Name: generation of native, untagged huntingtin exon1 monomer and fibrils using a sumo fusion strategy
Uploaded: 2018-06-27T13:30:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy at JoVE.com

Эта работа финансировалась главным образом за счет субсидий Фонд CHDI и Швейцарский Национальный научный фонд. Мы благодарим д-ра Софи Vieweg для полезных обсуждений при разработке этой новой системы выражения и другие члены группы Lashuel для обмена их опытом с этой системой выражение и для их ввода и ценную обратную связь. Мы также благодарим профессор Оливер моделях за предоставление ULP1 плазмиды. Авторы благодарят д-р Джон Уорнер и доктор Сентил K. Thangaraj для критического обзора манускрипта

Авторы заявляют, что они имеют без конфликта интересов с содержанием этой статьи.

В этом протоколе, мы наметили эффективной процедуры для получения количества миллиграмм родной, непомеченные Httex1 содержащий остатков глутаминовой 23 или 43. Это было достигнуто путем выражения Httex1 как C-терминал fusion его6-сумо тег, который используется для изоляции синтез белка от lysate клетки IMAC и расщепляется до ВЭЖХ очистки Httex1. В то время как стратегия сумо был использован в производстве ряда других белков, наш метод показывает, что уникальные свойства сумо также могут быть использованы для создания неразрывно расстройством, подверженных агрегации, amyloidogenic белок, который ранее оказались чрезвычайно трудно обрабатывать и производят4443,. Мы представляем протокол, простой, легкий в использовании и сопоставимых протокол для поколения «хорошо себя» белка. СУМО fusion solubilizes и стабилизирует Httex1 во время выражения и шаг очищение IMAC. Преждевременное расщепления тега, как заметил с intein стратегии10 и агрегации больше не были проблемой.
Неразрывно неупорядоченных белки являются особенно подвержены деградации. В то время как N-терминальный деградации в регионе N17 является не вопросом, используя этот протокол, усечения в ОД Httex1 может произойти. Как усеченный белки являются очень похож на Httex1, гидрофобность и размер, удаляя их газохроматографического средствами является сложной задачей, таким образом это лучше, чтобы предотвратить их образование в первую очередь. Отклонившись протокол, всегда работает на льду и с помощью достаточное количество ингибитора протеазы должны помочь сохранить уровень наблюдаемых усечения очень низкая. Применение тега сплавливание на C-конечная Httex1 может удалить усечения в ПДР легко как усеченный белка потеряет близости тег также. Однако если родной последовательности должна быть сохранена, что этот параметр не может применяться как Httex1 заканчивается пролина и в меру наших знаний есть теги Фьюжн не C-терминала, которые известны побудить бесследного и эффективного расщепления после пролина.
Наиболее важной частью протокола является обработка Httex1, освобожден после расщепления сумо тега ULP1. Протеин следует немедленно неразделимая RP-ВЭЖХ. К счастью это эффективной и быстрой реакции, которая завершается обычно в 10-20 мин при 4 ° C. В противоположность этому intein стратегия требуется несколько часов для полного расщепления intein, таким образом, требует компромисса между неполного расщепления и начало агрегации для того чтобы увеличить урожайность. Быстрой обработки требуется для мутантов Httex1, как он начнет агрегировать при сравнительно высокой концентрации в реакции расщепления, тогда как вариант 23Q стабильным в течение длительного времени. Во время очистки RP-ВЭЖХ, еще одно преимущество сумо становится очевидным: в то время как Ssp DnaB intein гидрофобных и сильно прилипает к столбцу, сумо более гидрофильных и полностью elutes в столбце обратная фаза C4. Хотя коммерческие ULP1 является довольно дорогостоящим, белок может выпускаться в высокодоходных после ранее опубликованные протоколы29легко.
Важное значение применения протокола дезагрегирования перед использованием Httex1 не может быть подчеркнуто достаточно. Лиофилизированные polyQ белков, таких как Httex1 являются стабильными и может быть хранимой длительных периодов, но не полностью растворим в воде и буферов. Наличие предварительно олигомеров или фибриллами может иметь значительное влияние на кинетику агрегации и биофизические свойства белка45. Протокол дезагрегирования, описанный здесь позволяет дезагрегирования белка, удаление предварительно агрегатов и поколения раствора мономерных Httex1 от лиофилизированные образца. Мы наблюдали аналогичные агрегации кинетики и фибриллярных морфологии для Httex1, полученные с сумо и intein стратегии.
По сравнению с предыдущими методами для производства Httex1, сумо стратегии, описанные здесь предлагает несколько преимуществ и расширяет спектр возможных исследований для изучения структуры и функциональных свойств этого белка в здоровье и болезни. СУМО-Httex1 синтез белка прост в обращении, может быть заморожен и хранится или хранится в решение для 24 ч при комнатной температуре, в то время как свободный mHttex1 бы агрегировать быстро. Стабильность и высокая растворимость белков фьюжн сумо-Httex1 обеспечивают большую гибкость для манипуляции белка и/или ферментативные и химические изменения в mHttex1, что в противном случае не будет возможно после расщепления. Это включает в себя введение столб-поступательные изменения, флуорофоров, спина этикетки, биотин Теги и т.д. авансы, представленные здесь должно 1) облегчить будущие исследования для выяснения отношений структура функция Httex1; 2) генерировать новые инструменты для расследования Htt агрегации и распространения патологии; 3) содействовать развитию новых анализов для выявления молекулы, которые стабилизируют мутант Httex1 и предотвратить его агрегирования; и 4) поощрять ученых из других областей довести работу на этот белок и присоединиться к нашей поиски, чтобы найти лекарства от болезни Гентингтона.

HTT — 348 kDa белок и был вовлечен в несколько физиологических функций1. Когда Htt содержит расширенный polyQ региона более чем 36 остатков в его N-отель terminus, это вызывает HD2,3. HD патологии характеризуется клеточных включений в полосатом теле и коры головного мозга, что приводит к гибели нейронов и атрофией пораженных тканей4,5. Несколько фрагментов N-терминальный Htt, которые содержат повторить урочище polyQ были обнаружены в post-mortem мозги от HD пациентов и подуманы быть порождена протеолитических обработки белка гентингтина6. Последние исследования показывают, что Httex1 также может быть сформирован из-за ошибочной сплайсинга мРНК. Httex1 содержит патологических polyQ мутации и его гиперэкспрессия в животных можно резюмировать многие из ключевых особенностей HD7, таким образом подчеркнув возможной центральную роль этого фрагмента в HD патологии и болезнь прогрессии6, 8,9.
Из-за высокой агрегации склонность мутант Httex1 (mHttex1) с расширенной polyQ тракта, большинство существующих систем выражения основаны на переходных фьюжн Httex1 белков (например, глутатион S-трансферазы (GST), thioredoxin (TRX) или мальтоза привязки белка (MBP) и/или пептиды (поли гистидин), которые дифференцировано улучшить ее выражение, стабильность, очистки или растворимость10,11,12,,13,14 ,,1516,,1718,19,20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. Fusion партнером связан с Httex1 с короткой последовательность, содержащую сайт расщепления для протеаз например трипсина, табачные etch протеазы вируса (TEV) или PreScission для расщепления и выпуска Httex1 до начала агрегации или очистки. Недостатки этих методов включают возможность оставить дополнительные остатки из-за не бесследного расщепления и создание усеченного фрагментов из-за miscleavage в пределах последовательности Httex1, помимо неоднородности вследствие неполного расщепления) см Vieweg et al. для более углубленного обсуждения на преимущества и недостатки этого подхода)10. Чтобы устранить эти ограничения, мы недавно разработала стратегию выражение, позволяя Генерация тегов бесплатно родной Httex1 в первый раз, используя переходных N-терминальный слияние Synechocystis sp. (Ssp) DnaB intein Httex110. В то время как intein расщепление бесследного и конкретными и дает мг количество белков, он все еще страдает два недостатка, которые могут уменьшить урожайность: а именно, преждевременной расщепление intein, которые могут произойти во время выражения и тот факт, что раскол происходит через несколько часов, которые могут привести к потери белка благодаря агрегации, особенно для Httex1 с расширенной polyQ повторяется.
Для устранения этих недостатков и совершенствовать нашу стратегию для производства родной, тег свободный Httex1, мы разработали новую систему выражение на основе переходных фьюжн сумо, более точно гомолога дрожжи СМТ3 к Httex1. Применение системы сумо для производство рекомбинантных белков был впервые опубликован в 2004 году29, где было продемонстрировано повышенную ставку выражения и растворимость сумо синтез белка. СУМО тег может быть расщепляется помощью убиквитин как белка конкретных протеазы 1 (ULP1), который не требует признания сайт, но признает Третичная структура сумо и практически исключает возможность miscleavage30. Кроме того ULP1-опосредованной расщепления быстро и бесследное и не оставляют дополнительные остатки. Преждевременная расщепления фьюжн тега, как заметил с автокаталитических intein10, полностью избежать требование внешней протеазы. В то время как стратегия сумо в настоящее время широко используется для рекомбинантных белков производство31,,3233, мы демонстрируем в настоящем документе, что это особенно полезно для поколения неразрывно расстройствами, агрегирование подверженных, amyloidogenic белков, таких как Httex1. Мы считаем, что простота, эффективность и надежность нашего метода на основе сумо фьюжн сделает родной, тег бесплатные Httex1 более доступным для исследователей из различных дисциплин и устранить необходимость использования неместных последовательности Httex1 в пробирке . Это важный шаг вперед, что облегчит будущие исследования для прояснения связи структура функция Httex1.
Протокол описывает очистка Httex1 от 12 Л бактериальной культуры, но протокол могут быть легко адаптированы для меньшего или большего масштаба производства. Протокол описывает производства дикого типа Httex1 (wtHttex1) с polyQ повторить Длина ниже (23Q) и мутанта Httex1 (mHttex1) с polyQ повторить длина выше (43Q) патогенных порог (36Q).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1585px;" width="1585">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:443px;">Uranyl formate (UO2(CHO2)2)</td>
			<td style="width:193px;">EMS</td>
			<td style="width:124px;">22450</td>
			<td style="width:825px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formvar/carbon 200 mesh, Cu 50 grids</td>
			<td>EMS</td>
			<td>FCF200-Cu-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Precision Cell made of Quartz SUPRASIL 1 mm light path from Hellma Analytics</td>
			<td>HellmaAnalytics</td>
			<td>110-1-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buffer Substance Dulbecco&#39;s (PBS w/o Ca and Mg) ancinne ref 47302 (RT) SERVA</td>
			<td>Witech</td>
			<td>SVA4730203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicillin</td>
			<td>AxonLab</td>
			<td>A0839.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luria Broth (Miller&#39;s LB Broth)</td>
			<td>&#160;Chemie Brunschwig</td>
			<td>1551.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>AxonLab</td>
			<td>A1008.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E. coli B ER2566</td>
			<td>NEB</td>
			<td>NEB# E4130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56750-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cOmplete&#160;Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Huntingtin Antibody, a.a. 1-82</td>
			<td>Merck Millipore Corporation</td>
			<td>MAB5492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H + L)</td>
			<td>Licor</td>
			<td>925-68070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMSF</td>
			<td>AxonLab</td>
			<td>A0999.0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HisPrep 16/10 column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28936551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">C4 HPLC column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00G-4168.P0</td>
			<td>&#160;&#160;&#160; 10 &#181;m C4 300 &#197;, LC Column 250 x 21.2 mm, Phenomenex, 19x10 mm guard column, not temperature jacketed</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile HPLC</td>
			<td>MachereyNagel</td>
			<td>C2502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filtre seringue Filtropur S 0,45 ul sans prefiltre sterile</td>
			<td>Sarstedt AG</td>
			<td>83.1826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectrophotometer semi-micro cuvette</td>
			<td style="width:193px;">Reactolab S.A.</td>
			<td>2534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superloop, 1/16&#34; fittings (&#196;KTAdesign), 50 ml</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>18111382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>302031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GREINER Tubes fo FPLC 16 x 100 mm, cap. 12.0 ml</td>
			<td style="width:193px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>7.160 102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;100 kD Microcon&#160; fast flow filters</td>
			<td style="width:193px;">Merck Millipore Corporation</td>
			<td>MRCF0R100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vibra-cell VCX130 ultrasonic liquid processor</td>
			<td>Sonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#196;kta 900 equipped with a fraction collector&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Jasco J-815 Circular Dichroism</td>
			<td>Jasco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters UPLC system&#160;</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>C8 BEH acquity 2.1x100 mm 1.7 micron column&#160; , preheated column (40 &#176;C), flow rate of 0.6 mL/min, injection volume of 4 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">waters HPLC system</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>2489 UV detector and 2535 quaternary gradient module, 20 mL loop in a FlexInject housing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ESI-MS: Finnigan LTQ</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">lyophylizer instrument</td>
			<td>FreeZone 2.5 Plus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tecnai Spirit BioTWIN&#160;</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td>electron microscope equipped with a LaB6 gun and a 4K x 4K FEI Eagle CCD camera (FEI) and operated at 80 kV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C shaking&#160; incubator</td>
			<td>Infors HT multitron Standard</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biophotometer plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of native, untagged huntingtin exon1 monomer and fibrils using a sumo fusion strategy

Болезнь Гентингтона (HD) является унаследованным смертельным нейродегенеративных заболеваний, вызванных расширением CAG (≥36) в первом экзона гена HD, что приводит к экспрессии белка гентингтина (НТТ) или N-терминальный фрагменты их с расширенной Хантингтона ( участок polyQ).
Exon1 белок гентингтин (Httex1) — маленький фрагмент Htt, который повторяет многие из особенностей HD в сотовых и животных моделей и является одним из наиболее широко изучены фрагментов Htt. Маленький размер Httex1 делает его экспериментально более пригодным для биофизические характеристики с использованием стандартного и высокого разрешения методов по сравнению с больше фрагментов или полноразмерные Htt. Однако высокая агрегации склонность мутант Httex1 (mHttex1) с повышенной polyQ содержание (≥42) стало трудно развивать эффективное выражение и систем очистки для производства этих белков в достаточных количествах и сделать их доступными для Ученые из различных дисциплин без использования синтеза белков и других стратегий, которые изменяют родной последовательности белка. Мы представляем здесь надежную и оптимизированный метод для производства количество миллиграмм в родной, тег бесплатная Httex1 на основании переходных слияние мелких убиквитин соответствующий модификатор (сумо). Простота и эффективность стратегии позволит устранить необходимость использования неместных последовательности Httex1, таким образом делая этот белок более доступным для исследователей и улучшения воспроизводимость экспериментов в различных лабораториях. Мы считаем, что эти достижения будут также способствовать будущих исследований, направленных на разъяснение связи структура функция Htt, так развивающихся роман средств диагностики и терапии для лечения или замедлить прогрессирование HD.

Httex1 выражается в E. coli с N-терминальный его6-сумо тег. Представитель результаты выражения и очистки синтез белка приводится на рисунке 1. Последовательность Httex1 состоит из остатков 2-90 НТТ и начинается с Ala2, потому что Met1 полностью рассеченного в vivo42. Нумерация аминокислоты относится к 23Q вариант, полная последовательность выраженной синтез белка показано в рисунке 1A. Плазмиды будет депонироваться на Addgene в ближайшем будущем, чтобы быть совместно с сообществом. Схема плазмида и выраженной синтез белка показано в рисунке 1B. Httex1 His6-сумо выражает на среднем уровне (рис. 1C), и большинство синтез белка в растворимая фракция после лизиса, как для 23Q и 43Q вариант. Синтез белка выше, чем ожидалось, переносит, основанный на молекулярный вес. Это частично объясняется сильным лоно сумо, но главным образом из-за необычных последовательности состав Httex1, содержащие главным образом остатков глутаминовой и пролина. Wildtype (23Q) и мутанта (43Q) ~ 80% чистоты синтез белка может обогащаться IMAC (рис. 1D) можно объяснить присутствие совместно очищающая хоста белком сравнительно низкий уровень экспрессии Httex1 и большой образец объем, применяется к столбцу.
Расщепление его6-сумо тег и очистки Httex1 показано в рисунке 2A. UPLC является эффективным инструментом для мониторинга расщепление его6-сумо тег (рис. 2B). Оригинальные пик синтез белка потребляется и два новых и хорошо разделенных пики, соответствующие его6-появляются сумо тег и Httex1. Реакции расщепления закончена в 10-20 мин. Западной помарки (ВБ) слишком медленно, чтобы эффективно контролировать реакции расщепления, но он был включен в рисунке для справки и продемонстрировать полноты сумо расщепления. Оба Httex1 23Q и 43Q могут быть разделены с его6-сумо тег RP-ВЭЖХ (рис. 2C) и были получены в высокой степени чистоты, как показано на UPLC, MS и SDS-PAGE анализа (Рисунок 2D).
Чтобы проиллюстрировать, что Httex1 белков, подготовленный данным методом сохраняют свойства ожидаемый агрегации Httex1, мы оценивали кинетика fibrillization мутант Httex1 при 37 ° C по Пробирной седиментации, мониторинг изменений в вторичной структуре на CD спектроскопия и характеризуются морфология агрегатов по ТЕА. Репрезентативного набора данных агрегации кинетика mHttex1 фибриллярных формирования определяется седиментации пробирного показан нарисунке 3A. Потери растворимых Httex1 43Q со временем, из-за формирования фибриллярных была количественно оценена, UPLC. Мы наблюдаем полное истощение растворимого белка после 48 часов инкубации. Кроме того мы определяется вторичная структура белков CD спектроскопии (рис. 3B). Httex1 43Q переход от неструктурированных (λмин 205 Нм) в основном β-лист богатые конформацию (λмин 215 Нм) после 48 часов инкубации. Это структурное изменение сопровождается образованием долго фибриллярного агрегатов как наблюдаемый по ТЕА на 48 часов (рис. 3C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig1.jpg"> Рисунок 1 . Выражение и очистка его6-протеин сплавливания сумо Httex1.  (A) аминокислотной последовательности его6-сумо-Httex1-QN фьюжн конструкции (его6-сумо в зеленых и Httex1-QN в оранжевый); (B) Схематический обзор выражения и очистки синтез белка; (C) анализ SDS-PAGE выражения и растворимость синтез белка после лизиса; (D) Хроматограмма IMAC очистки синтез белка и анализа фракций, SDS-PAGE (красный бар: несвязанные дроби, Голубой бар: мыть дроби, черную полосу: фракций, содержащих элюции пик); <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig2.jpg"> Рисунок 2 . Расщепление его очистки тегов свободной Httex1-QN белков и6 сумо тег. Схематический обзор (A); (B) анализ расщепления сумо тега с ULP1 по UPLC (синий: перед добавлением ULP1; черный: 20 мин (23Q), соответственно 10 мин (43Q) после добавления ULP1) и Всемирный банк (MAB5492 1: 2000, вторичные коза анти мыши антител 1: 5000); (C) Хроматограмма препаративные RP-ВЭЖХ очистки Httex1; D: анализ очищенный Httex1, UPLC, SDS-PAGE и ESI-МС; Ожидаемые молекулярный вес составляет соответственно 9943 Да (23Q) и 12506 Да (43Q). <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig3.jpg"> Рисунок 3 . Агрегат Httex1-43Q: (A) седиментации assay основанный на UPLC. (B) CD спектры вторичной структуры на 0 h и 48 ч. (C) ТЕА микроскопии агрегатов на 48 ч (Масштаб гистограммы являются 200 Нм). <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy at JoVE.com

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

Здесь мы представляем надежные и оптимизированные протокол для производства количествах миллиграмм родной, тег бесплатные мономеров и фибриллами exon1 белок гентингтин (Httex1) на основе переходных слияние мелких убиквитин соответствующий модификатор (сумо).

Поколения родной, расставленными гентингтина Exon1 мономера и фибрилл, используя стратегию Fusion сумо

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Идентификация малая молекула-связывающих белков в нативной клеточной среде с помощью Live-клеток фотоаффинное мечение

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Разрешающая Affinity Очищенная Белковые комплексы от Синей Native ПААГ и белка корреляции профилирование

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Анализ суперкомплексов транспортной цепи митохондриальных электронов с собственным электрофорезом, в-гель-анализах и электроизлучения

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Фракционирование резолюции растворимых и нерастворимых гентингтина видов

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Захват и идентификации RNA-связывая протеинов с помощью щелчка при содействии химия РНК interactome захвата (ЦАРСКОЕ) стратегии

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Использование рекомбинантных Fusion белков в платформу Assay флуоресцентные протеазы и их выемка в гель

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Гибридный ясный/синий родной электрофорез для разделения и анализа митохондриальных Сверхкомплексов дыхательной цепи

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

Стратегия по выявлению соединений, влияющих на рост клеток и выживаемость в культурных клетках млекопитающих при низкой до умеренной пропускной связи

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Локализация сумо-модифицированных белков с использованием флуоресцентного сумо-улавливания белков

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Взаимодействие с и Мембрана Пермябилизация митохондрий мозга амилоида Фибрилс

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...