تفصيل الموصوفة هنا التفصيل للبروتين، وإزالة الركام بريفورميد وجيل من حل أحادي Httex1 من عينة المجففة بالتبريد. لاحظنا مورفولوجيا حركية وفيبريل تجميع مماثلة للحصول عليها مع السومو واستراتيجية انتئين Httex1.
مقارنة بالطرق السابقة لإنتاج Httex1، الاستراتيجية سومو الموصوفة هنا يوفر العديد من المزايا، ويوسع نطاق الدراسات المحتملة للتحقيق في هيكل وخصائص وظيفية لهذا البروتين في الصحة والمرض. البروتين الانصهار سومو-Httex1 سهلة للتعامل، يمكن تجميد وتخزين أو الاحتفاظ في حل أجل 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة، في حين أن إجمالي mHttex1 الحرة بسرعة. الاستقرار والذوبان عالية من البروتينات الانصهار Httex1 سومو توفير قدر أكبر من المرونة التعامل مع البروتين و/أو إدخال تعديلات الانزيمية والكيميائيه في mHttex1 بخلاف ذلك لن يكون ممكناً بعد الانقسام. ويشمل ذلك إدخال التعديلات بوستترانسلاشونال، فلوروفوريس، وتدور التسميات، العلامات البيوتين، إلخ أن السلف المقدمة هنا 1) تسهيل الدراسات المستقبلية توضيح العلاقات بنية دالة من Httex1؛ 2) إنشاء أدوات جديدة للتحقيق Htt تجميع ونشر الأمراض؛ 3) تمكين تطوير فحوصات جديدة لتحديد الجزيئات التي تستقر المسخ Httex1 ومنع التجميع بها؛ و 4) تشجيع العلماء من الحقول الأخرى لكي تعمل على هذا البروتين والانضمام إلى سعينا لإيجاد علاج لمرض هنتنغتون.

Htt هو بروتين كاتشين 348، وقد تورط في عدة وظائف فسيولوجية1. عندما Htt يحتوي على منطقة polyQ موسعة من بقايا أكثر من 36 في نهايته N، فإنه يتسبب HD2،3. علم الأمراض HD يتميز بتضمينات الخلوية في المخطط واللحاء، مما يؤدي إلى موت الخلايا العصبية وضمور الأنسجة المتضررة4،5. تم اكتشاف الجثة العقول من المرضى عالية الدقة في عدة أجزاء Htt ن--المحطة الطرفية التي تحتوي على المسالك تكرار polyQ ويعتقد يمكن إنشاؤها بواسطة المعالجة بروتيوليتيك ل البروتين هونتينجتين6. تشير الدراسات الأخيرة إلى أن Httex1 أيضا يمكن أن يتشكل بسبب الربط مرناً الشاذة. يحتوي Httex1 على الطفرة polyQ المرضية وما أوفيريكسبريشن في الحيوانات يمكن أن الخص العديد من السمات الرئيسية هد7، وبالتالي إبراز دور مركزي ممكنة لهذا الجزء في هد علم الأمراض والأمراض تطور6، 8،9.
سبب تجميع عالية الميل للمسخ Httex1 (mHttex1) مع polyQ توسيع المسالك، تستند غالبية النظم القائمة على التعبير الانصهار عابرة من Httex1 للبروتينات (مثل الجلوتاثيون-S-ترانسفيراز (GST)، ثيوريدوكسين (TRX) أو مالتوس-ملزمة-البروتين (MBP) و/أو الببتيدات (بولي-الحامض الأميني) أن تحسين متفاوتاً في التعبير والذوبان في الاستقرار وتنقية10،11،،من1213،14 ،،من1516،17،،من1819،20،21،22،23 ،،من2425،26،،من2728. شريك الانصهار ترتبط Httex1 مع سلسلة قصيرة تحتوي على موقع انقسام البروتياز مثل التربسين، ذكر أحفر حوزتي الفيروس (TEV) أو بريسسيسيون للسماح للانقسام وإطلاق سراح Httex1 قبل الشروع في تجميع أو تنقية. وتشمل أوجه القصور في هذه الطرق إمكانية ترك مخلفات إضافية نظراً للانقسام وغير تراسيليس وإنشاء أجزاء مبتورة بسبب ميسكليفاجي ضمن تسلسل Httex1، بالإضافة إلى عدم التجانس نظراً للانقسام وغير مكتملة ( انظر فيفيغ et al. لمزيد من المناقشات المتعمقة عن مزايا وقيود هذا النهج)10. لمعالجة هذه القيود، وضعنا مؤخرا استراتيجية تعبير تمكين توليد Httex1 خالية من العلامة الأصلية للمرة الأولى باستخدام انصهار الطرفي ن عابرة من سينيتشوسيستيس sp. (Ssp) انتئين دناب إلى Httex110. بينما الانقسام انتئين traceless ومحددة وتعطي كمية ملغ من البروتينات، فإنه لا يزال يعاني اثنين من العوائق التي يمكن أن تقلل من العائد: إلا وهي سابقة لأوانها الانقسام من انتئين التي يمكن أن تحدث أثناء التعبير، وحقيقة أن يحدث انشقاق أكثر عدة ساعات، مما قد يؤدي إلى فقدان البروتين نظراً للتجميع، لا سيما بالنسبة Httex1 مع تكرار polyQ الموسع.
لمعالجة هذه القيود وصقل استراتيجيتنا لإنتاج أصلي، خالية من علامة Httex1، طورنا نظام تعبير جديد يستند إلى الانصهار عابرة من السومو، أكثر تماما الخميرة هومولوج Smt3 إلى Httex1. تطبيق نظام السومو لإنتاج البروتينات المؤتلف نشرت لأول مرة في عام 200429، حيث اتضح زيادة معدل التعبير والذوبان من البروتين الانصهار السومو. يمكن المشقوق العلامة السومو من أوبيكويتين مثل البروتين-خاصة بحوزتي 1 (ULP1)، التي لا تتطلب اعتراف بموقع، ولكن يعترف هيكل التعليم العالي السومو ويلغي عمليا إمكانية ميسكليفاجي30. وعلاوة على ذلك، الانقسام و ULP1 بوساطة سريع وتراسلس ولا تترك بقايا إضافية. الانقسام سابق لأوانه للعلامة الانصهار، كما لاحظت مع انتئين أوتوكاتاليتيك10، هو تجنبها تماما بشرط حوزتي الخارجية. في حين أن استراتيجية سومو يستخدم على نطاق واسع في الوقت الحاضر للبروتين المؤتلف إنتاج31،،من3233، نظهر في هذه الورقة أنها مفيدة بشكل خاص للجيل من المختلين جوهريا، بروتين أميلويدوجينيك المعرضة للتجميع، مثل Httex1. ونحن نعتقد أن البساطة والكفاءة ومتانة أسلوبنا سومو-المستندة إلى الانصهار سوف تجعل Httex1 الأصلية، وخالية من علامة أيسر منالاً للباحثين من مختلف التخصصات والقضاء على الحاجة إلى استخدام تسلسلات غير أصلي من Httex1 في المختبر . وهذا تقدم هام التي ستسهل الدراسات المستقبلية توضيح علاقة بنية الدالة Httex1.
يصف البروتوكول تنقية Httex1 من 12 ل ثقافة البكتيرية، ولكن البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة لمقياس أصغر أو أكبر للإنتاج. وصف البروتوكول إنتاج نوع البرية Httex1 (wtHttex1) مع polyQ طول تكرار أدناه (23Q) والمسخ Httex1 (mHttex1) مع polyQ تكرار طول أعلاه (43Q) على عتبة المسببة للمرض (36Q).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1585px;" width="1585">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:443px;">Uranyl formate (UO2(CHO2)2)</td>
			<td style="width:193px;">EMS</td>
			<td style="width:124px;">22450</td>
			<td style="width:825px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formvar/carbon 200 mesh, Cu 50 grids</td>
			<td>EMS</td>
			<td>FCF200-Cu-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Precision Cell made of Quartz SUPRASIL 1 mm light path from Hellma Analytics</td>
			<td>HellmaAnalytics</td>
			<td>110-1-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buffer Substance Dulbecco&#39;s (PBS w/o Ca and Mg) ancinne ref 47302 (RT) SERVA</td>
			<td>Witech</td>
			<td>SVA4730203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicillin</td>
			<td>AxonLab</td>
			<td>A0839.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luria Broth (Miller&#39;s LB Broth)</td>
			<td>&#160;Chemie Brunschwig</td>
			<td>1551.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>AxonLab</td>
			<td>A1008.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E. coli B ER2566</td>
			<td>NEB</td>
			<td>NEB# E4130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56750-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cOmplete&#160;Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Huntingtin Antibody, a.a. 1-82</td>
			<td>Merck Millipore Corporation</td>
			<td>MAB5492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H + L)</td>
			<td>Licor</td>
			<td>925-68070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMSF</td>
			<td>AxonLab</td>
			<td>A0999.0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HisPrep 16/10 column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28936551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">C4 HPLC column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00G-4168.P0</td>
			<td>&#160;&#160;&#160; 10 &#181;m C4 300 &#197;, LC Column 250 x 21.2 mm, Phenomenex, 19x10 mm guard column, not temperature jacketed</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile HPLC</td>
			<td>MachereyNagel</td>
			<td>C2502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filtre seringue Filtropur S 0,45 ul sans prefiltre sterile</td>
			<td>Sarstedt AG</td>
			<td>83.1826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectrophotometer semi-micro cuvette</td>
			<td style="width:193px;">Reactolab S.A.</td>
			<td>2534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superloop, 1/16&#34; fittings (&#196;KTAdesign), 50 ml</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>18111382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>302031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GREINER Tubes fo FPLC 16 x 100 mm, cap. 12.0 ml</td>
			<td style="width:193px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>7.160 102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;100 kD Microcon&#160; fast flow filters</td>
			<td style="width:193px;">Merck Millipore Corporation</td>
			<td>MRCF0R100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vibra-cell VCX130 ultrasonic liquid processor</td>
			<td>Sonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#196;kta 900 equipped with a fraction collector&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Jasco J-815 Circular Dichroism</td>
			<td>Jasco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters UPLC system&#160;</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>C8 BEH acquity 2.1x100 mm 1.7 micron column&#160; , preheated column (40 &#176;C), flow rate of 0.6 mL/min, injection volume of 4 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">waters HPLC system</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>2489 UV detector and 2535 quaternary gradient module, 20 mL loop in a FlexInject housing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ESI-MS: Finnigan LTQ</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">lyophylizer instrument</td>
			<td>FreeZone 2.5 Plus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tecnai Spirit BioTWIN&#160;</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td>electron microscope equipped with a LaB6 gun and a 4K x 4K FEI Eagle CCD camera (FEI) and operated at 80 kV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C shaking&#160; incubator</td>
			<td>Infors HT multitron Standard</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biophotometer plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of native, untagged huntingtin exon1 monomer and fibrils using a sumo fusion strategy

مرض هنتنغتون (HD) مرض موروثة الأعصاب قاتلة الناجمة عن عملية توسيع المساعدة النقدية (إيه ثري سيكس) في إكسون أول من الجينات عالية الدقة، أسفر عن التعبير عن البروتين هونتينجتين (Htt) أو الطرفي ن أجزاء منه مع (polyglutamine الموسعة الامتداد polyQ).
Exon1 البروتين هونتينجتين (Httex1) هو أصغر جزء Htt أن يلخص العديد من ميزات عالية الدقة في الخلوي والحيوان نماذج، وهو أحد أجزاء الدراسة على نطاق واسع من Htt. صغر حجم Httex1 يجعله تجريبيا أكثر قابلية لتوصيف الفيزيائية الحيوية باستخدام التقنيات القياسية وعالية الدقة بالمقارنة مع أجزاء أطول أو Htt كاملة الطول. ومع ذلك، تجميع عالية الميل للمسخ Httex1 (mHttex1) مع polyQ زيادة المحتوى (إيه فور تو) جعلت من الصعب لتطوير كفاءة التعبير وأنظمة تنقية إنتاج هذه البروتينات بكميات كافية، وجعلها متاحة العلماء من مختلف التخصصات دون استخدام البروتينات الانصهار أو غيرها من الاستراتيجيات التي تغير التسلسل الأصلي للبروتين. نقدم هنا طريقة قوية ومحسنة لإنتاج كميات مليغرام من أصلي، العلامة خالية Httex1 استناداً إلى الانصهار عابرة من معدل ubiquitin الصغيرة ذات الصلة (سومو). بالبساطة والكفاءة الاستراتيجية سيقضي على الحاجة إلى استخدام تسلسلات غير أصلي من Httex1، وبالتالي جعل هذا البروتين أكثر متاحة للباحثين وتحسين إمكانية تكرار نتائج التجارب في مختبرات مختلفة. ونحن نعتقد أن هذه السلف سيسهل أيضا الدراسات المستقبلية الرامية إلى توضيح العلاقة بنية الدالة Htt، فضلا عن تطوير أدوات تشخيص الرواية والعلاجات لعلاج أو إبطاء التطور من [هد].

وأعرب عن Httex1 كولاي مع ن--المحطة طرفية في بلده6-العلامة السومو. يتم تلخيص نتائج الممثل للتعبير وتنقية البروتين الانصهار في الشكل 1. تسلسل Httex1 يتكون من مخلفات 2-90 Htt ويبدأ مع Ala2، لأن Met1 هو ملصوق تماما في فيفو42. الترقيم من الأحماض الأمينية التي تشير إلى متغير 23Q، يظهر التسلسل الكامل للبروتين الانصهار المعرب عنها في الشكل 1ألف. البلازميدات ستودع لدى أدجيني في المستقبل القريب أن تكون مشتركة مع المجتمع المحلي. ويبين الشكل 1بتخطيطي بلازميد والبروتين الانصهار أعرب. تعرب عن Httex1 His6-سومو على مستوى متوسط (الشكل 1ج) ومعظم من البروتين الانصهار موجود في جزء صغير قابل للذوبان بعد تحلل، سواء بالنسبة 23Q والخيار 43Q. وترحيل البروتين الانصهار أعلى من المتوقع، استناداً إلى الوزن الجزيئي. وهذا يرجع جزئيا إلى حظيرة سومو قوية ولكن في الغالب بسبب تكوين تسلسل غير عادية من Httex1، التي تحتوي على بقايا الجلوتامين وبرولين أساسا. Wildtype (23Q) والمسخ (43Q) يمكن إثراء البروتين الانصهار للنقاء ~ 80% من ايماك (الشكل 1د) يمكن تفسير وجود المشترك تنقية البروتين المضيف بمستوى منخفض نسبيا من التعبير Httex1 وعينه كبيرة حجم تطبيقه على العمود.
الانقسام له6-العلامة السومو وتنقية Httex1 يظهر في الشكل 2أ. أوبلك أداة فعالة لرصد الانقسام له6-سومو العلامة (الشكل 2ب). يستهلك في ذروة الأصلي من البروتين الانصهار وقمم جديدة والمنفصلين عن ذويهم جيدا اثنين الموافق له6-تظهر العلامة السومو و Httex1. رد فعل الانقسام وانتهى في 10-20 دقيقة. الغربية لطخة (البنك الدولي) بطيء جداً لرصد رد فعل الانقسام وكفاءة، ولكن قد أدرج في هذا الرقم كمرجع وإظهار مدى اكتمال الانقسام السومو. كلا Httex1 23Q و 43Q لا يمكن فصلها تماما عن له6-سومو الوسم بالبرنامج العادي-[هبلك] (الشكل 2ج) وتم الحصول على درجة نقاء عالية كما يتضح من تحليل أوبلك، مرض التصلب العصبي المتعدد، والحزب الديمقراطي الصربي صفحة (الشكل 2د).
لتوضيح أن البروتينات Httex1 التي أعدها هذا الأسلوب الاحتفاظ بخصائص التجميع المتوقعة Httex1، قمنا بتقييم حركية فيبريليزيشن متحولة Httex1 عند 37 درجة مئوية قبل مقايسة ترسب، رصد التغييرات في هيكل الثانوية عن طريق مؤتمر نزع السلاح التحليل الطيفي، وتتميز مورفولوجية المجاميع بال. مجموعة بيانات تمثيلية من حركية التجميع لتشكيل فيبريل mHttex1 كما يحددها مقايسة ترسب يرد فيالشكل 3ألف. فقدان القابلة للذوبان Httex1 43Q على مر الزمن، بسبب تشكيل فيبريل كان كمياً أوبلك. ونلاحظ استنفاد كامل للبروتين للذوبان بعد 48 ساعة حضانة. بالإضافة إلى ذلك، عقدنا العزم بنية ثانوية من البروتين بالتحليل الطيفي CD (الشكل 3ب). تحولات 43Q Httex1 غير منظم (λدقيقة 205 nm) لتشكيل الغنية أساسا β-ورقة (λدقيقة 215 nm) بعد 48 ساعة حضانة. ويرافق هذا التغيير الهيكلي تشكيل المجاميع فيبريلار منذ فترة طويلة كما يمكن ملاحظته من تيم في 48 ساعة (الشكل 3ج).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig1.jpg"> الشكل 1 . التعبير وتنقية له6-البروتين الانصهار سومو Httex1.  (أ) تسلسل الأحماض الأمينية له6-سومو-Httex1-سن بنيات الانصهار (له6-سومو باللون الأخضر و Httex1-سن في أورانج)؛ (ب) عامة التخطيطي للتعبير وتنقية البروتين الانصهار؛ (ج) تحليل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة للتعبير وقابلية الذوبان من البروتين الانصهار بعد تحلل؛ (د) تشروماتوجرام لتنقية البروتين الانصهار ايماك وتحليل للكسور جانب الحزب الديمقراطي الصربي صفحة (شريط أحمر: شريط الكسر غير منضم، الأزرق: أغسل الكسر، أسود بار: الكسور التي تحتوي على ذروة شطف)؛ <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig2.jpg"> الشكل 2 . الانقسام له6 سومو العلامة وتنقية البروتينات خالية من علامة Httex1-سن . (أ) نظرة عامة التخطيطي؛ (ب) تحليل الانقسام والعلامة سومو مع ULP1 من أوبلك (الأزرق: قبل إضافة ULP1؛ الأسود: 20 دقيقة (23Q)، على التوالي 10 دقيقة (43Q) بعد إضافة ULP1) والبنك الدولي (MAB5492 1:2000، الماعز الثانوي المضادة بينها جسم الماوس)؛ (ج) تشروماتوجرام لتنقية RP-[هبلك] محضرة Httex1؛ دال: تحليل Httex1 المنقي من أوبلك، الحزب الديمقراطي الصربي صفحة وأي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد؛ الوزن الجزيئي المتوقع هو 9943 دا (23Q) ودا 12506 (43Q) على التوالي. <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig3.jpg"> الشكل 3 . تجميع Httex1-43Q: المقايسة الترسب (أ) استناداً إلى أوبلك. (ب) الأطياف مؤتمر نزع السلاح للهيكل الثانوي في ح 0 و 48 حاء (ج) تيم ميكروجرافس من المجاميع في ح 48 (أشرطة مقياس هي 200 nm). <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy at JoVE.com

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

نقدم هنا، بروتوكول قوية ومحسنة لإنتاج كميات مليغرام من مونومرات أصلية وخالية من العلامة وييفات من exon1 البروتين هونتينجتين (Httex1) استناداً إلى الانصهار عابرة من معدل ubiquitin الصغيرة ذات الصلة (سومو).

جيل مونومر Exon1 هونتينجتين الأصلية، وليس تمييز وييفات استخدام استراتيجية انصهار السومو

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

تحديد البروتينات ملزمة جزيء صغير في الخلوي البيئة الأصلية التي تعيش خلية Photoaffinity وصفها

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

حل تقارب تنقية البروتين المجمعات التي كتبها Blue الأصلية PAGE والبروتين الارتباط التنميط

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

تحليل سوبيركومبلكسس من سلسلة النقل الإلكترون الميتوكوندريا مع الكهربائي الأصلي، في هلام فحوصات، والكهرباء

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

تجزئة للقرار من الأنواع هونتينجتين القابلة للذوبان وغير قابلة للذوبان

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

التقاط وتحديد البروتينات الحمض النووي الريبي ملزم باستخدام نقرة الكيمياء-وساعدت الجيش الملكي النيبالي-إينتيراكتومي التقاط استراتيجية (كاريك)

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

استخدام البروتينات الانصهار المؤتلف في منصة فحص حوزتي فلورسنت وما ريناتوريشن في جل

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

الهجين واضح/الأزرق الكهربائي الأصلي للفصل وتحليل المجمعات التنفسية الميتوكوندريا السلسلة الفائقة

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

استراتيجية لتحديد المركبات التي تؤثر على نمو الخلايا والبقاء على قيد الحياة في خلايا الثدييات المستزرعة في الإنتاجية المنخفضة إلى المتوسطة

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

توطين البروتينات المعدلة السومو باستخدام السومو الفلورسنت-البروتينات الملائمة

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

التفاعلات مع وغشاء التغلغل من الميتوكوندريا الدماغ بواسطة ألياف الليفية اميلويد

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...