Name: generation of native, untagged huntingtin exon1 monomer and fibrils using a sumo fusion strategy
Uploaded: 2018-06-27T13:30:00
Duration: 11 min 22 s
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इस काम के CHDI फाउंडेशन और स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन से अनुदान द्वारा मुख्य रूप से वित्त पोषित किया गया । हम इस नई अभिव्यक्ति प्रणाली और इस अभिव्यक्ति प्रणाली के साथ अपने अनुभव बांटने के लिए और उनके इनपुट और बहुमूल्य प्रतिक्रिया के लिए Lashuel समूह के अंय सदस्यों के विकास के दौरान उपयोगी विचार विमर्श के लिए डॉ सोफी Vieweg धंयवाद । हम भी ULP1 प्लाज्मिड प्रदान करने के लिए प्रो ओलिवर Hantschel धंयवाद । लेखकों ने डॉ जॉन बी वार्नर और डॉ सेंथिल Thangaraj की पांडुलिपि की महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए धंयवाद

लेखकों की घोषणा है कि वे इस लेख की सामग्री के साथ ब्याज की कोई संघर्ष है ।

इस प्रोटोकॉल में, हम मूल, untagged Httex1 जिसमें 23 या ४३ glutamine अवशेषों की मिलीग्राम मात्रा प्राप्त करने के लिए एक कुशल प्रक्रिया को रेखांकित किया है । यह एक सी के रूप में व्यक्त Httex1 द्वारा प्राप्त किया गया था टर्मिनल एक अपने6-सूमो टैग, जो IMAC द्वारा lysate सेल से फ्यूजन प्रोटीन अलग किया जाता है और Httex1 के HPLC शोधन से पहले सट जाता है । जबकि सूमो रणनीति कई अंय प्रोटीन के उत्पादन में इस्तेमाल किया गया है, हमारे विधि से पता चलता है कि अद्वितीय गुण सूमो भी आंतरिक रूप से परिक्रमा उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, एकत्रीकरण प्रवण, amyloidogenic प्रोटीन है कि पहले से साबित कर दिया है बेहद मुश्किल से संभाल और४३,४४का उत्पादन । हम एक प्रोटोकॉल है कि सीधा है, का उपयोग करने के लिए आसान है और एक "अच्छी तरह से व्यवहार" प्रोटीन की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल के तुलनीय उपस्थित । सूमो फ्यूजन solubilizes और स्थिर Httex1 अभिव्यक्ति के दौरान और IMAC शुद्धिकरण कदम । टैग के समय से पहले दरार, के रूप में intein रणनीति10 और एकत्रीकरण के साथ मनाया अब एक मुद्दा थे ।
आंतरिक रूप से परिक्रमा प्रोटीन विशेष रूप से गिरावट को कमजोर कर रहे हैं । N17 क्षेत्र में N-टर्मिनल क्षरण इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर कोई समस्या नहीं है, जबकि Httex1 के PRD में जनचेतना हो सकता है । के रूप में कटा हुआ प्रोटीन बहुत hydrophobicity, प्रभारी और आकार में Httex1 के समान हैं, उंहें क्रोमेटोग्राफिक मतलब से हटाने के चुनौतीपूर्ण है, इस प्रकार यह सबसे अच्छा है पहली जगह में उनके गठन को रोकने के लिए । प्रोटोकॉल को बारीकी से चिपके रहते हैं, हमेशा बर्फ पर काम कर रहे है और एक पर्याप्त राशि का उपयोग करने के लिए तंग अवरोधक मनाया जनचेतना का स्तर बहुत कम रखने में मदद करनी चाहिए । Httex1 के C-टर्मिनस पर फ्यूजन टैग लगाने से PRD में जनचेतना को आसानी से हटा सकता है क्योंकि कटा हुआ प्रोटीन समानता टैग को भी खो देगा । हालांकि, अगर देशी अनुक्रम को बनाए रखने की जरूरत है इस विकल्प के रूप में लागू नहीं किया जा सकता Httex1 के साथ समाप्त होता है और हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा वहाँ कोई सी-टर्मिनल फ्यूजन टैग कि रेखांकित करने के बाद स्ट्रेस और कुशल दरार के लिए प्रेरित करने के लिए जाना जाता है कर रहे हैं.
प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा ULP1 द्वारा सूमो टैग के क्लीवेज के बाद मुक्त Httex1 की हैंडलिंग है । प्रोटीन को तुरंत आरपी-HPLC द्वारा शुद्ध किया जाना चाहिए । सौभाग्य से, यह एक कुशल और तेजी से प्रतिक्रिया है कि आम तौर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 10-20 मिनट में पूरा हो गया है । इसके विपरीत, intein रणनीति intein की पूरी दरार के लिए कई घंटे की आवश्यकता है, इस प्रकार एक व्यापार की आवश्यकता होती है अधूरा दरार और शुरुआत एकत्रीकरण के बीच बंद क्रम में उपज को अधिकतम करने के लिए । एक तेजी से workup उत्परिवर्ती Httex1 के लिए आवश्यक है, के रूप में यह एक लंबे समय के लिए स्थिर है, जबकि दरार प्रतिक्रिया में मौजूद अपेक्षाकृत उच्च एकाग्रता पर कुल करने के लिए शुरू हो जाएगा । आरपी-HPLC शुद्धि के दौरान, सूमो का एक और लाभ स्पष्ट हो जाता है: जबकि एसएसपी DnaB intein hydrophobic है और स्तंभ के लिए दृढ़ता से चिपक जाती है, सूमो अधिक हाइड्रोफिलिक और elutes पूरी तरह से C4 उलट-चरण कॉलम से है । हालांकि वाणिज्यिक ULP1 काफी महंगा है, प्रोटीन आसानी से उच्च उपज में पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल29निंनलिखित का उत्पादन किया जा सकता है ।
Httex1 का उपयोग करने से पहले एक विसमुच्चय प्रोटोकॉल लागू करने के महत्वपूर्ण महत्व पर पर्याप्त जोर नहीं दिया जा सकता । Lyophilized polyQ प्रोटीन जैसे Httex1 स्थिर होते हैं और इन्हें लंबे समय तक संग्रहित किया जा सकता है, लेकिन पानी में पूरी तरह घुलनशील नहीं होते और ये बफ़र्स होते हैं । क्षेऽ oligomers या तंतुओं की उपस्थिति के एकीकरण कैनेटीक्स और प्रोटीन४५के भौतिक गुणों पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है । यहां वर्णित समुच्चय प्रोटोकॉल प्रोटीन के विघटन, एक lyophilized नमूना से monomeric Httex1 के एक समाधान के अनुरूप समुच्चय और पीढ़ी को हटाने की अनुमति देता है । । हम सुमो और intein रणनीति के साथ प्राप्त Httex1 के लिए समान एकत्रीकरण कैनेटीक्स और फाइब्रिल आकृति विज्ञान मनाया ।
Httex1 उत्पादन के लिए पिछले तरीकों की तुलना में, सूमो रणनीति यहां वर्णित कई लाभ प्रदान करता है और संभव अध्ययन की सीमा का विस्तार और स्वास्थ्य और रोग में इस प्रोटीन के कार्यात्मक गुण की जांच । सूमो-Httex1 फ्यूजन प्रोटीन को संभालने के लिए आसान है, यह जमे हुए और संग्रहीत किया जा सकता है या समाधान में 24 घंटे के लिए परिवेश के तापमान पर रखा, जबकि मुक्त mHttex1 समग्र होगा जल्दी । घुलनशीलता की स्थिरता और उच्च सूमो-Httex1 फ्यूजन प्रोटीन अधिक लचीलापन प्रदान करने के लिए हेरफेर प्रोटीन और/या mHttex1 में एंजाइमी और रासायनिक संशोधनों कि अंयथा संभव नहीं होगा परिचय के बाद क्लीवेज । इसमें पोस्ट-शोधों के संशोधनों, fluorophores, स्पिन लेबल, बायोटिन टैग आदि की शुरूआत शामिल है । यहां प्रस्तुत अग्रिम 1 चाहिए) स्पष्ट संरचना करने के लिए भविष्य के अध्ययनों की सुविधा-Httex1 के फंक्शन रिश्ते; 2) Htt एकत्रीकरण और विकृति प्रसार की जांच करने के लिए नए उपकरण उत्पन्न; 3) नए परख के विकास के लिए सक्षम अणुओं की पहचान है कि उत्परिवर्ती Httex1 स्थिर और उसके एकत्रीकरण को रोकने; और 4) अंय क्षेत्रों से वैज्ञानिकों को प्रोत्साहित करने के लिए इस प्रोटीन पर काम और हमारे खोज में शामिल होने के लिए है Huntington रोग के लिए इलाज मिल ले आओ ।

Htt एक ३४८ केडीए प्रोटीन है और कई शारीरिक कार्यों में फंसाया गया है1. जब Htt अपने N-टर्मिनस में ३६ से अधिक अवशेषों का एक विस्तारित polyQ क्षेत्र होता है, यह HD2,3का कारण बनता है । HD विकृति striatum और प्रांतस्था में सेलुलर शामिल किए जाने की विशेषता है, जो न्यूरॉन्स की मौत और प्रभावित ऊतकों के शोष की ओर जाता है4,5. कई एन टर्मिनल Htt टुकड़े कि polyQ दोहराने पथ होते है HD रोगियों से पोस्ट-मार्टम दिमाग में पता लगाया गया है और huntingtin प्रोटीन6के proteolytic प्रोसेसिंग द्वारा उत्पंन किया जा करने के लिए लगा रहे हैं । हाल के अध्ययनों से सुझाव है कि Httex1 भी ंयायपालिका mRNA ब्याह के कारण गठन किया जा सकता है । Httex1 रोग polyQ उत्परिवर्तन और पशुओं में अपनी व्यक्ती शामिल एचडी7की प्रमुख विशेषताओं के कई दोहराऊंगा कर सकते हैं, इस प्रकार एचडी पैथोलॉजी और रोग प्रगति 6 में इस टुकड़े की एक संभावित केंद्रीय भूमिका पर प्रकाश डाला, 8,9.
विस्तारित polyQ पथ के साथ उत्परिवर्ती Httex1 (mHttex1) के उच्च एकत्रीकरण प्रवृत्ति के कारण, मौजूदा अभिव्यक्ति प्रणालियों के बहुमत प्रोटीन के लिए Httex1 के क्षणिक संलयन पर आधारित हैं (जैसे glutathione-S-ट्रांस्फ़्रेज़ (जीएसटी), thioredoxin (TRX) या माल्टोज़-binding-प्रोटीन (MBP) और/या पेप्टाइड्स (पाली-histidine) जो अपनी अभिव्यक्ति में सुधार, स्थिरता, शुद्धि और/या घुलनशीलता10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,27,28। फ्यूजन साथी ऐसे trypsin, tabacco खोदना वायरस (टेव) के रूप में छेड़ने के लिए एक दरार साइट युक्त एक छोटी अनुक्रम के साथ Httex1 करने के लिए जुड़ा हुआ है या PreScission के दरार और Httex1 की रिहाई के लिए अनुमति देने के लिए एकत्रीकरण की दीक्षा से पहले या शोधन. इन तरीकों की कमियों के कारण अतिरिक्त अवशेषों छोड़ने की संभावना गैर-स्ट्रेस्ड दरार और Httex1 के अनुक्रम के भीतर दरार के कारण कटा हुआ टुकड़े के निर्माण, अपूर्ण दरार के कारण विविधता के अलावा ( देखें Vieweg एट अल. अधिक के लिए लाभ और इस दृष्टिकोण की सीमाओं पर गहन चर्चा के लिए)10। इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए, हमने हाल ही में एक अभिव्यक्ति रणनीति Synechocystis सपा के एक क्षणिक एन टर्मिनल संलयन का उपयोग करके पहली बार के लिए टैग मुक्त देशी Httex1 की पीढ़ी को सक्षम करने के लिए विकसित की है । (Ssp) DnaB intein को Httex110. जबकि intein दरार पता लगाया है और विशिष्ट और पैदावार प्रोटीन की मात्रा मिलीग्राम, यह अभी भी दो कमियां है कि उपज को कम कर सकता है: अर्थात्, intein जो अभिव्यक्ति के दौरान हो सकता है की समय से पहले दरार, और तथ्य यह है कि दरार पर होता है कई घंटे, जो एकत्रीकरण के कारण प्रोटीन के नुकसान के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, विशेष रूप से विस्तारित polyQ दोहराने के साथ Httex1 के लिए ।
इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए और देशी, टैग मुक्त Httex1 के उत्पादन के लिए हमारी रणनीति को परिष्कृत करने के लिए, हम सूमो के क्षणिक संलयन पर आधारित एक नई अभिव्यक्ति प्रणाली विकसित की है, और वास्तव में खमीर homolog Smt3 Httex1 करने के लिए । रिकॉमबिनेंट प्रोटीन के उत्पादन के लिए सूमो प्रणाली के आवेदन पहले २००४29में प्रकाशित किया गया था, जहां अभिव्यक्ति और सूमो फ्यूजन प्रोटीन के घुलनशीलता की वृद्धि की दर का प्रदर्शन किया गया । सूमो टैग प्रोटीन की तरह ubiquitin से सट किया जा सकता है विशिष्ट 1 (ULP1), जो एक मांयता साइट की आवश्यकता नहीं है, लेकिन सूमो के तृतीयक संरचना पहचानता है और व्यावहारिक रूप से30दरार की संभावना समाप्त । इसके अलावा, ULP1-मध्यस्थता दरार तेजी से और पता लगाया है और पीछे अतिरिक्त अवशेषों को छोड़ नहीं करता है । फ्यूजन टैग के समय से पहले दरार, के रूप में उत्प्रेरक intein10के साथ मनाया, पूरी तरह से एक बाहरी छेड़ने की आवश्यकता से बचा है । जबकि सूमो रणनीति आजकल व्यापक रूप से रिकॉमबिनेंट प्रोटीन उत्पादन31,३२,३३के लिए प्रयोग किया जाता है, हम इस पत्र में प्रदर्शित करता है कि यह एक आंतरिक रूप से परिक्रमा की पीढ़ी के लिए विशेष रूप से उपयोगी है, एकत्रीकरण-प्रवण, amyloidogenic प्रोटीन जैसे Httex1. हमें विश्वास है कि सादगी, दक्षता और हमारे सूमो-फ्यूजन आधारित विधि की मजबूती देशी, टैग मुक्त Httex1 और अधिक विभिंन विषयों से शोधकर्ताओं के लिए सुलभ बनाने के लिए और इन विट्रो में Httex1 के गैर देशी दृश्यों का उपयोग करने की आवश्यकता को खत्म कर देगा . यह एक महत्वपूर्ण अग्रिम है कि भविष्य के अध्ययन की सुविधा के लिए संरचना-Httex1 के समारोह के संबंध स्पष्ट होगा ।
प्रोटोकॉल बैक्टीरियल संस्कृति के 12 एल से Httex1 की शुद्धि का वर्णन है, लेकिन प्रोटोकॉल आसानी से छोटे या बड़े पैमाने पर प्रस्तुतियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । प्रोटोकॉल (Httex1) रोगजनक दहलीज (mHttex1) के ऊपर एक polyQ दोहराने की लंबाई (23Q) और उत्परिवर्ती 43Q (36Q) के नीचे एक polyQ दोहराने की लंबाई के साथ जंगली प्रकार Httex1 (wtHttex1) के उत्पादन का वर्णन करता है ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1585px;" width="1585">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:443px;">Uranyl formate (UO2(CHO2)2)</td>
			<td style="width:193px;">EMS</td>
			<td style="width:124px;">22450</td>
			<td style="width:825px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formvar/carbon 200 mesh, Cu 50 grids</td>
			<td>EMS</td>
			<td>FCF200-Cu-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Precision Cell made of Quartz SUPRASIL 1 mm light path from Hellma Analytics</td>
			<td>HellmaAnalytics</td>
			<td>110-1-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buffer Substance Dulbecco&#39;s (PBS w/o Ca and Mg) ancinne ref 47302 (RT) SERVA</td>
			<td>Witech</td>
			<td>SVA4730203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicillin</td>
			<td>AxonLab</td>
			<td>A0839.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luria Broth (Miller&#39;s LB Broth)</td>
			<td>&#160;Chemie Brunschwig</td>
			<td>1551.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>AxonLab</td>
			<td>A1008.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E. coli B ER2566</td>
			<td>NEB</td>
			<td>NEB# E4130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56750-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cOmplete&#160;Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Huntingtin Antibody, a.a. 1-82</td>
			<td>Merck Millipore Corporation</td>
			<td>MAB5492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H + L)</td>
			<td>Licor</td>
			<td>925-68070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMSF</td>
			<td>AxonLab</td>
			<td>A0999.0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HisPrep 16/10 column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28936551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">C4 HPLC column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00G-4168.P0</td>
			<td>&#160;&#160;&#160; 10 &#181;m C4 300 &#197;, LC Column 250 x 21.2 mm, Phenomenex, 19x10 mm guard column, not temperature jacketed</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile HPLC</td>
			<td>MachereyNagel</td>
			<td>C2502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filtre seringue Filtropur S 0,45 ul sans prefiltre sterile</td>
			<td>Sarstedt AG</td>
			<td>83.1826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectrophotometer semi-micro cuvette</td>
			<td style="width:193px;">Reactolab S.A.</td>
			<td>2534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superloop, 1/16&#34; fittings (&#196;KTAdesign), 50 ml</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>18111382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>302031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GREINER Tubes fo FPLC 16 x 100 mm, cap. 12.0 ml</td>
			<td style="width:193px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>7.160 102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;100 kD Microcon&#160; fast flow filters</td>
			<td style="width:193px;">Merck Millipore Corporation</td>
			<td>MRCF0R100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vibra-cell VCX130 ultrasonic liquid processor</td>
			<td>Sonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#196;kta 900 equipped with a fraction collector&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Jasco J-815 Circular Dichroism</td>
			<td>Jasco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters UPLC system&#160;</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>C8 BEH acquity 2.1x100 mm 1.7 micron column&#160; , preheated column (40 &#176;C), flow rate of 0.6 mL/min, injection volume of 4 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">waters HPLC system</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>2489 UV detector and 2535 quaternary gradient module, 20 mL loop in a FlexInject housing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ESI-MS: Finnigan LTQ</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">lyophylizer instrument</td>
			<td>FreeZone 2.5 Plus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tecnai Spirit BioTWIN&#160;</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td>electron microscope equipped with a LaB6 gun and a 4K x 4K FEI Eagle CCD camera (FEI) and operated at 80 kV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C shaking&#160; incubator</td>
			<td>Infors HT multitron Standard</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biophotometer plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of native, untagged huntingtin exon1 monomer and fibrils using a sumo fusion strategy

Huntington की बीमारी (एचडी) एक विरासत में मिली घातक neurodegenerative रोग है जो कि एचडी जीन के पहले एक्सॉन में सीएजी विस्तार (≥ ३६) के कारण होता है, जिसके परिणामस्वरूप Huntingtin प्रोटीन (Htt) या एन-टर्मिनल अंशों की अभिव्यक्ति में विस्तारित polyglutamine ( polyQ) खिंचाव.
Huntingtin प्रोटीन (Httex1) का exon1 सबसे छोटा Htt अंश है जो सेलुलर और एनिमल मॉडल में एचडी की कई सुविधाओं को recapitulates है और Htt के सबसे व्यापक रूप से अध्ययन किये गए अंशों में से एक है । Httex1 के छोटे आकार के लिए यह प्रयोगात्मक अधिक लंबे समय तक टुकड़े या पूर्ण लंबाई Htt की तुलना में मानक और उच्च संकल्प तकनीक का उपयोग कर भौतिक विशेषताओं के लिए उत्तरदायी बनाता है. हालांकि, वृद्धि हुई polyQ सामग्री के साथ उत्परिवर्ती Httex1 (mHttex1) के उच्च एकत्रीकरण प्रवृत्ति (≥ ४२) यह मुश्किल कुशल अभिव्यक्ति और शोधन प्रणालियों के विकास के लिए पर्याप्त मात्रा में इन प्रोटीन का उत्पादन और उंहें सुलभ बनाने के लिए बना दिया है फ्यूजन प्रोटीन या अन्य रणनीतियों है कि प्रोटीन के देशी अनुक्रम में परिवर्तन के उपयोग के बिना विभिन्न विषयों से वैज्ञानिकों. हम यहां मौजूद मिलीग्राम मात्रा के उत्पादन के लिए एक मजबूत और अनुकूलित विधि देशी, टैग मुक्त Httex1 छोटे ubiquitin संबंधित संशोधक (सुमो) के परिवर्तनीय संलयन पर आधारित है । सादगी और रणनीति की दक्षता Httex1 के गैर-देशी दृश्यों का उपयोग करने की आवश्यकता को खत्म करने, इस प्रकार इस प्रोटीन और शोधकर्ताओं के लिए सुलभ बनाने और विभिन्न प्रयोगशालाओं में प्रयोगों के reproducibility में सुधार होगा. हमें विश्वास है कि इन अग्रिमों भी Htt के संरचना समारोह संबंध elucidating के साथ ही उपंयास नैदानिक उपकरणों और उपचार या HD की प्रगति धीमी गति से विकसित करने के उद्देश्य से भविष्य के अध्ययन की सुविधा होगी ।

Httex1 ई. कोलाई में एक एन-टर्मिनल अपने6-सूमो टैग के साथ व्यक्त की है । अभिव्यक्ति और फ्यूजन प्रोटीन की शुद्धि के प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 1में संक्षेप हैं । Httex1 के अनुक्रम Htt के अवशेषों के होते हैं और Ala2 के साथ शुरू होता है, क्योंकि Met1 vivo४२में पूरी तरह से सट गया है । अमीनो एसिड की संख्या 23Q संस्करण को संदर्भित करता है, व्यक्त फ्यूजन प्रोटीन का पूरा अनुक्रम चित्रा 1एमें दिखाया गया है । plasmids को समुदाय के साथ साझा करने के लिए निकट भविष्य में Addgene पर जमा किया जाएगा । प्लाज्मिड और व्यक्त फ्यूजन प्रोटीन का एक योजनाबद्ध चित्र 1बीमें दिखाया गया है । His6-सूमो Httex1 एक मध्यम स्तर पर एक्सप्रेस (चित्रा 1सी) और फ्यूजन प्रोटीन के अधिकांश lysis के बाद घुलनशील अंश में मौजूद है, दोनों 23Q और 43Q संस्करण के लिए । फ्यूजन प्रोटीन, आणविक भार के आधार पर अपेक्षा से अधिक विस्थापित हो जाता है । यह आंशिक रूप से सूमो की मजबूत तह की वजह से है, लेकिन ज्यादातर Httex1 की असामांय अनुक्रम संरचना के कारण, जिसमें मुख्य रूप से glutamine और रेखा के अवशेषों । wildtype (23Q) और उत्परिवर्ती (43Q) फ्यूजन प्रोटीन दोनों IMAC द्वारा ~ ८०% पवित्रता को समृद्ध किया जा सकता है (चित्रा 1घ) सह शुद्ध मेजबान प्रोटीन की उपस्थिति Httex1 के तुलनात्मक रूप से कम अभिव्यक्ति स्तर और बड़ा नमूना द्वारा समझाया जा सकता है स्तंभ पर लागू किया गया वॉल्यूम ।
उसकी6-सूमो टैग के क्लीवेज और Httex1 की शुद्धि चित्रा 2एमें दिखाई गई है । UPLC अपने6-सुमो टैग (चित्रा 2बी) के क्लीवेज की निगरानी करने के लिए एक कुशल उपकरण है । फ्यूजन प्रोटीन का मूल शिखर भस्म हो जाता है और दो नए और अच्छी तरह से अलग चोटियों इसी अपने6-सूमो टैग और Httex1 दिखाई देते हैं । दरार प्रतिक्रिया 10-20 मिनट में समाप्त हो गया है । पश्चिमी ब्लाट (पश्चिम बंगाल) भी दरार की प्रतिक्रिया कुशलता से निगरानी करने के लिए धीमी है, लेकिन यह संदर्भ के लिए आंकड़ा में शामिल किया गया है और सूमो दरार की पूर्णता का प्रदर्शन । दोनों Httex1 23Q और 43Q अच्छी तरह से अपने6-सूमो टैग से RP-HPLC (चित्रा 2सी) से अलग किया जा सकता है और उच्च पवित्रता में प्राप्त किया गया के रूप में UPLC, एमएस और एसडीएस-पृष्ठ विश्लेषण (चित्रा 2डी) द्वारा दिखाया गया है ।
यह वर्णन करने के लिए कि Httex1 प्रोटीन इस विधि द्वारा तैयार Httex1 के अपेक्षित एकत्रीकरण गुण बनाए रखने, हम ३७ डिग्री सेल्सियस पर उत्परिवर्ती Httex1 के fibrillization कैनेटीक्स एक अवसादन परख द्वारा मूल्यांकन, सीडी द्वारा द्वितीयक संरचना में परिवर्तन पर नजर रखी स्पेक्ट्रोस्कोपी, और उनि द्वारा समुच्चय की आकृति विज्ञान की विशेषता । mHttex1 फाइब्रिल गठन के एकत्रीकरण कैनेटीक्स के एक प्रतिनिधि डेटा सेट के रूप में एक अवसादन परख द्वारा निर्धारितचित्रा 3एमें दिखाया गया है । समय के साथ घुलनशील Httex1 43Q की हानि, फाइब्रिल गठन के कारण UPLC द्वारा quantified था. हम घुलनशील प्रोटीन की एक पूरी कमी का निरीक्षण के बाद ४८ घंटे की मशीन । इसके अतिरिक्त, हम सीडी स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा प्रोटीन की माध्यमिक संरचना निर्धारित (चित्रा 3बी) । Httex1 43Q unस्ट्रक्चर्ड (λमिन २०५ एनएम) से मुख्य रूप से β-शीट रिच रचना (λंयूनतम २१५ एनएम) के लिए पाली की मशीन के ४८ घंटे के बाद । इस संरचनात्मक परिवर्तन ४८ घंटे (चित्रा 3सी) में उनि द्वारा चौकसी के रूप में लंबे समय fibrillar समुच्चय के गठन के साथ है ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig1.jpg"> चित्रा 1 . उसकी6-सूमो Httex1 फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति और शुद्धि ।  (क) एमिनो एसिड अनुक्रम के अपने6-सूमो-Httex1-qn फ्यूजन constructs (अपने6-सूमो में हरे और Httex1-qn नारंगी में); (ख) संफ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति और शुद्धि का योजनाबद्ध अवलोकन; (ग) अभिव्यक्ति का एसडीएस-पृष्ठ विश्लेषण और lysis के पश्चात् फ्यूजन प्रोटीन का घुलनशीलता; (घ) फ्यूजन प्रोटीन के IMAC शुद्धिकरण के वर्णलेख और एसडीएस द्वारा अंशों के विश्लेषण-पृष्ठ (लाल पट्टी: असीम अंश, नीला पट्टी: हाथ धोना, काली पट्टी: रेफरेंस पीक से युक्त भिन्न); <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig2.jpg"> चित्रा 2 . अपने6 सूमो टैग के क्लीवेज और टैग के शुद्धि-नि: शुल्क Httex1-QN प्रोटीन । (क) योजनाबद्ध सिंहावलोकन; (ख) UPLC द्वारा ULP1 के साथ सूमो टैग के दरार का विश्लेषण (नीला: ULP1 के अलावा पहले; काला: 20 मिनट (23Q), क्रमशः 10 मिनट (43Q) के बाद ULP1 के अलावा) और पश्चिम बंगाल (MAB5492 1:2000, माध्यमिक बकरी विरोधी माउस एंटीबॉडी 1:5000); (ग) Httex1 के preparative आरपी-HPLC शुद्धिकरण के वर्णलेख; D: UPLC द्वारा शुद्ध Httex1 का विश्लेषण, एसडीएस-पृष्ठ और ईएसआई-MS; अपेक्षित आणविक भार क्रमशः ९९४३ दा (23Q) और १२५०६ दा (43Q) है. <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig2large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig3.jpg"> चित्रा 3 . Httex1-43Q का समुच्चय: (क) UPLC के आधार पर अवसादन परख । (ख) माध्यमिक संरचना की सीडी स्पेक्ट्रा पर 0 एच और ४८ एच. (ग) उनि माइक्रोग्राफ के समुच्चय पर ४८ ज (स्केल बार्स हैं २०० एनएम). <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig3large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>

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Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

यहां, हम देशी की मिलीग्राम मात्रा के उत्पादन के लिए एक मजबूत और अनुकूलित प्रोटोकॉल वर्तमान, टैग मुक्त मोनोमर और तंतुओं के exon1 के Huntingtin प्रोटीन (Httex1) छोटे ubiquitin संबंधित संशोधक (सुमो) के क्षणिक संलयन पर आधारित है ।

देशी की पीढ़ी, untagged Huntingtin Exon1 मोनोमर और तंतुओं एक सूमो संलयन रणनीति का उपयोग

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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लाइव सेल Photoaffinity लेबल द्वारा एक मूल निवासी सेलुलर वातावरण में छोटे अणु-बाध्यकारी प्रोटीन की पहचान

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ब्लू मूल निवासी पृष्ठ और प्रोटीन सहसंबंध रूपरेखा द्वारा समानता शुद्ध प्रोटीन परिसरों का समाधान करना

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

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