Name: generation of native, untagged huntingtin exon1 monomer and fibrils using a sumo fusion strategy
Uploaded: 2018-06-27T13:30:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy at JoVE.com

Este trabalho foi financiado principalmente pelos subsídios da Fundação CHDI e o Swiss National Science Foundation. Agradecemos a Dr. Sophie Vieweg para discussões útil durante o desenvolvimento deste novo sistema de expressão e outros membros do grupo Lashuel por compartilhar sua experiência com este sistema de expressão e para os seus comentários valiosos e entrado. Agradecemos também o Prof Oliver Hantschel para fornecer o plasmídeo ULP1. Os autores agradecer Dr. John B. Warner e Dr. Senthil K. Thangaraj revisão crítica do manuscrito

Os autores declaram que têm não há conflitos de interesse com o conteúdo deste artigo.

Neste protocolo, descrevemos um procedimento eficiente para obter quantidades de miligrama de nativo, untagged Httex1 que contenham resíduos de glutamina 23 ou 43. Isto foi conseguido por expressar Httex1 como uma fusão do C-terminal para seus6-marca de sumô, que é usado para isolar a proteína de fusão da célula lisada por IMAC e é clivado antes da purificação de HPLC de Httex1. Enquanto a estratégia de sumô tem sido usada na produção de várias outras proteínas, nosso método mostra que as propriedades únicas de que sumô também poderia ser usado para gerar intrinsecamente desordenado, sujeitos a agregação da proteína amiloidogénicos que anteriormente demonstraram ser extremamente difícil de manipular e produzir43,44. Apresentamos um protocolo que é simples, fácil de usar e comparável a um protocolo para a geração de uma proteína "bem comportada". A fusão de sumô solubiliza e estabiliza o Httex1 durante a expressão e a etapa de purificação do IMAC. Clivagem prematura da tag, como observado com a estratégia de intein10 e agregação já não eram um problema.
Proteínas intrinsecamente desordenadas são especialmente vulneráveis à degradação. Enquanto a degradação do N-terminal da região N17 não é um problema usando este protocolo, truncamentos no PRD de Httex1 podem ocorrer. Como as proteínas truncadas são muito semelhantes aos Httex1 em tamanho, carga e hidrofobicidade, removendo-os por meio de cromatografia em fase gasosa é um desafio, assim é melhor evitar a sua formação em primeiro lugar. Aderindo intimamente ao protocolo, sempre trabalhando no gelo e usando uma quantidade suficiente de inibidor de protease devem ajudar a manter o nível de truncamento observado muito baixa. Aplicar uma tag de fusão no C-terminal de Httex1 poderia remover truncamentos no PRD facilmente como a proteína truncada perderia a tag afinidade também. No entanto, não se a sequência nativa precisa ser mantida que esta opção não pode ser aplicada como Httex1 termina com prolina e o melhor de nosso conhecimento há nenhum C-terminal de fusao que é conhecidos por induzir a clivagem traceless e eficiente depois de prolina.
A parte mais crítica do protocolo é a manipulação do Httex1 libertado após a clivagem da marca de sumô por ULP1. A proteína deve ser purificada imediatamente por RP-HPLC. Felizmente, esta é uma reação eficiente e rápida que normalmente é concluída em 10-20 min a 4 ° C. Em contraste, a estratégia de intein necessárias várias horas para clivagem completa de intein, exigindo um trade-off entre a clivagem incompleta e agregação de início a fim de maximizar o rendimento. Um rápido exame é necessário para o mutante Httex1, como ele vai começar a agregar na comparativamente alta concentração presente na reação de clivagem, Considerando que a variante 23Q é estável por mais tempo. Durante a purificação RP-HPLC, outra vantagem do sumô torna-se evidente: enquanto o Ssp DnaB intein é hidrofóbico e adere fortemente à coluna, sumô é mais hidrofílico e elutes completamente da coluna de fase reversa de C4. Embora ULP1 comercial é muito caro, a proteína pode ser facilmente produzida em alto rendimento seguindo protocolos publicados anteriormente29.
A importância crítica da aplicação de um protocolo de desagregação antes usando o Httex1 não pode ser suficiente sublinhado. Liofilizado polyQ proteínas tais como Httex1 são estáveis e podem ser armazenados longos períodos, mas não são completamente solúveis em água e buffers. A presença de oligômeros pré-formadas ou fibrilas poderia ter um impacto significativo na cinética de agregação e propriedades biofísicas do proteína45. O protocolo de desagregação descrito aqui permite a desagregação da proteína, remoção dos agregados pré-formadas e geração de uma solução de Httex1 monomérica de uma amostra liofilizada. Observamos morfologia de cinética e fibrila agregação similar obtidos com o SUMO e a estratégia de intein de Httex1.
Em comparação com os métodos anteriores para a produção de Httex1, a estratégia de sumô descrita aqui oferece diversas vantagens e expande a gama de possíveis estudos para investigar a estrutura e propriedades funcionais desta proteína na saúde e na doença. A proteína de fusão de sumô-Httex1 é fácil de manusear, pode ser congelado e armazenado ou mantido em solução por 24 horas à temperatura ambiente, enquanto o mHttex1 livre iria agregar rapidamente. A estabilidade e alta solubilidade das proteínas de fusão de sumô-Httex1 fornecem maior flexibilidade para manipular a proteína e/ou introduzir modificações enzimáticas e químicas em mHttex1 que não seriam possíveis após a clivagem. Isso inclui a introdução de modificações borne-translational fluorophores, rotação de rótulos, etiquetas de biotina, etc os avanços apresentados aqui devem 1) facilitar futuros estudos para elucidar as relações estrutura-função de Httex1; 2) gerar novas ferramentas para investigar Htt agregação e patologia espalhando; 3) permitem o desenvolvimento de novos ensaios para identificar moléculas que estabilizar mutante Httex1 e impedem sua agregação; e 4) incentivar os cientistas de outras áreas para trazer para o trabalho sobre esta proteína e se juntar a nossa busca para encontrar a cura para a doença de Huntington.

HTT é uma proteína de 348 kDa e tem sido implicado em várias funções fisiológicas1. Quando Htt contém uma região expandida polyQ de mais de 36 resíduos em seu N-terminal, que provoca HD2,3. Patologia de HD é caracterizada por inclusões celulares no corpo estriado e córtex, que leva à morte neuronal e atrofia dos tecidos afetados4,5. Vários fragmentos de Htt N-terminal que contém o intervalo de repetição polyQ foram detectados no post-mortem de cérebros de doentes de Huntington e são pensados para ser gerado pelo processamento proteolítica da proteína huntingtina6. Estudos recentes sugerem que Httex1 também pode ser formada devido a emenda de mRNA aberrante. Httex1 contém a mutação polyQ patológica e sua superexpressão em animais pode recapitular muitas das principais características do HD7, destacando, assim, um possível papel central deste fragmento em HD patologia e doença progressão6, 8,9.
Devido a agregação alta propensão de mutantes Httex1 (mHttex1) com polyQ expandida do trato, a maioria dos sistemas de expressão existentes baseiam-se a fusão transiente de Httex1 às proteínas (como a glutationa S-transferase (GST), tioredoxina (TRX) ou maltose-proteína (MBP) e/ou peptídeos (poli-histidina) que diferencialmente melhorar sua expressão, estabilidade, purificação e/ou solubilidade10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,,27,28. O parceiro de fusão está ligado à Httex1 com uma sequência curta, contendo um local de clivagem por proteases como a tripsina, tabacco etch protease do vírus (TEV) ou PreScission para permitir a clivagem e a libertação de Httex1 antes do início da agregação ou purificação. Deficiências desses métodos incluem a possibilidade de deixar resíduos adicionais devido à não-traceless clivagem e a criação de fragmentos truncados devido miscleavage dentro da sequência de Httex1, além de heterogeneidade devido à clivagem incompleta ( Ver Vieweg et al . para uma discussão mais aprofundada, sobre as vantagens e limitações desta abordagem)10. Para lidar com essas limitações, recentemente desenvolvemos uma estratégia de expressão, possibilitando a geração de Httex1 livre de marca nativo pela primeira vez, utilizando uma fusão de N-terminal transiente do Synechocystis SP. (Ssp) DnaB intein a Httex110. Enquanto a clivagem intein é traceless e específico e produz quantidade mg de proteínas, que ainda sofre de dois inconvenientes que poderiam reduzir o rendimento: ou seja, prematura clivagem do intein que pode ocorrer durante a expressão e o facto de clivagem ocorre sobre várias horas, que podem levar à perda de proteína devido à agregação, especialmente para Httex1 com repetições polyQ expandido.
Para resolver essas limitações e refinar a nossa estratégia para a produção de nativo, livre de marca Httex1, desenvolvemos um novo sistema de expressão baseado em fusão transiente de sumô, mais exatamente o fermento do homólogo Smt3 para Httex1. A aplicação do sistema para a produção de proteínas recombinantes de sumô foi publicado pela primeira vez em 200429, onde demonstrou-se um aumento da taxa de expressão e solubilidade da proteína de fusão de sumô. A tag de sumô pode ser clivada pela ubiquitina como específicos da proteína protease 1 (ULP1), que não necessita de um site de reconhecimento, mas reconhece a estrutura terciária de sumô e praticamente elimina a possibilidade de miscleavage30. Além disso, a clivagem mediada por ULP1 é rápido e traceless e não deixa resíduos adicionais para trás. A clivagem prematura da marca de fusão, como observado com a autocatalytic intein10, completamente é evitada pela exigência de uma protease externo. Enquanto a estratégia de sumô é hoje amplamente utilizada para a produção de proteínas recombinantes a31,32,33, demonstramos neste artigo o que é especialmente útil para a geração de uma intrinsecamente desordenado, sujeitos a agregação amiloidogénicos proteína tais como Httex1. Acreditamos que a simplicidade, eficiência e robustez de nosso método baseada em SUMO-fusão vão fazer Httex1 nativo, livre de marca mais acessível aos pesquisadores de diferentes disciplinas e eliminar a necessidade de usar sequências não-nativas de Httex1 em vitro . Este é um avanço importante que facilitará futuros estudos para elucidar a relação estrutura-função de Httex1.
O protocolo descreve a purificação do Httex1 de 12 L de cultura bacteriana, mas o protocolo pode ser facilmente adaptado para as produções de menor ou maior escala. O protocolo descreve a produção de tipo selvagem Httex1 (wtHttex1) com um comprimento de repetição polyQ abaixo (23Q) e mutante Httex1 (mHttex1) com um polyQ repetir comprimento acima (43Q) o limiar patogénico (36Q).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1585px;" width="1585">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:443px;">Uranyl formate (UO2(CHO2)2)</td>
			<td style="width:193px;">EMS</td>
			<td style="width:124px;">22450</td>
			<td style="width:825px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formvar/carbon 200 mesh, Cu 50 grids</td>
			<td>EMS</td>
			<td>FCF200-Cu-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Precision Cell made of Quartz SUPRASIL 1 mm light path from Hellma Analytics</td>
			<td>HellmaAnalytics</td>
			<td>110-1-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buffer Substance Dulbecco&#39;s (PBS w/o Ca and Mg) ancinne ref 47302 (RT) SERVA</td>
			<td>Witech</td>
			<td>SVA4730203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicillin</td>
			<td>AxonLab</td>
			<td>A0839.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luria Broth (Miller&#39;s LB Broth)</td>
			<td>&#160;Chemie Brunschwig</td>
			<td>1551.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>AxonLab</td>
			<td>A1008.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E. coli B ER2566</td>
			<td>NEB</td>
			<td>NEB# E4130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56750-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cOmplete&#160;Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Huntingtin Antibody, a.a. 1-82</td>
			<td>Merck Millipore Corporation</td>
			<td>MAB5492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H + L)</td>
			<td>Licor</td>
			<td>925-68070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMSF</td>
			<td>AxonLab</td>
			<td>A0999.0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HisPrep 16/10 column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28936551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">C4 HPLC column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00G-4168.P0</td>
			<td>&#160;&#160;&#160; 10 &#181;m C4 300 &#197;, LC Column 250 x 21.2 mm, Phenomenex, 19x10 mm guard column, not temperature jacketed</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile HPLC</td>
			<td>MachereyNagel</td>
			<td>C2502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filtre seringue Filtropur S 0,45 ul sans prefiltre sterile</td>
			<td>Sarstedt AG</td>
			<td>83.1826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectrophotometer semi-micro cuvette</td>
			<td style="width:193px;">Reactolab S.A.</td>
			<td>2534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superloop, 1/16&#34; fittings (&#196;KTAdesign), 50 ml</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>18111382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>302031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GREINER Tubes fo FPLC 16 x 100 mm, cap. 12.0 ml</td>
			<td style="width:193px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>7.160 102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;100 kD Microcon&#160; fast flow filters</td>
			<td style="width:193px;">Merck Millipore Corporation</td>
			<td>MRCF0R100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vibra-cell VCX130 ultrasonic liquid processor</td>
			<td>Sonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#196;kta 900 equipped with a fraction collector&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Jasco J-815 Circular Dichroism</td>
			<td>Jasco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters UPLC system&#160;</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>C8 BEH acquity 2.1x100 mm 1.7 micron column&#160; , preheated column (40 &#176;C), flow rate of 0.6 mL/min, injection volume of 4 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">waters HPLC system</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>2489 UV detector and 2535 quaternary gradient module, 20 mL loop in a FlexInject housing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ESI-MS: Finnigan LTQ</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">lyophylizer instrument</td>
			<td>FreeZone 2.5 Plus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tecnai Spirit BioTWIN&#160;</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td>electron microscope equipped with a LaB6 gun and a 4K x 4K FEI Eagle CCD camera (FEI) and operated at 80 kV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C shaking&#160; incubator</td>
			<td>Infors HT multitron Standard</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biophotometer plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of native, untagged huntingtin exon1 monomer and fibrils using a sumo fusion strategy

A doença de Huntington (HD) é uma doença hereditária neurodegenerativa fatal causada por uma expansão de CAG (≥36) no primeiro exon do gene HD, resultando na expressão da proteína do Huntingtin (Htt) ou N-terminal respectivos fragmentos com um (polyglutamine expandido trecho do polyQ).
O exon1 da proteína huntingtina (Httex1) é o menor fragmento de Htt que recapitula a muitos dos recursos de HD em celular e animal modelos e é um dos mais amplamente estudados fragmentos de Htt. O pequeno tamanho do Httex1 torna experimentalmente mais receptivos a caracterização biofísica, usando técnicas padrão e de alta resolução, em comparação com mais fragmentos ou Htt completo. No entanto, a agregação alta propensão de mutantes Httex1 (mHttex1) com conteúdo polyQ aumentada (≥42) tem dificultado a desenvolver expressão eficiente e sistemas de purificação para produzir essas proteínas em quantidades suficientes e torná-los acessíveis para cientistas de diferentes disciplinas, sem o uso de proteínas da fusão ou outras estratégias que alteram a sequência nativa da proteína. Apresentamos aqui um método robusto e otimizado para a produção de quantidades de miligrama de nativo, marca isento de Httex1 com base na fusão transitória do ubiquitin pequeno modificador relacionados (SUMO). A simplicidade e a eficiência da estratégia vão eliminar a necessidade de usar sequências não-nativas de Httex1, assim, tornando esta proteína mais acessível aos investigadores e melhorar a reprodutibilidade de experimentos em laboratórios diferentes. Acreditamos que estes avanços também facilitará estudos futuros vistos elucidar a relação estrutura-função de Htt, bem como desenvolver novas ferramentas de diagnósticos e terapias para tratar ou retardar a progressão da DH.

Httex1 é expresso em e. coli com um N-terminal dele6-marca SUMO. Os resultados representativos da expressão e purificação da proteína de fusão são resumidos na Figura 1. A sequência de Httex1 consiste dos resíduos 2-90 de Htt e começa com Ala2, porque Met1 é totalmente clivada em vivo42. A numeração dos aminoácidos refere-se a variante 23Q, a sequência completa da proteína expressa fusão é mostrada na Figura 1A. Os plasmideos serão depositados no Addgene em um futuro próximo para ser compartilhado com a Comunidade. Um esquema do plasmídeo e a proteína de fusão expressa é mostrado na Figura 1B. Httex1 His6-SUMO expressa a um nível médio (Figura 1C) e maior parte da proteína de fusão está presente na fração solúvel após Lise, tanto para o 23Q e a variante de 43Q. A proteína de fusão migra mais alto do que o esperado, com base no peso molecular. Isto é parcialmente devido a forte dobra de sumô, mas principalmente devido à composição de sequência incomum de Httex1, contendo principalmente resíduos de glutamina e prolina. Tanto a sua (23Q) e o mutante (43Q) proteína de fusão pode ser enriquecida a ~ 80% de pureza por IMAC (Figura 1D), a presença de co, purificação da proteína do hospedeiro pode ser explicada pelo nível comparativamente baixa expressão de Httex1 e o grande exemplo volume aplicado à coluna.
O decote de seus6-marca de sumô e a purificação de Httex1 é mostrado na Figura 2. UPLC é uma ferramenta eficiente para monitorar o decote de seus6-marca de sumô (Figura 2B). O pico original da proteína de fusão é consumido e dois picos de novos e bem separados do seu correspondente6-marca de sumô e Httex1 aparecem. A reação de clivagem é terminada em 10-20 min. O Western Blot (WB) é muito lento para acompanhar a reação de clivagem com eficiência, mas foi incluída na figura para referência e para demonstrar a completude da clivagem do sumô. Ambos Httex1 23Q e 43Q podem ser separados bem desde os seus6-sumô tag por RP-HPLC (Figura 2C) e foram obtidos em elevado grau de pureza, como demonstrado pela análise UPLC, MS e SDS-PAGE (Figura 2D).
Para ilustrar que as proteínas Httex1 preparadas por este método mantêm as propriedades de agregação esperado do Httex1, avaliamos a cinética de fibrillization da mutante Httex1 a 37 ° C por um ensaio de sedimentação, monitorado as mudanças na estrutura secundária por CD espectroscopia e caracteriza-se a morfologia dos agregados pela TEM. Um conjunto de dados representativo da cinética de agregação de mHttex1 formação de fibrila conforme determinado por um ensaio de sedimentação é mostrado naFigura 3. A perda de Httex1 solúvel 43Q ao longo do tempo, devido à formação de fibrila foi quantificada por UPLC. Observamos uma completa depleção de proteína solúvel após 48 horas de incubação. Além disso, nós determinamos a estrutura secundária da proteína por espectroscopia de CD (Figura 3B). Httex1 43Q turnos de não-estruturados (λmin 205 nm) para conformação rica principalmente β-folha (λmin 215 nm) após 48 horas de incubação. Esta mudança estrutural é acompanhada pela formação de agregados tempo fibrillar como observável pela TEM 48 horas (Figura 3C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig1.jpg"> Figura 1 . Expressão e purificação de seus6-proteína de fusão de sumô Httex1.  (A), a sequência de aminoácidos de seus6-sumô-Httex1-QN fusão construções (seu6-sumô em verde e Httex1-QN em laranja); (B) visão geral esquemática da expressão e purificação da proteína de fusão; (C) análise de SDS-PAGE de expressão e a solubilidade da proteína de fusão após lise; (D) cromatograma da purificação da proteína de fusão do IMAC e análise das frações por SDS-PAGE (barra vermelha: barra de fração desacoplado, azul: fração de lavagem, preto bar: frações contendo o pico de eluição); <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig2.jpg"> Figura 2 . Clivagem de seus6 sumô tag e purificação de proteínas de Httex1-QN marca-livre. Visão esquemática do (A); (B) análise da clivagem da marca de sumô com ULP1 por UPLC (azul: antes da adição de ULP1; preto: 20 min (23Q), respectivamente de 10 min (43Q) após a adição de ULP1) e BM (MAB5492 1: 2000, secundário de cabra anti rato anticorpo 1:5000); (C) cromatograma da purificação RP-HPLC preparativa de Httex1; D: análise do Httex1 purificado por UPLC, SDS-PAGE e ESI-MS; o peso molecular esperado é Da 9943 (23Q) e Da 12506 (43Q) respectivamente. <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig3.jpg"> Figura 3 . Agregação de Httex1-43Q: ensaio de sedimentação (A) com base em UPLC. (B) CD espectros da estrutura secundária às 0 h e micrografias de 48 h. (C) temperatura dos agregados a 48 h (barras de escala são 200 nm). <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

Aqui, apresentamos um protocolo robusto e otimizado para a produção de quantidades de miligrama de monômeros nativos, livre de marca e fibrilas do exon1 da proteína huntingtina (Httex1) com base na fusão transitória do ubiquitin pequeno modificador relacionados (SUMO).

Geração de nativos, sem marcas de formatação da huntingtina Exon1 monômero e fibrilas usando uma estratégia de fusão de sumô

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Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interações com e permeabilização de membrana de mitocôndrias cerebrais por fibrilas amiloides

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...