Name: generation of native, untagged huntingtin exon1 monomer and fibrils using a sumo fusion strategy
Uploaded: 2018-06-27T13:30:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy at JoVE.com

עבודה זו מומן בעיקר על ידי מענקים קרן CHDI, הקרן הלאומית למדע שוויצרי. אנו מודים ד ר סופי Vieweg לדיונים שימושי במהלך הפיתוח של מערכת חדשה זו הביטוי ואת שאר חברי הקבוצה Lashuel לשיתוף ניסיונם עם מערכת זו ביטוי ועל המשוב שלהם קלט ובעל ערך. אנו מודים גם פרופסור אוליבר Hantschel עבור מספקים את פלסמיד ULP1. המחברים תודה ד ר ג'ון B. וורנר, ד ר יצחק ק' Thangaraj על סקירה ביקורתית של כתב היד

המחברים מצהירים כי יש להם שאין ניגודי אינטרסים עם התוכן של מאמר זה.

ב פרוטוקול זה, אנחנו המחולקות הליך יעיל עבור להשיג כמויות מיליגרם של מקורי, לא מתויגות Httex1 המכילים שאריות גלוטמין 23 או 43. דבר זה הושג על ידי הבעת Httex1 כמו פיוז'ן C-מסוף כדי שלו6-סומו תג, אשר משמש כדי לבודד את חלבון כימרי מהתא lysate על ידי ה-IMAC הוא ביקע לפני טיהור HPLC של Httex1. ואילו האסטרטגיה סומו שימש בייצור של מספר חלבונים אחרים, השיטה שלנו מראה כי תכונותיו הייחודיות שסומו יכול לשמש גם כדי ליצור ממהותם מגרה, צבירת-מועדים, חלבון amyloidogenic הוכחו בעבר קשה מאוד לטפל ולהפיק43,44. אנו מציגים פרוטוקול זה פשוט, קל לשימוש, להשוות פרוטוקול לדור של חלבון "נאותה". פיוז'ן סומו solubilizes ומייצב Httex1 במהלך השלב טיהור IMAC וביטוי. פצילות מוקדמת של התג, כפי שנצפה עם אסטרטגיה intein10 , צבירת היו כבר לא בעיה.
חלבונים ממהותם המתוסבכים פגיעים במיוחד השפלה. בעוד N-מסוף השפלה באזור N17 אינה בעיה באמצעות פרוטוקול זה, truncations של ההקלטה של Httex1 יכול להתרחש. החלבונים קטום דומים מאוד Httex1 hydrophobicity, תשלום, בגודל, הסרתם באמצעים כרומטוגרפי הוא מאתגר, ולכן עדיף למנוע היווצרות שלהם מלכתחילה. נצמדים היטב הפרוטוקול, תמיד עובד על הקרח ושימוש כמות מספקת של מעכבי פרוטאז אמור לעזור לשמור על הרמה של החיתוך שנצפה נמוך מאוד. החלת תג פיוז'ן ב C-הסופית של Httex1 יכול להסיר truncations ההקלטה בקלות כמו החלבון קטום יפסיד תג קירבה. עם זאת, אם הרצף המקורי צריך להיות מתוחזק שאין אפשרות להחיל את אפשרות זו כפי Httex1 מסתיים עם פרולין, לפי מיטב ידיעתנו ישנם אין תגיות פיוז'ן C-מסוף ידועים לזירוז פצילות traceless ויעילה לאחר פרולין.
החלק הקריטי ביותר של הפרוטוקול הוא טיפול Httex1 משוחררת לאחר המחשוף של התג סומו ע י ULP1. החלבון צריך להיטהר באופן מיידי על-ידי RP-HPLC. למרבה המזל, זה לתגובה, מהיר ויעיל, בדרך כלל שהושלמו ב- 10-20 דקות ב 4 º C. לעומת זאת, האסטרטגיה intein נדרש מספר שעות למחשוף מלאה של intein, וכך מצריכים פשרה בין תחילת צבירת המחשוף לא שלם על מנת למקסם את התשואה. בדיקה מהירה נדרשת עבור מוטציה Httex1, כמו זה יהיה להתחיל לצבור על הריכוז הגבוה יחסית נוכח התגובה המחשוף, ואילו הגרסה 23Q יציב למשך זמן ארוך יותר. במהלך הטיהור RP HPLC, יתרון נוסף של סומו הופך לכאורה: בעוד intein DnaB Ssp דוחה מים נדבק בחריפות העמודה, סומו הוא יותר הידרופיליות, elutes לחלוטין מן העמודה הפוך-פאזי C4. ULP1 מסחרי אמנם קצת יותר יקר, החלבון יכול להיות בקלות מיוצר תשואה גבוהה בעקבות פרוטוקולים שפורסמו בעבר29.
חשיבות קריטית החלת נוהל disaggregation לפני שימוש Httex1 לא יכול להיות מתוח מספיק. Lyophilized polyQ חלבונים כגון Httex1 יציבים, יכולים להיות מאוחסנים תקופות ארוכות, אך אינם לגמרי מסיסי מים, מאגרי. הנוכחות של preformed oligomers או הסיבים יכול להיות השפעה משמעותית על צבירת קינטיקה ומאפיינים ביופיזיקלי חלבון45. פרוטוקול disaggregation המתוארים כאן מאפשר את disaggregation של החלבון, הסרה של אגרגטים preformed, דור של פתרון של Httex1 monomeric מתוך מדגם lyophilized. הבחנו מורפולוגיה קינטיקה, fibril צבירת דומה עבור Httex1 שהושג עם בגלל הסומו ואסטרטגיה intein.
לעומת שיטות קודמות לייצור Httex1, האסטרטגיה סומו המתוארים כאן מציעה מספר יתרונות, מרחיבה את מגוון מחקרים ניתן לחקור את מבנה ומאפייני פונקציונלי של חלבון זה על בריאות ומחלה. החלבון פיוז'ן סומו-Httex1 קל לטפל, שניתן יהיה קפוא, לאחסן או שמרו על פתרון עבור 24 שעות בטמפרטורת החדר, בעוד mHttex1 חינם צבירה במהירות. יציבות, המסיסות גבוהה החלבונים פיוז'ן סומו-Httex1 מספקים גמישות רבה יותר לתמרן החלבון ו/או להציג את השינויים אנזימטי והכימיות לתוך mHttex1 שאחרת לא היה אפשרי לאחר המחשוף. זה כולל המבוא של שינויים post-translational, fluorophores, ספין תוויות, ביוטין תגיות, וכו ' ההתקדמות המובאת כאן צריך 1) לקדם מחקרים עתידיים התירי קשרי גומלין מבנה פונקציה של Httex1; 2) ליצור כלים חדשים לחקור Htt צבירת והפצת פתולוגיה; 3) לאפשר הפיתוח של מבחני חדש לזיהוי מולקולות לייצב את המוטציה Httex1 ולמנוע צבירת שלה; . ו-4) לעודד מדענים מתחומים אחרים להביא לעבוד על חלבון זה ולהצטרף החיפוש שלנו כדי למצוא תרופות עבור מחלת הנטינגטון.

Htt הוא חלבון 348 kDa, היה מעורב פונקציות פיזיולוגיים מספר1. Htt כוללת אזור polyQ המורחב של שאריות יותר מ 36 אמיני שלה, היא גורמת HD2,3. פתולוגיה HD מאופיין תכלילים הסלולר סטריאטום ואת קליפת המוח, אשר מוביל למוות עצביים, ניוון של רקמות המושפעת4,5. מספר קטעים N-מסוף Htt המכילים את דרכי חזרה polyQ זוהו במוח פוסט-מורטם מחולים HD, הם חשבו להיות שנוצר על-ידי עיבוד הפרוטאוליטי של חלבון huntingtin6. מחקרים שנעשו לאחרונה מראים כי Httex1 גם יכול להיווצר עקב החדרת ה-mRNA חריגה. Httex1 מכיל את המוטציה polyQ פתולוגית, שלה ביטוי אצל בעלי חיים יכולים לסכם רבים של התכונות העיקריות של HD7, ובכך הארת תפקיד מרכזי אפשרי של קטע זה ב HD פתולוגיה ומחלות התקדמות6, 8,9.
עקב צבירת גבוהה נטיה של מוטציה Httex1 (mHttex1) עם polyQ המורחב בדרכי, הרוב המכריע של מערכות קיימות ביטוי מבוססים על הפיוז'ן ארעית של Httex1 חלבונים (כגון גלוטתיון-S-טרנספראז (GST), thioredoxin (TRX) או מלטוז-מחייב-חלבון (MBP) ו/או פפטידים (פולי-היסטידין) באופן שונה לשפר את הביטוי, יציבות, טיהור ו/או מסיסות10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. הזוג פיוז'ן מקושר Httex1 עם רצף קצר המכיל אתר המחשוף פרוטאזות כמו טריפסין, tabacco לחרוט פרוטאז וירוס (אס) או PreScission כדי לאפשר המחשוף ושחרור של Httex1 לפני אתחול של צבירת או טיהור. החסרונות של שיטות אלה כוללים את האפשרות להשאיר משקעים נוספים בשל מחשוף traceless ויצירת של קטעים שנחתכו עקב miscleavage בתוך הרצף של Httex1, בנוסף הטרוגניות עקב המחשוף לא שלם ( ראה Vieweg et al. . לדיון מעמיק יותר על היתרונות ועל המגבלות של גישה זו)10. כדי לטפל מגבלות אלה, שפיתחנו לאחרונה אסטרטגיית הבעה המאפשרת את הדור של Httex1 ללא תג מקורית בפעם הראשונה על-ידי ניצול פיוז'ן N-מסוף ארעית של Synechocystis sp. (Ssp) Intein DnaB Httex110. בעוד המחשוף intein הוא traceless, מדויקת, התשואות mg בכמות החלבונים, היא עדיין סובלת שני החסרונות יכול להפחית את התשואה: כלומר, מוקדמת המחשוף של intein אשר יכול להתרחש במהלך הביטוי, ואת העובדה המחשוף מתרחשת מעל שעות מספר, אשר יכול להוביל לאובדן חלבון עקב צבירת, במיוחד עבור Httex1 עם polyQ המורחב חזרה.
כדי לטפל מגבלות אלה וכדי לחדד את האסטרטגיה שלנו לייצור של מקורי, ללא תג Httex1, פיתחנו מערכת ביטוי חדשה המבוססת על הפיוז'ן ארעית של הסומו, יותר בדיוק השמרים homolog Smt3 כדי Httex1. היישום של מערכת סומו לייצור של חומרים פורסם לראשונה ב 200429, שבה הודגם שיעור מוגבר של הביטוי, המסיסות של חלבון כימרי סומו. יכול להיות ביקע התג סומו מאת אוביקוויטין כמו חלבון ספציפי פרוטאז 1 (ULP1), אשר אינו דורש אתר הכרה, אבל מזהה את מבנה שלישוני של סומו, למעשה מבטלת את האפשרות של miscleavage30. יתר על כן, המחשוף בתיווך ULP1 מהיר, traceless, אינו משאיר משקעים נוספים. המחשוף מוקדמת של התג פיוז'ן, כפי שנצפה עם autocatalytic intein10, לחלוטין נמנעת על ידי הדרישה פרוטאז חיצוניים. ואילו האסטרטגיה סומו משמש כיום נרחב חלבון רקומביננטי ייצור31,32,33, נדגים בעיתון הזה שזה שימושי במיוחד עבור הדור של המתוסבכים מיסודה, חלבון amyloidogenic נוטה צבירה, כגון Httex1. אנו מאמינים כי פשטות, יעילות ועמידות בשיטה שלנו סומו-פיוז'ן מבוססי להפוך Httex1 מקורי, ללא תג יותר נגיש חוקרים מדיסציפלינות שונות מסלק את הצורך להשתמש שנוצרה רצפים של Httex1 במבחנה . זה מקדמה חשובה זה יקל על מחקרים עתידיים להבהיר את הקשר מבנה פונקציה של Httex1.
הפרוטוקול מתאר הטיהור של Httex1 מ L 12 של התרבות חיידקי, אך הפרוטוקול יכול להתאים בקלות להפקות בקנה מידה קטן או גדול יותר. הפרוטוקול מתאר את הייצור של פראי סוג Httex1 (wtHttex1) עם polyQ אני חוזר אורך מתחת (23Q), מוטציה Httex1 (mHttex1) עם polyQ חוזר אורך לעיל (43Q) הסף פתוגניים (36Q).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1585px;" width="1585">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:443px;">Uranyl formate (UO2(CHO2)2)</td>
			<td style="width:193px;">EMS</td>
			<td style="width:124px;">22450</td>
			<td style="width:825px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formvar/carbon 200 mesh, Cu 50 grids</td>
			<td>EMS</td>
			<td>FCF200-Cu-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Precision Cell made of Quartz SUPRASIL 1 mm light path from Hellma Analytics</td>
			<td>HellmaAnalytics</td>
			<td>110-1-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buffer Substance Dulbecco&#39;s (PBS w/o Ca and Mg) ancinne ref 47302 (RT) SERVA</td>
			<td>Witech</td>
			<td>SVA4730203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicillin</td>
			<td>AxonLab</td>
			<td>A0839.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luria Broth (Miller&#39;s LB Broth)</td>
			<td>&#160;Chemie Brunschwig</td>
			<td>1551.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>AxonLab</td>
			<td>A1008.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E. coli B ER2566</td>
			<td>NEB</td>
			<td>NEB# E4130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56750-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cOmplete&#160;Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Huntingtin Antibody, a.a. 1-82</td>
			<td>Merck Millipore Corporation</td>
			<td>MAB5492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H + L)</td>
			<td>Licor</td>
			<td>925-68070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMSF</td>
			<td>AxonLab</td>
			<td>A0999.0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HisPrep 16/10 column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28936551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">C4 HPLC column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00G-4168.P0</td>
			<td>&#160;&#160;&#160; 10 &#181;m C4 300 &#197;, LC Column 250 x 21.2 mm, Phenomenex, 19x10 mm guard column, not temperature jacketed</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile HPLC</td>
			<td>MachereyNagel</td>
			<td>C2502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filtre seringue Filtropur S 0,45 ul sans prefiltre sterile</td>
			<td>Sarstedt AG</td>
			<td>83.1826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectrophotometer semi-micro cuvette</td>
			<td style="width:193px;">Reactolab S.A.</td>
			<td>2534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superloop, 1/16&#34; fittings (&#196;KTAdesign), 50 ml</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>18111382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>302031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GREINER Tubes fo FPLC 16 x 100 mm, cap. 12.0 ml</td>
			<td style="width:193px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>7.160 102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;100 kD Microcon&#160; fast flow filters</td>
			<td style="width:193px;">Merck Millipore Corporation</td>
			<td>MRCF0R100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vibra-cell VCX130 ultrasonic liquid processor</td>
			<td>Sonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#196;kta 900 equipped with a fraction collector&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Jasco J-815 Circular Dichroism</td>
			<td>Jasco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters UPLC system&#160;</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>C8 BEH acquity 2.1x100 mm 1.7 micron column&#160; , preheated column (40 &#176;C), flow rate of 0.6 mL/min, injection volume of 4 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">waters HPLC system</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>2489 UV detector and 2535 quaternary gradient module, 20 mL loop in a FlexInject housing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ESI-MS: Finnigan LTQ</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">lyophylizer instrument</td>
			<td>FreeZone 2.5 Plus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tecnai Spirit BioTWIN&#160;</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td>electron microscope equipped with a LaB6 gun and a 4K x 4K FEI Eagle CCD camera (FEI) and operated at 80 kV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C shaking&#160; incubator</td>
			<td>Infors HT multitron Standard</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biophotometer plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of native, untagged huntingtin exon1 monomer and fibrils using a sumo fusion strategy

מחלת הנטינגטון (HD) היא מחלה תורשתית ניווניות קטלנית הנגרמת על ידי הרחבה החטיבה (≥36) ב אקסון הראשון של הגן HD, והתוצאה היא הביטוי של החלבון Huntingtin (Htt) או N-מסוף קטעים הימנו עם (polyglutamine המורחב מתיחה polyQ).
Exon1 של החלבון Huntingtin (Httex1) נמצא השבר Htt הקטן ביותר זה recapitulates רבות מהתכונות של HD בסלולר, חיה מודלים, נמנה שברי למדה הנפוצים Htt. גודל קטן של Httex1 הופך השפעול יותר נוטה biophysical אפיון באמצעות טכניקות סטנדרטי, רזולוציה גבוהה לעומת קטעים ארוכים או Htt באורך מלא. עם זאת, צבירת גבוהה נטיה של מוטציה Httex1 (mHttex1) עם תוכן מוגבר polyQ (≥42) הפכה אותו קשה לפתח ביטוי יעילה ומערכות טיהור לייצר חלבונים אלה בכמויות מספיקות ולגרום להם נגיש מדענים מתחומים שונים ללא שימוש פיוז'ן חלבונים או שיטות אחרות שמשנות את רצף מקורית של החלבון. אנו מציגים כאן שיטה חזקה ממוטב הייצור של כמויות מיליגרם של ילידים, תג בחינם Httex1 מבוסס על הפיוז'ן ארעית של צירוף קשורים אוביקוויטין קטן (סומו). הפשטות והיעילות של האסטרטגיה יבטל את הצורך להשתמש שנוצרה רצפים של Httex1, ובכך הפיכת חלבון זה יותר נגיש לחוקרים ושיפור הפארמצבטית את הניסויים בין מעבדות שונות. אנו מאמינים כי ההתפתחויות הללו גם יקל על מחקרים עתידיים מכוון שחקרתי את הקשר מבנה פונקציה של Htt וכן בפיתוח כלי אבחון הרומן של טיפולים לטיפול או להאט את ההתקדמות של HD.

Httex1 מתבטאת e. coli עם N-מסוף שלו6-סומו תג. התוצאות נציג של הביטוי, טיהור של החלבון פיוז'ן מסוכמות באיור1. רצף Httex1 מורכב שאריות 2-90 Htt ומתחיל עם Ala2, כי Met1 מלא cleaved ויוו42. המספור חומצות אמינו מתייחסת 23Q variant, הסדרה מלאה של החלבון פיוז'ן ביטוי מוצג איור 1א'. פלסמידים יופקד אצל Addgene בעתיד הקרוב לשיתוף עם הקהילה. תיאור סכמטי של פלסמיד ואת החלבון פיוז'ן ביטוי מוצג באיור 1ב'. Httex1 His6-סומו מבטאת ברמה בינונית (איור 1C), רוב החלבון היתוך הוא נוכח השבר מסיסים לאחר פירוק, גם את 23Q וגם את הווריאציה 43Q. החלבון פיוז'ן נודד גבוה מהצפוי, מבוסס על משקל מולקולרי. זה בין השאר בשל העדר חזקה של סומו אלא בעיקר בגלל ההרכב רצף חריג של Httex1, המכיל בעיקר שאריות וגם גלוטמין פרולין. את wildtype (23Q) והן החשבונאי (43Q) חלבון כימרי יכול להיות מועשר לטוהר ~ 80% על-ידי IMAC (איור 1D) הנוכחות של שיתוף טיהור מארח חלבון יכולה להיות מוסברת על-ידי רמת ביטוי נמוך יחסית של Httex1, המדגם גדול נפח חלה על העמודה.
המחשוף שלו6-סומו תג ולטיהור Httex1 מוצג באיור 2א. UPLC הוא כלי יעיל כדי לנטר את המחשוף שלו6-סומו תג (איור 2B). הפסגה המקורי של החלבון היתוך הוא נצרך ושל פסגות חדשות, מופרדים היטב שני המקביל שלו6-תג סומו, Httex1 מופיעים. התגובה המחשוף מסתיים בעוד 10-20 דקות. המערבי כתם (WB) הוא איטי מדי לפקח ביעילות את התגובה המחשוף, אבל זה כבר נכלל באיור לעיון וכדי להדגים את שלמות התרגום של המחשוף סומו. שני Httex1 23Q ו- 43Q ניתן להפריד מנקודת מבט שלו6-סומו תג על ידי RP-HPLC (איור 2C), התקבלו אצל טוהר גבוהה, כפי שהראה UPLC, MS וניתוח מרחביות-דף (איור 2D).
כדי להמחיש כי החלבונים Httex1 שהוכנו על ידי שיטה זו לשמור על המאפיינים צבירת הצפוי של Httex1, אנחנו לאומדן של קינטיקה fibrillization של מוטציה Httex1 ב 37 מעלות צלזיוס וזמינותו שיקוע, פיקוח שינויי מבנה שניוני באמצעות תקליטור ספקטרוסקופיה, מאופיין המורפולוגיה של מצרפי מאת TEM. ערכת נתונים נציג של קינטיקה צבירת היווצרות fibril mHttex1 כפי שנקבע על ידי וזמינותו שקיעת מוצגבאיור 3א. אובדן מסיסים Httex1 43Q לאורך זמן, עקב היווצרות fibril היה לכמת על-ידי UPLC. אנו מבחינים של דלדול מלא של חלבון מסיס לאחר 48 שעות של דגירה. בנוסף, אנחנו נקבע את מבנה שניוני של החלבון על ידי תקליטור ספקטרוסקופיה (איור 3ב). Httex1 43Q משמרות החל לא מובנים (λmin 205 nm) כדי בעיקר β-גיליון עשיר קונפורמציה (λmin 215 ננומטר) לאחר 48 שעות של דגירה. השינוי המבני הזה מלווה היווצרות של אגרגטים זמן fibrillar כמו הנצפה על ידי TEM ב 48 שעות (איור 3ג').
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig1.jpg"> איור 1 . הביטוי ולטיהור שלו6-חלבון כימרי סומו Httex1.  (א) שלו על רצף חומצות אמיניות6-סומו-Httex1-QN פיוז'ן בונה (שלו6-סומו ירוק ו- Httex1-QN ב orange); (B) סקירה סכמטי של הביטוי, טיהור של החלבון פיוז'ן; (ג) אנליזה מרחביות-דף של הביטוי, המסיסות החלבון פיוז'ן לאחר פירוק; (ד) Chromatogram של הטיהור IMAC של החלבון פיוז'ן וניתוח של שברים מאת מרחביות-דף (הבר באדום: שבר לא מאוגד, בלו בר: שטיפת שבר, שחור בר: שברים המכיל הפסגה • תנאי); <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig2.jpg"> איור 2 . המחשוף שלו6 טיהור החלבונים Httex1-QN ללא תגית ותגית סומו. סקירה סכימטי (א); (B) ניתוח של המחשוף של התג סומו עם ULP1 על ידי UPLC (כחול: לפני תוספת של ULP1; שחור: 20 דקות (23Q), בהתאמה 10 דקות (43Q) לאחר תוספת של ULP1) ו WB (MAB5492 1:2000, עז משני אנטי עכבר נוגדן 1:5000); (ג) Chromatogram של הטיהור RP-HPLC מפוח של Httex1; D: ניתוח Httex1 מטוהרת על-ידי UPLC, למען חברה דמוקרטית-דף ו- ESI-MS; משקל מולקולרי הצפוי הוא 9943 Da (23Q) ודה 12506 (43Q) בהתאמה. <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig3.jpg"> איור 3 . צבירה של Httex1-43Q: assay שיקוע (A) מבוסס על UPLC. (B) CD ספקטרום של המבנה משני הו ו 48 ה (ג) micrographs TEM של מצרפי-48 שעות (סולם ברים הם 200 ננומטר). <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy at JoVE.com

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ממוטבת ועמיד לייצור כמויות מיליגרם של מונומרים מקורי, ללא תג, הסיבים של exon1 של החלבון Huntingtin (Httex1) המבוסס על הפיוז'ן ארעית של צירוף קשורים אוביקוויטין קטן (סומו).

דור של Huntingtin Exon1 טבעית, לא מתויגות מונומר, הסיבים משתמש באסטרטגיה פיוז'ן סומו

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

זיהוי של חלבונים קושרי מולקולה קטנים בסביבה נייד Native ידי תיוג Live- תא Photoaffinity

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

ניתוח Supercomplexes של Mitochondrial אלקטרונים שרשרת התחבורה עם אלקטרופורזה הילידים, ב-מבחני ג&#39;ל, ו Electroelution

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Fractionation רזולוציה של מינים Huntingtin מסיסים ובחלקם לא מסיסים

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

לכידת וזיהוי של RNA-מחייב חלבונים באמצעות לחץ בסיוע כימיה RNA-interactome ללכוד אסטרטגיה (CARIC)

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

השימוש פיוז'ן רקומביננטי חלבונים פלטפורמה Assay פרוטאז פלורסנט, Renaturation שלהם בג'ל

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

אלקטרופורזה היברידית ברורה/כחולה עבור הפרדה וניתוח של שרשרת נשימה מיטוכונדריאלי מערכות-העל

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

אסטרטגיה לזיהוי תרכובות המשפיעות על צמיחת תאים והישרדות בתאי מיונקים מתורבתים בתפוקה נמוכה לבינונית

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

לוקליזציה של חלבונים ששונו באמצעות סומו פלורסנט-השמנה חלבונים

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

אינטראקציות עם חדירות ממברנה של המיטותית המוח על ידי עמילואיד Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...