Name: generation of native, untagged huntingtin exon1 monomer and fibrils using a sumo fusion strategy
Uploaded: 2018-06-27T13:30:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door subsidies van de CHDI-Stichting en de Zwitserse National Science Foundation. Wij danken Dr. Sophie Vieweg voor nuttige discussies tijdens de ontwikkeling van dit nieuwe systeem van de expressie en andere leden van de groep van de Lashuel voor het delen van hun ervaringen met dit systeem van expressie en voor hun input en waardevolle feedback. Wij danken ook Prof. Oliver Hantschel voor het verstrekken van de ULP1-plasmide. De auteurs bedanken Dr. John B. Warner en Dr. Senthil K. Thangaraj voor de kritische evaluatie van het manuscript

De auteurs verklaren dat zij geen conflicten van interesse met de inhoud van dit artikel hebben.

In dit protocol, we hebben geschetst een efficiënte procedure voor verkrijging milligram hoeveelheden native, gecodeerde Httex1 23 of 43 glutamine residuen bevatten. Dit werd bereikt door het uiten van Httex1 als een fusie van de C-terminal een zijn6-SUMO tag, die wordt gebruikt voor het isoleren van de fusieproteïne uit de cel lysate door IMAC en gekloofd is vóór HPLC zuivering van Httex1. Terwijl de SUMO-strategie is gebruikt in de productie van verschillende andere eiwitten, onze methode laat zien dat de unieke eigenschappen die Sumo kan ook worden gebruikt voor het genereren van intrinsiek ontregelde, aggregatie-gevoelig, amyloidogenic eiwit dat reeds eerder is aangetoond te worden moeilijk te hanteren en43,44te produceren. We presenteren een protocol dat is ongecompliceerd, makkelijk te gebruiken en vergelijkbaar met een protocol voor het genereren van een "goedgedragende" eiwit. De SUMO fusion Lost en stabiliseert Httex1 tijdens de expressie en de zuivering van de IMAC. Voortijdige splijten van de tag, zoals waargenomen met de intein strategie10 en aggregatie waren niet langer een probleem.
Intrinsiek ongeordende eiwitten zijn bijzonder kwetsbaar voor afbraak. Terwijl de aantasting van het N-terminaal N17 regio niet een probleem met behulp van dit protocol is, kunnen opschoningen in de PRD van Httex1 optreden. Als de afgekapte eiwitten zijn zeer gelijkaardig aan de Httex1 in hydrophobicity, lading en grootte, ze te verwijderen met chromatografische middelen is uitdagend, dus het is best om te voorkomen dat hun vorming in de eerste plaats. Steken nauw bij het protocol, altijd bezig met ijs en met behulp van een voldoende hoeveelheid proteaseinhibitor moeten helpen het niveau van waargenomen afkappen zeer laag houden. Toepassing van een fusie-tag in het C-terminus van Httex1 kon verwijderen opschoningen in de PRD gemakkelijk als de afgekapte proteïne evenals de affiniteit tag zou verliezen. Echter, als de oorspronkelijke volgorde worden gehandhaafd dat met deze optie kan niet worden toegepast moet als Httex1 met proline en tot de beste van onze kennis eindigt er zijn geen C-terminal fusion labels waarvan bekend is dat het induceren van spoorloze en efficiënte decolleté na proline.
Het meest kritische deel van het protocol is de behandeling van de Httex1 bevrijd na de splitsing van de SUMO-tag door ULP1. Het eiwit moet onmiddellijk worden gezuiverd door RP-HPLC. Gelukkig is dit een efficiënte en snelle reactie, dat is meestal voltooid in 10-20 min bij 4 ° C. De intein strategie vereist daarentegen enkele uren voor volledige splitsing van de intein, waarvoor derhalve een trade-off tussen onvolledig decollete en begin aggregatie te maximaliseren van het rendement. Een snelle workup is vereist voor mutant Httex1, zoals op zal voorsprong bijeen te voegen op de relatief hoge concentratie aanwezig in de reactie van het decollete, overwegende dat de 23Q variant voor een langere tijd stabiel is. Tijdens de RP-HPLC-zuivering, een ander voordeel van SUMO wordt duidelijk: terwijl de Ssp DnaB intein hydrofoob is en sterk naar de kolom stokken, SUMO is meer hydrofiele en GC volledig uit de C4 reversed-phase kolom. Commerciële ULP1 weliswaar vrij kostbaar is, kan het eiwit gemakkelijk worden geproduceerd in hoog rendement na eerder gepubliceerde protocollen29.
Het cruciale belang van de toepassing van een protocol aggregatieniveau voorafgaand aan het gebruiken van de Httex1 kan niet genoeg benadrukt. Gelyofiliseerd polyQ eiwitten zoals Httex1 kunnen zijn stabiel en opgeslagen lange periodes, maar zijn niet volledig oplosbaar zijn in water en buffers. De aanwezigheid van voorgevormde oligomeren of fibrillen kan een belangrijke impact hebben op aggregatie kinetiek en biofysische eigenschappen van de eiwit-45. Het aggregatieniveau protocol hier beschreven kan het aggregatieniveau van het eiwit, verwijdering van voorgevormde aggregaten en generatie van een oplossing van de monomeer Httex1 uit een gelyofiliseerd monster. We waargenomen soortgelijke aggregatie kinetiek en fibril morfologie voor Httex1 verkregen met de SUMO en de strategie van de intein.
Vergeleken met vorige methoden voor de productie van Httex1, de SUMO-strategie zoals hier beschreven biedt verschillende voordelen en breidt het bereik van mogelijke studies te onderzoeken van de structuur en functionele eigenschappen van dit eiwit in gezondheid en ziekte. De fusieproteïne SUMO-Httex1 is gemakkelijk te hanteren, kan worden ingevroren en opgeslagen of bewaard in de oplossing gedurende 24 uur bij omgevingstemperatuur, terwijl de vrije mHttex1 snel zou aggregaat. De stabiliteit en de hoge oplosbaarheid van de SUMO-Httex1 fusion eiwitten bieden meer flexibiliteit te manipuleren van de eiwitten en/of enzymatische en chemische wijzigingen in mHttex1 die anders niet mogelijk na splitsing zijn zou invoeren. Dit omvat de invoering van posttranslationele modificaties, fluorophores, spin etiketten, Biotine tags, etc. moeten de vooruitgang hier gepresenteerd 1) vergemakkelijken van toekomstige studies om te verhelderen structuur-functie relaties van Httex1; 2) het genereren van nieuwe hulpmiddelen om te onderzoeken Htt aggregatie en pathologie zich kan verspreiden; 3) stellen de ontwikkeling van nieuwe testen te identificeren van moleculen die mutant Httex1 te stabiliseren en te voorkomen dat de samenvoeging; en 4) moedigen wetenschappers uit andere velden om te werken aan dit eiwit en Word lid van onze zoektocht naar behandelingen voor de ziekte van Huntington.

Htt is een 348 kDa proteïne en is betrokken bij verschillende fysiologische functies1. Wanneer Htt een uitgebreide polyQ regio van meer dan 36 residuen in de N-terminus bevat, veroorzaakt het HD2,3. HD-pathologie wordt gekenmerkt door cellulaire inclusies in het striatum en cortex, wat tot neuronale dood en atrofie van de aangetaste weefsels4,5 leidt. Diverse N-terminale Htt fragmenten die de polyQ herhalen tractus bevatten in post mortem hersenen van HD patiënten zijn gedetecteerd en worden verondersteld te worden gegenereerd door Proteolytische verwerking van het eiwit huntingtin6. Recente studies suggereren dat Httex1 ook vanwege afwijkende mRNA-splicing kon worden gevormd. Httex1 bevat de pathologische polyQ mutatie en haar overexpressie bij dieren kan veel van de belangrijkste functies van HD7, dus het markeren van een mogelijke centrale rol van dit fragment in HD pathologie en ziekte progressie6, recapituleren 8,9.
Als gevolg van de hoge aggregatie neiging van mutant Httex1 (mHttex1) met uitgebreide polyQ-darmkanaal, het merendeel van de bestaande expressiesystemen zijn gebaseerd op de voorbijgaande fusie van Httex1 aan eiwitten (zoals de glutathion-S-transferase (GST), thioredoxin (TRX) of maltose-bindend-proteïne (MBP) en/of peptiden (poly-histidine) die differentieel de expressie, stabiliteit, zuivering en/of oplosbaarheid10,11,12,13,14 verbeteren ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. De fusie partner is gekoppeld aan Httex1 met een korte opeenvolging met een breukzijde voor proteasen zoals trypsine, tabak etch virus (TEV) protease- of PreScission met het oog op het decolleté en de introductie van Httex1 vóór de inleiding van aggregatie of zuivering. Tekortkomingen van deze methoden omvatten de mogelijkheid van het verlaten van de extra residuen als gevolg van niet-spoorloze splijten en de oprichting van afgeknotte fragmenten als gevolg van de miscleavage binnen de volgorde van de Httex1, naast de heterogeniteit als gevolg van onvolledige splitsingsproducten ( Zie Vieweg, et al. voor meer diepgaande discussie over de voordelen en beperkingen van deze aanpak)10. Om aan deze beperkingen, strategie wij onlangs een expressie waarmee de generatie van inheemse tag-vrije Httex1 voor de eerste keer met behulp van een voorbijgaande N-terminale fusie van de Synechocystis sp. (Ssp) DnaB intein tot Httex110. Terwijl het intein splijten spoorloze en specifieke en mg hoeveelheid eiwitten levert, het nog steeds lijdt twee nadelen die de opbrengst verminderen kunnen: namelijk voorbarig splitsing van de intein die zich tijdens de expressie, en het feit dat splitsing vindt plaats voordoen kan via enkele uren, die tot verlies van eiwitten door aggregatie, vooral voor Httex1 met uitgebreide polyQ herhaalt leiden kunnen.
Inspelen op deze beperkingen en verfijnen van onze strategie voor de productie van native, tag-vrije Httex1, wij een nieuwe expressie systeem ontwikkeld op basis van de voorbijgaande fusie van SUMO, meer precies de gist homolog Smt3 te Httex1. De toepassing van de SUMO-systeem voor de productie van recombinante eiwitten werd voor het eerst gepubliceerd in 200429, waar een verhoogd tarief van meningsuiting en de oplosbaarheid van SUMO fusieproteïne werd aangetoond. De SUMO-tag kan worden cleaved door de ubiquitin als eiwit-specifieke protease 1 (ULP1), die hoeft niet een erkenning site, maar herkent de tertiaire structuur van SUMO en vrijwel elimineert de mogelijkheid van miscleavage30. Bovendien, het ULP1-gemedieerde splijten is snel en spoorloze en laat geen extra residuen achter. Het voorbarig splijten van de fusion-tag, wordt zoals waargenomen met de autocatalytic intein10, volledig vermeden door de eis van een externe protease. Terwijl de SUMO-strategie tegenwoordig veel voor recombinant eiwit productie31,32,33 gebruikt wordt, we het in dit document laten zien dat het vooral nuttig voor het genereren van een intrinsiek ongeordende is, aggregatie-gevoelig, amyloidogenic eiwitten zoals Httex1. Wij zijn van mening dat de eenvoud, de efficiëntie en de degelijkheid van onze SUMO fusion-gebaseerde methode zal native, tag-vrije Httex1 meer toegankelijk voor onderzoekers uit verschillende disciplines maken en de noodzaak elimineren om het gebruik van uitheemse sequenties van Httex1 in vitro . Dit is een belangrijke stap vooruit dat toekomstige studies om te verhelderen van de structuur-functie relatie van Httex1 zal vergemakkelijken.
Het protocol beschrijft de zuivering van Httex1 van 12 L van bacteriële cultuur, maar het protocol zou kunnen gemakkelijk worden aangepast voor kleinere of grotere schaal producties. Het protocol beschrijft de productie van wild type Httex1 (wtHttex1) met een polyQ herhalen lengte hieronder (23Q) en mutant Httex1 (mHttex1) met een polyQ Herhaal lengte boven (43Q) de pathogene drempel (36Q).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1585px;" width="1585">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:443px;">Uranyl formate (UO2(CHO2)2)</td>
			<td style="width:193px;">EMS</td>
			<td style="width:124px;">22450</td>
			<td style="width:825px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formvar/carbon 200 mesh, Cu 50 grids</td>
			<td>EMS</td>
			<td>FCF200-Cu-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Precision Cell made of Quartz SUPRASIL 1 mm light path from Hellma Analytics</td>
			<td>HellmaAnalytics</td>
			<td>110-1-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buffer Substance Dulbecco&#39;s (PBS w/o Ca and Mg) ancinne ref 47302 (RT) SERVA</td>
			<td>Witech</td>
			<td>SVA4730203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicillin</td>
			<td>AxonLab</td>
			<td>A0839.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luria Broth (Miller&#39;s LB Broth)</td>
			<td>&#160;Chemie Brunschwig</td>
			<td>1551.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>AxonLab</td>
			<td>A1008.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E. coli B ER2566</td>
			<td>NEB</td>
			<td>NEB# E4130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56750-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cOmplete&#160;Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Huntingtin Antibody, a.a. 1-82</td>
			<td>Merck Millipore Corporation</td>
			<td>MAB5492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H + L)</td>
			<td>Licor</td>
			<td>925-68070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMSF</td>
			<td>AxonLab</td>
			<td>A0999.0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HisPrep 16/10 column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28936551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">C4 HPLC column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00G-4168.P0</td>
			<td>&#160;&#160;&#160; 10 &#181;m C4 300 &#197;, LC Column 250 x 21.2 mm, Phenomenex, 19x10 mm guard column, not temperature jacketed</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile HPLC</td>
			<td>MachereyNagel</td>
			<td>C2502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filtre seringue Filtropur S 0,45 ul sans prefiltre sterile</td>
			<td>Sarstedt AG</td>
			<td>83.1826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectrophotometer semi-micro cuvette</td>
			<td style="width:193px;">Reactolab S.A.</td>
			<td>2534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superloop, 1/16&#34; fittings (&#196;KTAdesign), 50 ml</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>18111382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>302031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GREINER Tubes fo FPLC 16 x 100 mm, cap. 12.0 ml</td>
			<td style="width:193px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>7.160 102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;100 kD Microcon&#160; fast flow filters</td>
			<td style="width:193px;">Merck Millipore Corporation</td>
			<td>MRCF0R100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vibra-cell VCX130 ultrasonic liquid processor</td>
			<td>Sonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#196;kta 900 equipped with a fraction collector&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Jasco J-815 Circular Dichroism</td>
			<td>Jasco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters UPLC system&#160;</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>C8 BEH acquity 2.1x100 mm 1.7 micron column&#160; , preheated column (40 &#176;C), flow rate of 0.6 mL/min, injection volume of 4 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">waters HPLC system</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>2489 UV detector and 2535 quaternary gradient module, 20 mL loop in a FlexInject housing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ESI-MS: Finnigan LTQ</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">lyophylizer instrument</td>
			<td>FreeZone 2.5 Plus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tecnai Spirit BioTWIN&#160;</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td>electron microscope equipped with a LaB6 gun and a 4K x 4K FEI Eagle CCD camera (FEI) and operated at 80 kV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C shaking&#160; incubator</td>
			<td>Infors HT multitron Standard</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biophotometer plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of native, untagged huntingtin exon1 monomer and fibrils using a sumo fusion strategy

De ziekte van Huntington (HD) is een erfelijke fatale neurodegeneratieve ziekte veroorzaakt door een CAG uitbreiding (≥36) in de eerste exon van het HD-gen, resulterend in de expressie van het eiwit Huntingtin (Htt) of N-terminale fragmenten daarvan met een uitgebreide polyglutamine ( polyQ) stuk.
De exon1 van het eiwit Huntingtin (Httex1) is de kleinste Htt-fragment dat veel van de functies van HD in mobiele recapituleert en dierlijke modellen en is een van de meest bestudeerde fragmenten van Htt. De kleine grootte van Httex1 maakt het experimenteel meer vatbaar voor biofysische karakterisering met behulp van standaard en hoge resolutie technieken in vergelijking met langere fragmenten of full-length Htt. Echter, de hoge aggregatie neiging van mutant Httex1 (mHttex1) met verhoogde polyQ inhoud (≥42) heeft het moeilijk gemaakt om efficiënte expressie en reinigingssystemen te produceren van deze eiwitten in voldoende hoeveelheden en toegankelijk te maken wetenschappers uit verschillende disciplines zonder het gebruik van fusie-eiwitten of andere strategieën die gevolgen hebben voor de oorspronkelijke volgorde van het eiwit. Wij presenteren hier een robuust en geoptimaliseerde methode voor de productie van milligram hoeveelheden voor native, tag-gratis Httex1 op basis van de voorbijgaande fusie van kleine ubiquitin verwante modifier (SUMO). De eenvoud en efficiëntie van de strategie zal elimineren de noodzaak om het gebruik van uitheemse sequenties van Httex1, dus dit eiwit meer toegankelijk maken voor onderzoekers en het verbeteren van de reproduceerbaarheid van experimenten in verschillende laboratoria. Wij zijn van mening dat deze vooruitgang ook toekomstige studies gericht op het ophelderen van de structuur-functie relatie van Htt evenals ontwikkelende nieuwe diagnostische hulpprogramma's en therapieën te behandelen of te vertragen de progressie van HD zal vergemakkelijken.

Httex1 wordt uitgedrukt in E. coli met een N-terminal zijn-6-SUMO label. De representatieve resultaten van de expressie en de zuivering van de fusieproteïne worden samengevat in Figuur 1. De volgorde van de Httex1 bestaat uit 2-90 residuen van Htt en begint met Ala2, omdat Met1 volledig gekloofd in vivo42 is. De nummering van de aminozuren verwijst naar de 23Q-variant, de volledige sequentie van de geuite fusieproteïne is getoond in Figuur 1A. De plasmiden worden gestort op Addgene in de nabije toekomst te delen met de Gemeenschap. Een schematische voorstelling van de plasmide en de geuite fusieproteïne is afgebeeld in Figuur 1B. His6-SUMO Httex1 spreekt op een gemiddeld beveiligingsniveau (Figuur 1C) en de meeste van de fusieproteïne is aanwezig in de oplosbare fractie na lysis, zowel voor de 23Q en de 43Q variant. De fusieproteïne migreert hoger dan verwacht, op basis van het molecuulgewicht. Dit is deels te wijten aan de sterke vouw van SUMO maar vooral te wijten aan de samenstelling van de ongebruikelijke volgorde van Httex1, die voornamelijk glutamine en proline residuen bevatten. Zowel de wildtype (23Q) en de mutant (43Q) fusieproteïne ~ 80% zuiverheid kan worden verrijkt door IMAC (Figuur 1D) de aanwezigheid van co zuiveren host eiwit kan worden verklaard door het relatief lage expressie niveau van Httex1 en de grote steekproef het volume wordt toegepast op de kolom.
Het splijten van het zijn6-SUMO tag en de zuivering van Httex1 wordt getoond in Figuur 2. UPLC is een efficiënt hulpmiddel voor de monitoring van de splitsing van de zijn6-SUMO label (Figuur 2B). De oorspronkelijke piek van het fusie-eiwit wordt verbruikt en twee nieuwe en goed gescheiden bergtoppen overeenkomt de zijn6-SUMO tag en Httex1 verschijnen. De splijting reactie is afgewerkt in 10-20 min. De Western Blot (WB) is te traag om te controleren de splitsingsproducten reactie efficiënt, maar het is opgenomen in de afbeelding ter referentie en om aan te tonen van de volledigheid van het SUMO splijten. Beide Httex1 23Q en 43Q kunnen worden gescheiden van het zijn goed6-SUMO tag door RP-HPLC (Figuur 2C) en werden verkregen in hoge zuiverheid, zoals blijkt uit de UPLC, MS en SDS-pagina analyse (Figuur 2D).
Om te illustreren dat de proteïnen van de Httex1 bereid door deze methode blijven de eigenschappen van de verwachte aggregatie van Httex1, we de kinetiek van de fibrillization van mutant Httex1 bij 37 ° C beoordeeld door een sedimentatie assay, bewaakt de wijzigingen in de secundaire structuur door CD spectroscopie, en de morfologie van de aggregaten door TEM gekenmerkt. Een representatieve gegevensset van de kinetiek van de aggregatie van de vorming van de fibril van de mHttex1 zoals bepaald door een sedimentatie assay is afgebeeld inFiguur 3A. Het verlies van oplosbare Httex1 43Q na verloop van tijd ontstaan door de vorming van de fibril werd gekwantificeerd door UPLC. We zien een volledige uitputting van oplosbaar eiwit na 48 uur incubatie. Daarnaast vastgesteld we de secundaire structuur van de eiwitten door CD spectroscopie (Figuur 3B). Httex1 43Q verschuivingen van ongestructureerde (λmin 205 nm) naar voornamelijk β-sheet rijke conformatie (λmin 215 nm) na 48 uur incubatie. Deze structurele wijziging gaat gepaard met de vorming van de lange fibrillar aggregaten als waarneembare door TEM 48 uur (Figuur 3C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig1.jpg"> Figuur 1 . Meningsuiting en zuivering van de zijn6-SUMO Httex1 fusieproteïne.  (A) de volgorde van de aminozuur van het zijn6-SUMO-Httex1-QN fusion constructies (zijn6-SUMO in groen en Httex1-QN in oranje); (B) schematisch overzicht van de expressie en de zuivering van de fusieproteïne; (C) SDS-pagina-analyse van de expressie en de oplosbaarheid van de fusieproteïne na lysis; (D) Chromatogram van de IMAC zuivering van de fusieproteïne en analyse van de breuken door SDS-PAGE (rode balk: niet-afhankelijke, blauwe deelteken: wassen breuk, zwarte bar: breuken met de elutie piek); <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig2.jpg"> Figuur 2 . Splitsing van het zijn6 SUMO tag en zuivering van label-gratis Httex1-QN eiwitten. (A) schematisch overzicht; (B) analyse van de splitsing van de SUMO-tag met ULP1 door UPLC (blauwe: vóór toevoeging van ULP1; zwart: 20 min (23Q), respectievelijk 10 min (43Q) na toevoeging van ULP1) en WB (MAB5492 1:2000, secundaire geit anti muis antilichaam 1:5000); (C) Chromatogram van de voorbereidende RP-HPLC zuivering van Httex1; D: analyse van het gezuiverde Httex1 door UPLC, SDS-pagina en ESI-MS; de verwachte molecuulgewicht is respectievelijk 9943 Da (23Q) en 12506 Da (43Q). <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig3.jpg"> Figuur 3 . Samenvoeging van Httex1-43Q: (A) sedimentatie assay gebaseerd op UPLC. (B) CD spectra van de secundaire structuur bij 0 uur en 48 h. (C) TEM microfoto van de aggregaten in 48 h (schaal bars zijn 200 nm). <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy at JoVE.com

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

Hier presenteren we een robuust en geoptimaliseerde protocol voor de productie van milligram hoeveelheden native, tag-vrije monomeren en fibrillen van de exon1 van het eiwit Huntingtin (Httex1) op basis van de voorbijgaande fusie van kleine ubiquitin verwante modifier (SUMO).

Generatie van eigen, niet-gecodeerde Huntingtin Exon1 monomeer en fibrillen met behulp van een SUMO Fusion strategie

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identificatie van kleine synthetische molecules bindende eiwitten in een Inheemse cellulaire omgeving door live-cell fotoaffiniteitslabeling

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Het oplossen van Affiniteit gezuiverde eiwit complexen door Blue inheemse PAGE en Protein Correlatie Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Analyse van supercomplexen van de Mitochondrial Electron Transport Chain met Native Electrophoresis, In-gel Assays, en Electroelution

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Fractionering voor oplossing van oplosbare en onoplosbare Huntingtin soorten

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Vastleggen en identificatie van RNA-bindende proteÃ¯nen met behulp van klik chemie-bijgewoonde RNA-interactome vangen (CARIC) strategie

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Gebruik van recombinante Fusion eiwitten in een fluorescerende Protease Assay Platform en hun In-gel renaturatie

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Hybride duidelijke/blauwe inheemse elektroforese voor de scheiding en de analyse van mitochondrial Ademhalingsketen supercomplexen

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

Een strategie om verbindingen te identificeren die van invloed zijn op de celgroei en overleving in gekweekte zoogdiercellen bij een lage tot matige doorvoer

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Lokalisatie van SUMO-gemodificeerde eiwitten met behulp van fluorescerende Sumo-trapping eiwitten

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interacties met en membraan Permeabilization van de mitochondriën van de hersenen door amyloid fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...