Name: generation of native, untagged huntingtin exon1 monomer and fibrils using a sumo fusion strategy
Uploaded: 2018-06-27T13:30:00
Duration: 11 min 22 s
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이 작품은 CHDI 재단과 스위스 국립 과학 재단에서 교부 금에 의해 주로 투자 되었다. 우리 감사 합니다 박사 소피 Vieweg 유용한 토론에 대 한이 새로운 식 시스템의 개발 및 Lashuel 그룹의 다른 구성원 중이 식 시스템으로 그들의 경험을 공유 하기 위한 그들의 입력 및 귀중 한 피드백. 우리는 또한 ULP1 플라스 미드를 제공 하기 위한 교수 올리버 Hantschel 감사 합니다. 저자 박사 존 B. 워너와 박사 Senthil K. Thangaraj 원고의 중요 한 검토에 대 한 감사

저자 들은이 문서의 내용으로 관심 없음 충돌 선언 합니다.

이 프로토콜에서 우리가 설명한 효율적인 절차를 얻는 밀리 그램 양의 네이티브, 없는 Httex1에 대 한 23 또는 43 글루타민 잔류물을 포함 하. 이 Httex1는 그의 C-터미널 융합으로 표현 하 여 달성 되었다6-아이맥 세포 lysate에서 융해 단백질을 사용 하 고 Httex1의 HPLC 정화 전에 죽 습 스모 태그. 스모 전략 다른 여러 가지 단백질의 생산에 사용 되었습니다, 우리의 방법이 보여준다는 스모 본질적으로 생성 하는 데 사용 또한 수 있는 독특한 속성 무질서, 집계 경향이 이전 되 고 입증 하는 amyloidogenic 단백질 43,44를 생산 하 고 처리 하기 매우 어려운. 선물이 프로토콜 "품행" 단백질의 생성에 대 한 간단 하 고, 사용 하기 쉬운 프로토콜 비교입니다. 스모 퓨전 solubilizes 고 표현과 아이맥 정화 단계 동안 Httex1를 안정 시킨다. 태그 집계 intein 전략10 와 관찰의 조 숙한 분열은 더 이상 문제가.
본질적으로 무질서 단백질은 특히 저하에 취약. N 맨끝 저하 N17 지역에서이 프로토콜을 사용 하 여 문제가 되지 않습니다, 하는 동안 Httex1의 PRD에 잘림 발생할 수 있습니다. 잘린된 단백질은 hydrophobicity, 크기 및 Httex1에 매우 비슷합니다, 크로마 방법으로 그들을 제거 하는 것은 도전적 이다, 따라서 그것은 첫번째 장소에 있는 그들의 대형을 방지 하기 위해 좋은. 프로토콜에 밀접 하 게 튀어나와, 얼음에 항상 노력 하 고 충분 한 양의 protease 억제제를 사용 하 여 데 도움이 됩니다 관찰된 자르기의 수준을 매우 낮게 유지. Httex1의 C-말단에 융합 태그 적용 제거할 수 잘림 PRD에 쉽게 잘린된 단백질 뿐만 아니라 선호도 태그를 잃을 것 이다. 그러나, 기본 시퀀스 Httex1 프롤린과 우리의 지식 최선을 끝나는 대로이 옵션을 적용할 수 없습니다 유지 하는 경우 프롤린 후 traceless 고 효율적인 분열을 유도 하는 것으로 알려져 있습니다 C 터미널 퓨전 태그가 없습니다 있다.
프로토콜의 가장 중요 한 부분은 스모 태그의 분열 후 ULP1에 의해 해방 하는 Httex1의 처리입니다. 단백질은 RP HPLC에 의해 즉시 정화 한다. 다행히, 이것은 일반적으로 4 ° c.에 10-20 분에 완료 되는 효율적이 고 빠른 반응 대조적으로, intein 전략 수익률을 극대화 하기 위해 절충 한 불완전 한 분열 및 시작 집계 백업은 intein의 완전 한 분열에 대 한 몇 시간을 필요 합니다. 빠른 검사 결과 돌연변이 Httex1를 위한 시작 됩니다 23Q 이체는 긴 시간에 대 한 안정적인 반면 분열 반응에 비교적 높은 농도에서 집계. RP HPLC 정화 중 스모의 또 다른 장점은 드러납니다: 스모 더 친수성 이며 C4 반전 단계 열에서 완전히 elutes Ssp DnaB intein 소수는 열에 강하게 집착 하는 동안. 상업적인 ULP1는 매우 비용이 많이 드는, 단백질 고수익 이전 게시 프로토콜29다음에 쉽게 생산 수 있습니다.
Httex1를 사용 하 여 이전 피의 프로토콜 적용의 중요 수 없습니다 충분히 강조. Httex1 같은 동결 건조 된 polyQ 단백질 안정 및 저장된 오랜 기간 수 있지만 물과 버퍼에 완전히 용 해 되지 않습니다. 미리 형성한 올리고 또는 소의 존재는 집계 속도 론 및 단백질45의 생물 속성에 큰 영향을 있을 수 있었다. 여기에 설명 된 피의 프로토콜 단백질의 피의 미리 형성한 집계의 제거 및 동결 건조 된 샘플에서 단위체 Httex1의 솔루션의 수 있습니다. Httex1로 얻은 스모 및 intein 전략에 대 한 비슷한 집계 속도 론 및 fibril 형태학을 관찰 합니다.
Httex1 생산을 위한 이전 방법에 비해, 여기에 설명 된 스모 전략 몇 가지 장점이 하 고 구조를 조사 하기 위해 가능한 연구의 범위와 건강 및 질병에이 단백질의 기능적 속성을 확장 합니다. 스모-Httex1 융합 단백질은 취급 하기 쉽다, 그것 수 있습니다 동결 및 저장 하거나 무료 mHttex1 것이 신속 하 게 집계 하는 동안 상 온에서 24 h에 대 한 솔루션에 유지. 안정성과 스모 Httex1 융합 단백질의 높은 가용성 단백질을 조작할 수 없는 가능한 분열 후 mHttex1으로 효소와 화학 수정 소개 하 더 큰 유연성을 제공 합니다. 이 소개를 포함 한다 포스트 번역 상 수정, fluorophores, 스핀 레이블, biotin 태그, 등 여기에 제시 된 발전 한다 1) Httex1;의 구조-기능 관계를 명료 하 게 미래 연구를 용이 하 게 2) 생성 하는 새로운 도구를 조사 Htt 집계 및 병리학 확산; 3) 활성화 돌연변이 Httex1 안정 하 고 그 집계;를 방지 하는 분자를 식별 하는 새로운 분석 실험의 개발 그리고 4)이이 단백질에 작동 하 고 치료약을 찾기 위해 Huntington의 질병에 대 한 우리의 모험을 가입 하 려 다른 분야에서 과학자.

Htt 348 kDa 단백질 이며 여러 가지 생리 기능1에 연루 되어 있다. Htt의 N-말단에 이상 36 잔류물의 확장된 polyQ 지역 포함, HD2,3발생 합니다. HD 병 리 세포 포함이 고 피 질 신경 죽음, 영향을 받는 조직4,5의 위축에 의해 특징입니다. PolyQ 반복 요로 포함 하는 여러 N 맨끝 Htt 조각 HD 환자에서 사후 두뇌에서 발견 된 고 huntingtin 단백질6의 분해 처리에 의해 생성 될 것으로 생각 되. 최근 연구 결과 Httex1를 벗어난 mRNA 접합에 의해 형성 될 또한 것이 좋습니다. Httex1 병 적인 polyQ 돌연변이 포함 하 고 동물에서의 overexpression HD7, 따라서 HD 병리학과 질병 진행6,이 조각의 가능한 중앙 역할을 강조의 핵심 기능 중 많은 정리 수 있습니다. 8,9.
때문에 높은 집계의 성향을 돌연변이 Httex1 (mHttex1) 확장된 polyQ로, 기존 식 시스템의 대부분은 단백질 Httex1의 과도 융합에 기반 (티-S-전이 효소 (GST), thioredoxin (TRX) 등 또는 맥 아당 의무적인 단백질 (MBP) 및 펩 티 드 (폴 리 히스티딘) 차동의 식, 안정성, 정화 및 용 해도10,,1112,13,14 개선 하는 ,15,16,17,18,19,20,,2122,23 ,,2425,26,,2728. 퓨전 파트너 프로 테아 제 트립 신 등의 분열 사이트를 포함 하는 짧은 시퀀스와 Httex1에 연결 되어, 담배 엣지 바이러스 (TEV) 효소 또는 분열 및 집계의 개시 전에 Httex1의 출시에 대 한 허용 하는 PreScission 또는 정화입니다. 비 traceless 분열으로 인해 추가 잔류물 및 불완전 쪼개 짐 (때문이 아니라 Httex1의 시퀀스 내에서 miscleavage로 잘린 조각의 창조의 가능성을 포함 하는 이러한 방법의 단점 Vieweg 외. 장점 및이 방법의 제한에 더 심층적인 토론 참조)10. 이러한 한계를 해결 하기 위해 우리는 최근 Synechocystis sp. 의 임시 N 맨끝 퓨전을 이용 하 여 처음으로 기본 태그 무료 Httex1의 생성을 활성화 하는 식 전략 개발 (Ssp) DnaB intein Httex110. Intein 분열 traceless 이며 특정 단백질의 밀리 그램 수량을 산출 하는 동안 그것은 여전히 수익률을 줄일 수 있는 두 가지 단점이 겪고 있다: 즉, 조 분열 식, 및 분열을 통해 나타나는 사실 중 발생할 수 있는 intein의 특히 반복 확장 된 polyQ와 Httex1에 대 한 집계 인 단백질의 손실로 이어질 수 있는 몇 시간.
이러한 한계를 해결 하 고 아메리카의 생산을 위한 우리의 전략을 수정 하기 위해 태그 무료 Httex1, 우리 시스템을 개발 새로운 식 스모, 더 정확 하 게는 효 모 체 Smt3 Httex1에 과도 융합에 따라. 재조합 단백질의 생산을 위한 스모 시스템의 응용 프로그램 200429, 식의 증가 속도 스모 융해 단백질의 용 해도 시연 했다에 처음 출판 되었다. 스모 태그 인식 사이트를 필요 하지 않습니다 하지만 스모의 3 차 구조를 인식 하 고 실질적으로 miscleavage30의 가능성을 제거 하는 단백질 특정 효소 1 (ULP1) 같은 유비퀴틴에 의해 죽 습 있을 수 있습니다. 또한, ULP1 중재 분열 및 traceless 이며 뒤에 추가 잔류물을 떠나지 않습니다. 퓨전 태그의 조 숙한 분열 autocatalytic intein10관찰은 완전히 피할 수는 외부 효소의 요구에 의해. 스모 전략은 재조합 단백질 생산31,,3233요즘 널리 이용 된다, 하는 동안 우리가 보여이 문서에는 본질적으로 무질서의 세대를 위해 특히 유용 하다 Httex1 같은 집계 경향이, amyloidogenic 단백질. 우리는 믿고 단순성, 효율성 및 우리의 스모 퓨전-기반 방법의 견고성은 네이티브, 태그 무료 Httex1 더 액세스할 수 있도록 연구를 다른 분야에서 생체 외에서 Httex1의 비고유 시퀀스를 사용 하는 필요를 제거 . 이것은 Httex1의 구조-기능 관계를 명료 하 게 하는 미래 연구를 촉진 하는 중요 한 사전 이다.
프로토콜 설명 세균성 문화의 12 L에서 Httex1의 정화 하지만 프로토콜 쉽게 작은 또는 큰 규모 프로덕션에 대 한 적응 될 수 있습니다. 프로토콜 (wtHttex1) 야생 타입 Httex1의 생산에 설명 합니다 (23Q) 아래 polyQ 반복 길이 및 돌연변이 Httex1 (mHttex1)는 polyQ로 (43Q) 위에 길이 병원 성 임계값 (36Q) 반복.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1585px;" width="1585">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:443px;">Uranyl formate (UO2(CHO2)2)</td>
			<td style="width:193px;">EMS</td>
			<td style="width:124px;">22450</td>
			<td style="width:825px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formvar/carbon 200 mesh, Cu 50 grids</td>
			<td>EMS</td>
			<td>FCF200-Cu-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Precision Cell made of Quartz SUPRASIL 1 mm light path from Hellma Analytics</td>
			<td>HellmaAnalytics</td>
			<td>110-1-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buffer Substance Dulbecco&#39;s (PBS w/o Ca and Mg) ancinne ref 47302 (RT) SERVA</td>
			<td>Witech</td>
			<td>SVA4730203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicillin</td>
			<td>AxonLab</td>
			<td>A0839.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luria Broth (Miller&#39;s LB Broth)</td>
			<td>&#160;Chemie Brunschwig</td>
			<td>1551.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>AxonLab</td>
			<td>A1008.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E. coli B ER2566</td>
			<td>NEB</td>
			<td>NEB# E4130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56750-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cOmplete&#160;Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Huntingtin Antibody, a.a. 1-82</td>
			<td>Merck Millipore Corporation</td>
			<td>MAB5492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H + L)</td>
			<td>Licor</td>
			<td>925-68070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMSF</td>
			<td>AxonLab</td>
			<td>A0999.0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HisPrep 16/10 column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28936551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">C4 HPLC column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00G-4168.P0</td>
			<td>&#160;&#160;&#160; 10 &#181;m C4 300 &#197;, LC Column 250 x 21.2 mm, Phenomenex, 19x10 mm guard column, not temperature jacketed</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile HPLC</td>
			<td>MachereyNagel</td>
			<td>C2502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filtre seringue Filtropur S 0,45 ul sans prefiltre sterile</td>
			<td>Sarstedt AG</td>
			<td>83.1826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectrophotometer semi-micro cuvette</td>
			<td style="width:193px;">Reactolab S.A.</td>
			<td>2534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superloop, 1/16&#34; fittings (&#196;KTAdesign), 50 ml</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>18111382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>302031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GREINER Tubes fo FPLC 16 x 100 mm, cap. 12.0 ml</td>
			<td style="width:193px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>7.160 102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;100 kD Microcon&#160; fast flow filters</td>
			<td style="width:193px;">Merck Millipore Corporation</td>
			<td>MRCF0R100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vibra-cell VCX130 ultrasonic liquid processor</td>
			<td>Sonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#196;kta 900 equipped with a fraction collector&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Jasco J-815 Circular Dichroism</td>
			<td>Jasco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters UPLC system&#160;</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>C8 BEH acquity 2.1x100 mm 1.7 micron column&#160; , preheated column (40 &#176;C), flow rate of 0.6 mL/min, injection volume of 4 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">waters HPLC system</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>2489 UV detector and 2535 quaternary gradient module, 20 mL loop in a FlexInject housing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ESI-MS: Finnigan LTQ</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">lyophylizer instrument</td>
			<td>FreeZone 2.5 Plus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tecnai Spirit BioTWIN&#160;</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td>electron microscope equipped with a LaB6 gun and a 4K x 4K FEI Eagle CCD camera (FEI) and operated at 80 kV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C shaking&#160; incubator</td>
			<td>Infors HT multitron Standard</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biophotometer plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of native, untagged huntingtin exon1 monomer and fibrils using a sumo fusion strategy

Huntington의 질병 (HD) CAG 확장 (≥36)에 의해 발생 하는 상속 된 치명적인 신경 질환 HD 유전자의 첫 번째 엑손에서 Huntingtin 단백질 (Htt) 식의 결과로 또는 N 맨끝 확장된 polyglutamine (그 조각 polyQ) 스트레칭입니다.
Huntingtin 단백질 (Httex1)의 exon1는 휴대에 HD의 기능의 대부분을 작은 Htt 조각 및 동물 모델 Htt의 가장 널리 공부 조각 중 하나입니다. Httex1의 작은 크기는 더 이상 조각 또는 전장 Htt에 비해 표준 및 고해상도 기술을 사용 하 여 생물 특성을 실험적으로 더 많은 의무가 있습니다. 그러나, 높은 집계의 성향을 돌연변이 Httex1 (mHttex1) 증가 polyQ 콘텐츠 (≥42)는 어렵게 효율적인 표현과 충분 한 수량에이 단백질을 생산 하 여 그들을 액세스할 수 있도록 정화 시스템 개발 융해 단백질 또는 단백질의 기본 순서를 변경 하는 다른 전략을 사용 하지 않고 다른 분야에서 과학자. 우리는 강력 하 고 최적화 된 방법을 여기 제시 밀리 그램 양의 네이티브의 생산에 대 한 태그-무료 작은 유비퀴틴 관련된 한정자 (스모) 과도 융합에 따라 Httex1. 단순 하 고 전략의 효율성 Httex1, 따라서이 단백질 더 연구자에 게 편리 하 고 다른 실험실에서 실험의 재현성을 향상의 기본이 아닌 시퀀스를 사용 하는 필요를 삭제할 것 이다. 우리는 이러한 발전 또한 Htt로 개발 새로운 진단 도구 및 치료 치료 또는 HD의 진행을 느리게의 구조-기능 관계를 elucidating 겨냥 하는 미래 학문을 촉진 믿습니다.

Httex1는 N 맨끝으로 대장균 에 표현 된다 그의6-스모 태그. 표현과 융해 단백질의 정화의 대표적인 결과 그림 1에서 요약 된다. Httex1 시퀀스 Htt와 Ala2, 시작의 잔류물 2-90 Met1 있기 때문에 완전히 쪼개진 vivo에서42로 구성 됩니다. 23Q 변종 가리킵니다 아미노산의 번호 매기기, 표현된 융해 단백질의 완전 한 순서 그림 1에 표시 됩니다. 플라스 미드는 지역 사회와 공유 하는 가까운 장래에 Addgene에서 예금 될 것 이다. 플라스 미드와 표현된 융해 단백질의 회로도 그림 1B에 표시 됩니다. 융해 단백질의 대부분은 세포의 용 해, 모두는 23Q 및 43Q 변종에 대 한 후 성 분수에 및 His6-스모 Httex1 중간 수준 (그림 1C)에서 표현. 융해 단백질은 분자량에 따라 예상 보다 높은 마이그레이션합니다. 이것은 부분적으로 스모의 강한 배 주로 글루타민, 프롤린 잔류물을 포함 하는 Httex1의 특이 한 시퀀스 구성 때문입니다. Wildtype (23Q)와 돌연변이 (43Q) 융합 단백질 아이맥 (그림 1D) 공동 호스트 단백질 정화의 존재는 Httex1와 큰 샘플의 비교적 낮은 식 수준에 의해 설명 될 수 있다 하 여 ~ 80% 순도 농축 수 볼륨에는 열에 적용입니다.
그의 분열6-스모 태그와 Httex1의 정화 그림 2A에 표시 됩니다. UPLC는 그의 분열을 모니터링 하는 효율적인 도구입니다6-스모 태그 (그림 2B). 융해 단백질의 원래 피크 소비와 두 개의 새롭고 잘 분리 된 봉우리는 그에 해당6-스모 태그와 Httex1 나타납니다. 분열 반응 10-20 분에 완료 됩니다. 서쪽 오 점 (WB) 분열 반응을 효율적으로 모니터링 하는 데 너무 느립니다 하지만 참조용 스모 분열의 완전성을 설명 하기 위해 그림에 포함 되었습니다. 두 Httex1 23Q와 43Q는 그의에서 잘 분리 될 수 있다6-스모 라인란트-HPLC (그림 2C) 하 여 태그와 UPLC, MS 및 SDS 페이지 분석 (그림 2D)와 같이 고 순도에서 얻어 졌다.
이 방법으로 준비 하는 Httex1 단백질 Httex1의 예상된 집계 속성을 유지, 우리는 침 강 분석 결과 의해 37 ° C에서 Httex1 돌연변이의 fibrillization 활동 평가 설명 하기 위해 CD에 의해 이차 구조에 변화를 모니터링 분광학, 편으로 집계의 형태 특징. MHttex1 fibril 형성 침전 분석 결과 의해 결정 된 대로의 집계 활동의 대표적인 데이터 집합그림 3A에 표시 됩니다. 수용 성 Httex1 fibril 형성으로 인해 시간이 지남에 따라 43Q UPLC 여 계량 했다의 손실. 우리 보육의 48 시간 후 수용 성 단백질의 완전 한 고갈을 관찰합니다. 또한, 우리는 CD 분광학 (그림 3B)에 의해 단백질의 이차 구조를 결정. Httex1 43Q 교대에서 구조화 되지 않은 (λ분 205 nm) 주로 β 시트 풍부한 구조 (λ분 215 nm) 외피의 48 시간 후에. 이 구조적인 변화는 48 시간 (그림 3C)에서 가장에 의해 관찰로 긴 원 집계의 형성으로 동반 된다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig1.jpg"> 그림 1 . 식과 정화는 그의6-스모 Httex1 융합 단백질.  (A)는 그의 아미노산 시퀀스6-스모-Httex1-QN 퓨전 구문 (그의6-스모 녹색에서 및 주황색에서 Httex1 QN ); (B) 표현과; 융해 단백질의 정화의 도식 개요 (C) 식과 세포; 후 융합 단백질의 용 해도의 SDS 페이지 분석 융해 단백질의 아이맥 정화 및 SDS 페이지 분수의 분석 (D) 크로마 (빨간 바: 언바운드 분수, 블루 바: 세척 분수, 검은 바: 분수 차입 피크 포함 된); <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig2.jpg"> 그림 2 . 그의 분열6 스모 태그 및 태그 무료 Httex1 QN 단백질의 정화. (A) 회로도 개요; UPLC에 의해 ULP1와 스모 태그의 분열의 (B) 분석 (파란색: ULP1;의 추가 하기 전에 블랙: 20 분 (23Q), 각각 10 분 (43Q) ULP1의 추가 후에) 및 WB (MAB5492 1: 2000, 보조 염소 안티 마우스 항 체 1: 5000); Httex1;의 대리점 RP HPLC 정화의 (C) 크로마 D: UPLC에 의해 순화 Httex1의 분석 SDS 페이지와 ESI-MS; 예상된 분자량 각각 9943 다 (23Q)와 12506 다 (43Q) 이다. <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig3.jpg"> 그림 3 . Httex1-43Q의 집계: UPLC에 따라 (A) 침전 분석 결과. (B)와 48 h에 집계의 48 h. (C) 가장 현미경에서 이차 구조의 CD 스펙트럼 (스케일 바는 200 nm). <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

여기, 우리가 현재 네이티브, 태그 무료 단위체의 밀리 그램 수량과 작은 유비퀴틴 관련된 한정자 (스모) 과도 융합에 따라 Huntingtin 단백질 (Httex1)의 exon1의 소의 생산을 위한 강력 하 고 최적화 된 프로토콜.

네이티브, 태그 Huntingtin Exon1 모노 머와 스모 융합 전략을 사용 하 여 소의 생성

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

라이브 셀 Photoaffinity 라벨에 의해 기본 셀룰러 환경에서 작은 분자 결합 단백질의 식별

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

연구

생화학

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

네이티브 전기 영동, In-gel Assay 및 Electroelution으로 미토콘드리아 전자 수송 사슬의 수퍼 콤플렉스 분석

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

가용성과 불용 성 Huntingtin의 해상도 대 한 분류

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

캡처 클릭 화학 기반 RNA 위하여를 사용 하 여 RNA 의무적인 단백질의 포착 (CARIC) 전략

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

형광 효소 분석 결과 플랫폼에 그들의에서 젤 Renaturation 재조합 융합 단백질의 사용

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

미토 콘 드리 아 호흡기 사슬 슈퍼 복합체의 분리 및 분석을 위한 하이브리드 클리어/블루 천연 전기 영동

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

낮은 중간 처리량에서 배양 포유류 세포에서 세포 성장 및 생존에 영향을 미치는 화합물을 식별하는 전략

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

스모를 이용한 스모 변성 단백질의 국 소화-단백질 포착

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

아밀로이드 피브릴스뇌 미토콘드리아의 상호 작용 및 막 관과화

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...