Name: generation of native, untagged huntingtin exon1 monomer and fibrils using a sumo fusion strategy
Uploaded: 2018-06-27T13:30:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy at JoVE.com

Questo lavoro è stato finanziato principalmente da sovvenzioni dalla fondazione CHDI e Swiss National Science Foundation. Ringraziamo Dr. Sophie Vieweg per utili discussioni durante lo sviluppo di questo nuovo sistema di espressione e altri membri del gruppo Lashuel per condividere la loro esperienza con questo sistema di espressione e per il loro input e prezioso feedback. Ringraziamo anche la Prof. ssa Oliver Hantschel per fornire il plasmide ULP1. Gli autori ringraziano il Dr. John B. Warner e Dr. Senthil K. Thangaraj per revisione critica del manoscritto

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse con il contenuto di questo articolo.

In questo protocollo, abbiamo delineato una procedura efficace per ottenere quantità di milligrammo di nativo, senza tag Httex1 contenenti residui di glutamina 23 o 43. Questo è stato ottenuto esprimendo Httex1 come una fusione di C-terminale a un suo6-tag SUMO, che viene utilizzato per isolare la proteina di fusione dalla cella lysata di IMAC e viene scisso prima purificazione HPLC di Httex1. Mentre la strategia SUMO è stata utilizzata nella produzione di parecchie altre proteine, il nostro metodo indica che le proprietà uniche di che Sumo potrebbe essere utilizzato anche per generare intrinsecamente disordinata, aggregazione-inclini, proteine amiloidogeniche che precedentemente hanno dimostrato di essere estremamente difficile da gestire e produrre43,44. Vi presentiamo un protocollo che è semplice, facile da usare e paragonabile a un protocollo per la generazione di una proteina "ben educata". La fusione di SUMO solubilizza e stabilizza Httex1 durante l'espressione e la fase di purificazione di IMAC. Scissione precoce del tag, come osservato con il intein strategia10 e l'aggregazione non erano più un problema.
Proteine intrinsecamente disordinati sono particolarmente vulnerabili alla degradazione. Mentre la degradazione del N-terminale della regione N17 non è un problema usando questo protocollo, possono verificarsi troncamenti in PRD di Httex1. Come le proteine tronche sono molto simile a Httex1 di idrofobicità, carica e dimensione, rimuoverli con mezzi cromatografici è impegnativo, quindi è meglio prevenire la loro formazione in primo luogo. Attenersi strettamente al protocollo, sempre lavorando sul ghiaccio e utilizzando una quantità sufficiente di inibitore della proteasi dovrebbe aiutare a mantenere molto basso il livello di troncamento osservato. L'applicazione di un tag di fusione al C-terminale di Httex1 potrebbe rimuovere troncamenti in PRD facilmente come la proteina tronca perderebbe anche il tag di affinità. Tuttavia, se la sequenza nativa deve essere mantenuto che questa opzione non può essere applicata come Httex1 termina con prolina e al meglio della nostra conoscenza non ci sono nessun tag di fusione di C-terminale che è noti per indurre il clivaggio traceless ed efficiente dopo prolina.
La parte più critica del protocollo è la gestione della Httex1 liberata dopo la scissione del tag SUMO da ULP1. La proteina deve essere purificata immediatamente da RP-HPLC. Fortunatamente, questa è una reazione efficiente e veloce che di solito è completata in 10-20 min a 4 ° C. Al contrario, la strategia di intein richiesto diverse ore per la scissione completa di intein, richiedendo così un compromesso tra la fenditura incompleta e inizio aggregazione al fine di massimizzare il rendimento. Un workup veloce è necessario per mutante Httex1, come si inizierà ad aggregare alla concentrazione relativamente alta presente nella reazione di scissione, mentre la variante 23Q è stabile per un tempo più lungo. Durante la purificazione di RP-HPLC, un altro vantaggio di SUMO diventa evidente: mentre il Ssp DnaB intein è idrofobo e bastoni fortemente alla colonna, SUMO è più idrofilo ed eluisce completamente dalla colonna a fase inversa C4. Anche se ULP1 commerciale è piuttosto costoso, la proteina può essere prodotto facilmente nell'alto rendimento seguendo protocolli precedentemente pubblicati29.
L'importanza critica di applicare un protocollo di disaggregazione prima utilizzando Httex1 non può essere sottolineato abbastanza. Liofilizzato polyQ proteine quali Httex1 sono stabili e possono essere memorizzati lunghi periodi, ma non sono completamente solubili in acqua e buffer. La presenza di oligomeri preformati o fibrille potrebbe avere un impatto significativo sulla cinetica di aggregazione e proprietà biofisiche del proteina45. Il protocollo di disaggregazione descritto qui permette la disgregazione della proteina, rimozione degli aggregati preformati e generazione di una soluzione di Httex1 monomerico da un campione di liofilizzato. Abbiamo osservato la simile morfologia di cinetica e fibrilla di aggregazione per Httex1 ottenuti con il SUMO e la strategia di intein.
Rispetto ai precedenti metodi per la produzione di Httex1, la strategia SUMO descritta qui offre diversi vantaggi e si espande la gamma di possibili studi per indagare la struttura e le proprietà funzionali di questa proteina nella salute e nella malattia. La proteina di fusione di SUMO-Httex1 è facile da gestire, può essere congelato e memorizzato o mantenuto in soluzione per 24 h a temperatura ambiente, mentre il mHttex1 gratuito sarebbe aggregare rapidamente. La stabilità e l'alta solubilità delle proteine di fusione di SUMO-Httex1 offrono una maggiore flessibilità per modificare la proteina e/o introdurre modifiche enzimatiche e chimiche in mHttex1 che altrimenti non sarebbe possibile dopo fenditura. Ciò comprende l'introduzione di modificazioni post-traduzionali, fluorofori, spin etichette, tag di biotina, ecc i progressi presentati qui dovrebbero 1) facilitare futuri studi per delucidare la relazione struttura-funzione di Httex1; 2) generare nuovi strumenti per studiare l'aggregazione Htt e patologia diffusione; 3) consentire lo sviluppo di nuovi test per identificare molecole che stabilizzano mutante Httex1 e prevenire la sua aggregazione; e 4) incoraggiare gli scienziati di altri campi per portare a lavorare su questa proteina e unire la nostra ricerca per trovare cure per la malattia di Huntington.

Htt è una proteina di 348 kDa ed è stato implicato in varie funzioni fisiologiche1. Quando Htt contiene una regione di polyQ espanso di più di 36 residui nella sua estremità N-terminale, che provoca HD2,3. Patologia di HD è caratterizzata da inclusioni cellulari nel corpo striato e corteccia, che conduce alla morte neuronale e l'atrofia dei tessuti colpiti4,5. Parecchi frammenti N-terminale Htt che contengono il tratto ripetere polyQ sono stati rilevati in cervelli post mortem da pazienti con MH e sono pensati per essere generati dal processamento proteolitico della proteina huntingtina6. Gli studi recenti suggeriscono che Httex1 potrebbe anche essere formato dovuto l'impionbatura del mRNA aberrante. Httex1 contiene la mutazione patologica poliQ e sua sovraespressione in animali possa ricapitolare molte delle caratteristiche chiave di HD7, evidenziando così un possibile ruolo centrale di questo frammento in HD patologia e malattia progressione6, 8,9.
A causa l'aggregazione alta propensione del mutante Httex1 (mHttex1) con tratto poliQ espanso, la maggior parte degli esistenti sistemi di espressione si basata sulla fusione transitoria di Httex1 alle proteine (come la glutatione-S-transferasi (GST), thioredoxin (TRX) o maltosio--proteina (MBP) e/o peptidi (poli-istidina) che differenzialmente migliorano l'espressione, stabilità, purificazione e/o solubilità10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. Il partner di fusione è legato al Httex1 con una breve sequenza contenente un sito di clivaggio per proteasi come la tripsina, tabacco etch proteasi virus (TEV) o PreScission per consentire la scissione e il rilascio di Httex1 prima dell'inizio dell'aggregazione o purificazione. Carenze di questi metodi includono la possibilità di lasciare ulteriori residui a causa di non-traceless scissione e la creazione di frammenti troncate a causa di miscleavage all'interno della sequenza di Httex1, oltre alla eterogeneità dovuto fenditura incompleta ( Vedi Vieweg et per più approfondita discussione su vantaggi e limiti di questo approccio)10. Per risolvere queste limitazioni, abbiamo recentemente sviluppato una strategia di espressione che consente la generazione di Httex1 privo di tag nativo per la prima volta utilizzando una transitoria fusione del N-terminale di Synechocystis SP. (Ssp) DnaB intein a Httex110. Mentre il clivaggio di intein è traceless e specifici e produce quantità di mg di proteine, soffre ancora due inconvenienti che potrebbero ridurre il rendimento: vale a dire, prematuro fenditura di intein che può verificarsi durante l'espressione e il fatto che la scissione si verifica sopra parecchie ore, che potrebbero portare alla perdita di proteine a causa di aggregazione, soprattutto per Httex1 con ripetizioni di polyQ espanso.
Per affrontare queste limitazioni e di affinare la nostra strategia per la produzione di nativi, privo di tag Httex1, abbiamo sviluppato un nuovo sistema di espressione basato sulla fusione transitoria di SUMO, più esattamente il lievito dell'omologo Smt3 a Httex1. L'applicazione del sistema SUMO per la produzione di proteine ricombinanti in primo luogo è stato pubblicato nel 200429, dove è stati dimostrati un tasso aumentato di espressione e la solubilità della proteina di fusione di SUMO. Il tag SUMO può essere clivato da ubiquitina come proteine specifiche proteasi 1 (ULP1), che non richiedono un sito di riconoscimento, ma riconosce la struttura terziaria di SUMO e praticamente eliminano la possibilità di miscleavage30. Inoltre, la fenditura di ULP1-mediata è veloce e traceless e non lascia residui aggiuntivi. La scissione precoce del tag fusion, come osservato con l'autocatalitica intein10, è completamente evitata mediante la richiesta di una proteasi esterna. Mentre la strategia SUMO è oggi ampiamente usata per la produzione di proteine ricombinanti31,32,33, dimostriamo in questa carta che è particolarmente utile per la generazione di un intrinsecamente disordinati, aggregazione-inclini, proteine amiloidogeniche come Httex1. Noi crediamo che la semplicità, l'efficienza e la solidità del nostro metodo basati su SUMO-fusione renderà più accessibili ai ricercatori di diverse discipline Httex1 nativo, privo di etichetta ed eliminano la necessità di utilizzare sequenze di non-nativi del Httex1 in vitro . Si tratta di un importante passo avanti che faciliterà gli studi futuri per delucidare il rapporto struttura-funzione di Httex1.
Il protocollo descrive la purificazione di Httex1 da 12 L di coltura batterica, ma il protocollo potrebbe essere facilmente adattato per produzioni su scala più piccola o più grande. Il protocollo descrive la produzione di tipo selvaggio Httex1 (wtHttex1) con una lunghezza di ripetizione di poliQ sotto (23Q) e mutante Httex1 (mHttex1) con un polyQ ripetere lunghezza sopra (43Q) la soglia di patogena (36Q).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1585px;" width="1585">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:443px;">Uranyl formate (UO2(CHO2)2)</td>
			<td style="width:193px;">EMS</td>
			<td style="width:124px;">22450</td>
			<td style="width:825px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formvar/carbon 200 mesh, Cu 50 grids</td>
			<td>EMS</td>
			<td>FCF200-Cu-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Precision Cell made of Quartz SUPRASIL 1 mm light path from Hellma Analytics</td>
			<td>HellmaAnalytics</td>
			<td>110-1-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buffer Substance Dulbecco&#39;s (PBS w/o Ca and Mg) ancinne ref 47302 (RT) SERVA</td>
			<td>Witech</td>
			<td>SVA4730203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicillin</td>
			<td>AxonLab</td>
			<td>A0839.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luria Broth (Miller&#39;s LB Broth)</td>
			<td>&#160;Chemie Brunschwig</td>
			<td>1551.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>AxonLab</td>
			<td>A1008.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E. coli B ER2566</td>
			<td>NEB</td>
			<td>NEB# E4130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56750-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cOmplete&#160;Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Huntingtin Antibody, a.a. 1-82</td>
			<td>Merck Millipore Corporation</td>
			<td>MAB5492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H + L)</td>
			<td>Licor</td>
			<td>925-68070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMSF</td>
			<td>AxonLab</td>
			<td>A0999.0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HisPrep 16/10 column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28936551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">C4 HPLC column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00G-4168.P0</td>
			<td>&#160;&#160;&#160; 10 &#181;m C4 300 &#197;, LC Column 250 x 21.2 mm, Phenomenex, 19x10 mm guard column, not temperature jacketed</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile HPLC</td>
			<td>MachereyNagel</td>
			<td>C2502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filtre seringue Filtropur S 0,45 ul sans prefiltre sterile</td>
			<td>Sarstedt AG</td>
			<td>83.1826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectrophotometer semi-micro cuvette</td>
			<td style="width:193px;">Reactolab S.A.</td>
			<td>2534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superloop, 1/16&#34; fittings (&#196;KTAdesign), 50 ml</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>18111382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>302031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GREINER Tubes fo FPLC 16 x 100 mm, cap. 12.0 ml</td>
			<td style="width:193px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>7.160 102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;100 kD Microcon&#160; fast flow filters</td>
			<td style="width:193px;">Merck Millipore Corporation</td>
			<td>MRCF0R100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vibra-cell VCX130 ultrasonic liquid processor</td>
			<td>Sonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#196;kta 900 equipped with a fraction collector&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Jasco J-815 Circular Dichroism</td>
			<td>Jasco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters UPLC system&#160;</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>C8 BEH acquity 2.1x100 mm 1.7 micron column&#160; , preheated column (40 &#176;C), flow rate of 0.6 mL/min, injection volume of 4 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">waters HPLC system</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>2489 UV detector and 2535 quaternary gradient module, 20 mL loop in a FlexInject housing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ESI-MS: Finnigan LTQ</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">lyophylizer instrument</td>
			<td>FreeZone 2.5 Plus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tecnai Spirit BioTWIN&#160;</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td>electron microscope equipped with a LaB6 gun and a 4K x 4K FEI Eagle CCD camera (FEI) and operated at 80 kV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C shaking&#160; incubator</td>
			<td>Infors HT multitron Standard</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biophotometer plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of native, untagged huntingtin exon1 monomer and fibrils using a sumo fusion strategy

Malattia di Huntington (HD) è una malattia neurodegenerative ereditato fatale causata da un'espansione CAG (≥36) nel primo esone del gene MH, conseguente l'espressione della proteina huntingtina (Htt) o N-terminale frammenti della stessa con un espanso di polyglutamine ( tratto poliQ).
La exon1 della proteina huntingtina (Httex1) è il più piccolo frammento di Htt che riassume molte delle caratteristiche di HD in cellulare e animale modelli ed è uno dei frammenti più ampiamente studiati di Htt. Le piccole dimensioni del Httex1 rendono sperimentalmente più favorevoli alla caratterizzazione biofisica utilizzando tecniche standard e ad alta risoluzione rispetto ai frammenti più lunghi o Htt full-length. Tuttavia, la propensione ad alta aggregazione del mutante Httex1 (mHttex1) con aumentata polyQ contenuto (≥42) ha reso difficile sviluppare espressione efficienti e sistemi di purificazione a produrre queste proteine in quantità sufficienti e renderli accessibili al scienziati di diverse discipline senza l'uso di proteine di fusione o altre strategie che alterano la sequenza nativa della proteina. Qui presentiamo un metodo robusto e ottimizzato per la produzione di quantità di milligrammo di nativo, tag-gratuita Httex1 basata sulla fusione transitoria del piccolo ubiquitina relative al modificatore (SUMO). La semplicità e l'efficienza della strategia eliminerà la necessità di utilizzare sequenze di non-nativi di Httex1, così rendendo questa proteina più accessibile ai ricercatori e migliorare la riproducibilità degli esperimenti in laboratori diversi. Noi crediamo che questi progressi faciliterà anche futuri studi volti a chiarire la relazione struttura-funzione di Htt, nonché sviluppare nuovi strumenti diagnostici e terapie per curare o rallentare la progressione della HD.

Httex1 è espressa in e. coli con un N-terminale sua6-tag SUMO. I risultati rappresentativi della espressione e purificazione della proteina di fusione sono riassunti nella Figura 1. La sequenza di Httex1 è costituito da residui di 2-90 di Htt e inizia con Ala2, perché Met1 è completamente spaccati in vivo42. La numerazione degli aminoacidi si riferisce alla variante 23Q, la sequenza completa della proteina di fusione espressa è mostrata in Figura 1A. I plasmidi saranno depositati presso Addgene nel prossimo futuro da condividere con la Comunità. Un disegno schematico del plasmide e la proteina di fusione espressa è illustrato nella Figura 1B. His6-SUMO Httex1 esprime a un livello medio (Figura 1,C) e la maggior parte della proteina di fusione è presente nella frazione solubile dopo lisi, sia per il 23Q e la variante 43Q. La proteina di fusione migra più in alto del previsto, sulla base del peso molecolare. Questo è parzialmente dovuto la piega forte di SUMO, ma principalmente a causa della composizione insolita sequenza di Httex1, contenente principalmente residui di glutamina e prolina. Il mutante (43Q) e il wildtype (23Q) proteina di fusione può essere arricchita di ~ 80% purezza da IMAC (Figura 1D) la presenza di co-purificazione proteina ospite può essere spiegata dal livello comparativamente bassa espressione di Httex1 e il grande campione volume applicato alla colonna.
La scissione del suo6-tag di SUMO e la purificazione di Httex1 è illustrato nella Figura 2A. UPLC è uno strumento efficace per monitorare la scissione del suo6-tag SUMO (Figura 2B). Il picco originale della proteina di fusione è consumato e due picchi di nuovi e ben separati, corrispondente al suo6-SUMO tag e Httex1 vengono visualizzati. La reazione di scissione è rifinita in 10-20 min. Il Western Blot (WB) è troppo lento per monitorare in modo efficiente la reazione di scissione, ma è stato incluso nella figura per riferimento e per dimostrare la completezza del clivaggio SUMO. Entrambi Httex1 23Q e 43Q possono essere separati anche dal suo6-SUMO tag da RP-HPLC (Figura 2C) e sono stati ottenuti a elevata purezza, come indicato dall'analisi UPLC, MS e SDS-PAGE (Figura 2D).
Per illustrare che le proteine Httex1 preparate da questo metodo mantengono le proprietà di aggregazione previsto di Httex1, abbiamo valutato la cinetica di fibrillazione del mutante Httex1 a 37 ° C da un'analisi di sedimentazione, monitorare i cambiamenti nella struttura secondaria di CD spettroscopia e caratterizza la morfologia degli aggregati di TEM. Un set di dati rappresentativo delle cinetiche di aggregazione di formazione di fibrille di mHttex1 come determinato mediante un test di sedimentazione è mostrato inFigura 3A. La perdita di sostanza solubile Httex1 43Q nel tempo, a causa di formazione della fibrilla è stata quantificata tramite UPLC. Osserviamo un completo depauperamento delle proteine solubili dopo 48 ore di incubazione. Inoltre, abbiamo determinato la struttura secondaria della proteina di spettroscopia CD (Figura 3B). Httex1 43Q turni da non strutturati (λmin 205 nm) alla conformazione ricca soprattutto β-foglio (λmin 215 nm) dopo 48 ore di incubazione. Questo cambiamento strutturale è accompagnato dalla formazione di aggregati fibrillari lungo come osservabile da TEM a 48 ore (Figura 3C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig1.jpg"> Figura 1 . Espressione e purificazione del suo6-proteina di fusione di SUMO Httex1.  (A), la sequenza aminoacidica del suo6-SUMO-Httex1-QN fusione costrutti (sua6-SUMO in verde e Httex1-QN in arancione); (B) descrizione schematica dell'espressione e purificazione della proteina di fusione; (C) analisi SDS-PAGE dell'espressione e la solubilità della proteina di fusione dopo la lisi; (D) cromatogramma della IMAC purificazione della proteina di fusione e analisi delle frazioni da SDS-PAGE (barra rossa: barra di frazione non legata, blu: frazione di lavaggio, barra nera: le frazioni contenenti il picco di eluizione); <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig2.jpg"> Figura 2 . Fenditura del suo6 SUMO tag e purificazione delle proteine di Httex1-QN privo di etichetta. Descrizione schematica (A); (B) analisi di fenditura del tag SUMO con ULP1 di UPLC (blu: prima dell'aggiunta della ULP1; nero: 20 min (23Q), rispettivamente 10 min (43Q) dopo l'aggiunta di ULP1) e WB (MAB5492 1: 2000, secondario goat anti-mouse anticorpo 1: 5000); (C) cromatogramma della purificazione RP-HPLC preparativa di Httex1; D: analisi della Httex1 purificata da UPLC, SDS-PAGE ed ESI-MS; il peso molecolare previsto è Da 9943 (23Q) e Da 12506 (43Q) rispettivamente. <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig3.jpg"> Figura 3 . Aggregazione di Httex1-43Q: saggio di sedimentazione (A) basato su UPLC. (B) spettri CD della struttura secondaria a 0 h e micrografie TEM 48 h. (C) degli aggregati a 48 h (barre della scala sono 200 nm). <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

Qui, presentiamo un protocollo robusto e ottimizzato per la produzione di quantità di milligrammo di monomeri nativi, privo di etichetta e fibrille di exon1, della proteina huntingtina (Httex1), basata sulla fusione transitoria del piccolo ubiquitina relative al modificatore (SUMO).

Generazione di monomero Exon1 huntingtina nativo, senza tag e fibrille usando una strategia di fusione di SUMO

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

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Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Elettroforesi ibrida trasparente/blu nativa per la separazione e l'analisi dei supercomplessi di catene respiratorie mitocondriali

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

Una strategia per identificare i composti che influenzano la crescita cellulare e la sopravvivenza nelle cellule di mammaliana coltivate a bassa-moderato throughput

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Localizzazione delle proteine di SUMO-modificate utilizzando proteine di cattura di Sumo fluorescente

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interazioni con e Membrana Permeabilizzazione di mitocondri cerebrali di Amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...