Name: generation of native, untagged huntingtin exon1 monomer and fibrils using a sumo fusion strategy
Uploaded: 2018-06-27T13:30:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy at JoVE.com

Detta arbete finansierades främst genom bidrag från stiftelsen CHDI och schweiziska National Science Foundation. Vi tackar Dr Sophie Vieweg för användbar diskussioner under utvecklingen av detta nya uttryck-system och andra medlemmar i gruppen Lashuel för att dela sina erfarenheter med detta uttryck system och deras input och värdefull feedback. Vi tackar också Prof. Oliver Hantschel för att tillhandahålla ULP1 Plasmiden. Författarna tackar Dr. John B. Warner och Dr Senthil K. Thangaraj för kritisk granskning av manuskript

Författarna förklarar att de har inga intressekonflikter med innehållet i denna artikel.

I detta protokoll, har vi sammanställt ett effektivt förfarande för anskaffning milligram kvantiteter av native, omärkta Httex1 som innehåller 23 eller 43 glutamin rester. Detta uppnåddes genom att uttrycka Httex1 som en C-terminal fusion till en hans6-SUMO tagg, som används för att isolera fusion proteinet från cell lysate av IMAC och är tätt innan HPLC rening av Httex1. Medan den SUMO strategin har använts i produktionen av flera andra proteiner, visar vår metod att de unika egenskaperna som SUMO kunde också användas för att generera egensäkra andningsstörningar, aggregation-benägen, amyloidogenic protein som tidigare har visat sig vara extremt svårt att hantera och producera43,44. Vi presenterar ett protokoll som är enkel, lätt att använda och jämförbar med ett protokoll för generering av ett ”skötsam” protein. SUMO fusion solubilizes och stabiliserar Httex1 under uttryck och den IMAC reningssteg. För tidig klyvning av taggen, som observerats med de intein strategi10 och aggregation inte längre var ett problem.
Egensäkra oordnade proteiner är särskilt utsatta för nedbrytning. Medan N-terminala nedbrytning i regionen N17 inte är en fråga som använder detta protokoll, kan truncations i den PRD av Httex1 uppstå. De trunkerade proteinerna är mycket lik Httex1 i vattenavvisande egenskaper, kostnad och storlek, ta bort dem av kromatografiska metoder är utmanande, därför är det bäst att förhindra deras bildning i första hand. Hålla sig nära till protokollet, bör alltid arbetar på is och med en tillräcklig mängd av proteashämmare hjälpa hålla nivån på observerade trunkering mycket låg. Tillämpa en fusion tagg på C-terminus av Httex1 kunde ta bort truncations på PRD enkelt som stympade proteinet skulle förlora affinitet etiketten samt. Det finns dock inga C-terminal fusion taggar som är kända att inducera traceless och effektiv klyvning efter proline om infödda sekvensen behöver underhållas här alternativet inte kan användas som Httex1 slutar med proline och till bäst av vår kunskap.
Den mest kritiska delen i protokollet är hanteringen av den Httex1 befriades efter klyvning av taggen SUMO av ULP1. Proteinet bör renas omedelbart genom RP-HPLC. Lyckligtvis är detta en effektiv och snabb reaktion som är vanligtvis avslutad i 10-20 min vid 4 ° C. Den intein strategin krävs däremot flera timmar för fullständig klyvning av den intein, vilket kräver en avvägning mellan ofullständig klyvning och början aggregering för att maximera avkastningen. En snabb workup krävs för mutant Httex1, som det kommer att börja att aggregera på den jämförelsevis höga koncentrationen som finns i klyvning reaktionen, medan den 23Q varianten är stabil under en längre tid. Under RP-HPLC rening, en annan fördel med SUMO blir uppenbar: medan den Ssp DnaB intein är hydrofoba och sticker starkt till kolumnen, SUMO är mer hydrofil och eluerar helt från kolumnen C4 omvänd fas. Även om kommersiella ULP1 är ganska dyrt, kan proteinet produceras enkelt i hög avkastning efter tidigare publicerade protokoll29.
Den avgörande betydelsen av att tillämpa en disaggregering protokollet innan du använder Httex1 kan inte nog betonas. Frystorkade polyQ proteiner såsom Httex1 är stabila och kan vara lagrade långa perioder, men är inte helt löslig i vatten och buffertar. Förekomsten av förformade oligomerer eller fibriller kan ha en betydande inverkan på aggregation kinetics och biofysiska egenskaper av den protein-45. Områdesindelningen protokollet beskrivs här tillåter en uppdelning av proteinet, borttagning av förformade aggregat och generering av en lösning av monomer Httex1 från ett frystorkat prov. Vi observerade liknande aggregation kinetics och fibrill morfologi för Httex1 erhållande med SUMO och intein strategi.
Jämfört med tidigare metoder för att producera Httex1, SUMO strategin beskrivs här erbjuder flera fördelar och utökar utbudet av möjliga studier för att undersöka strukturen och funktionella egenskaper av detta protein i hälsa och sjukdom. SUMO-Httex1 fusion proteinet är lätt att hantera, det kan vara fryst och lagras eller förvaras i lösning för 24 h vid omgivande temperatur, medan den gratis mHttex1 skulle sammanställa snabbt. Stabilitet och hög löslighet SUMO-Httex1 fusionsproteinerna ger större flexibilitet för att manipulera proteinet eller införa enzymatisk och kemiska ändringar i mHttex1 som annars inte skulle vara möjligt efter klyvning. Detta inkluderar införandet av post-translationella modifieringar, fluorophores, spin etiketter, biotin taggar, etc. bör de förskott som presenteras här 1) underlätta framtida studier för att klarlägga struktur-funktionssamband av Httex1; (2) generera nya verktyg för att undersöka Htt aggregering och patologi spridning. (3) möjliggöra utvecklingen av nya analyser att identifiera molekyler som stabilisera mutant Httex1 och förhindra dess aggregation; och 4) uppmuntra forskare från andra fält att arbeta på detta protein och gå med i vår strävan att hitta botemedel mot Huntingtons sjukdom.

HTT är ett 348 kDa-protein och har varit inblandad i flera fysiologiska funktioner1. När Htt innehåller en utökad polyQ region i mer än 36 rester i dess N-terminalen, orsakar det HD2,3. HD patologi kännetecknas av cellulära inneslutningar i striatum och cortex, vilket leder till neuronala dödsfall och atrofi av den drabbade vävnader4,5. Flera N-terminala Htt-fragment som innehåller den polyQ upprepa tarmkanalen har upptäckts i postmortala hjärnor från HS-patienter och tros vara genereras av proteolytiska bearbetning av huntingtin protein6. Nygjorda studier föreslår att Httex1 också kan bildas på grund av avvikande mRNA splicing. Httex1 innehåller patologiska polyQ mutationen och dess överuttryck i djur kan sammanfatta många av de viktigaste funktionerna i HD7, därmed belysa en möjlig centrala roll i detta fragment i HD patologi och sjukdom progression det6, 8,9.
På grund av den höga aggregering benägenheten av muterade Httex1 (mHttex1) med utökad polyQ tarmkanalen, flesta befintliga uttryck system är baserade på övergående fusion av Httex1 till proteiner (såsom glutation-S-transferas (GST), thioredoxin (TRX) eller maltos-bindande-protein (MBP) och/eller peptider (poly-histidin) som differentially förbättra dess uttryck, stabilitet, rening eller löslighet10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. Fusion partnern är kopplad till Httex1 med en kort sekvens som innehåller en klyvning webbplats för proteaser såsom trypsin, tabacco etch virus (TEV) proteashämmare eller PreScission att tillåta för klyvning och frisättning av Httex1 före inledandet av aggregering eller rening. Brister i dessa metoder inkluderar möjligheten att lämna ytterligare rester på grund av icke-traceless klyvning och skapandet av trunkerade fragment på grund av miscleavage inom sekvensen av Httex1, förutom heterogenitet på grund av ofullständig klyvning) Se Vieweg et al. för mer djupgående diskussion om fördelarna och begränsningarna med denna metod)10. För att hantera dessa begränsningar, utvecklat vi nyligen ett uttryck strategi möjliggöra tagg-fri infödda Httex1 generations för första gången genom att utnyttja en övergående N-terminala fusion av det Synechocystis sp. (Ssp) DnaB intein till Httex110. Medan intein klyvning är traceless och specifika och avkastning mg mängd proteiner, det fortfarande lider två nackdelar som skulle kunna minska avkastningen: nämligen, för tidig klyvning av den intein som kan uppstå under uttrycket, och det faktum att klyvning sker över flera timmar, vilket kan leda till förlust av protein på grund av aggregering, särskilt för Httex1 med utökade polyQ upprepningar.
Att åtgärda dessa begränsningar och att förfina vår strategi för produktion av infödda, tagg-fri Httex1, som vi utvecklat ett nytt uttryck system baserat på övergående fusion av SUMO, mer exakt den jäst homolog Smt3 till Httex1. Tillämpningen av SUMO systemet för produktion av rekombinanta proteiner publicerades först i 200429, där en ökad frekvens av uttryck och löslighet SUMO fusionsprotein visades. SUMO etiketten kan vara klyvs av ubiquitin som protein-specifika proteas 1 (ULP1), som inte kräver en erkännande webbplats, men erkänner SUMO tertiär struktur och praktiskt taget eliminerar möjligheten att miscleavage30. Dessutom ULP1-medierad klyvning är snabb och traceless och lämnar inte ytterligare rester. För tidig klyvning av fusion taggen, undviks som observerats med de autokatalytisk intein10, helt av kravet på en extern proteashämmare. Medan den SUMO strategin används numera flitigt för rekombinant protein produktion31,32,33, visar vi i detta dokument att det är särskilt användbart för generering av ett intimt oordnade, sammanläggning-benägen, amyloidogenic protein såsom Httex1. Vi tror att enkelhet, effektivitet och robustheten hos vår SUMO-fusion-baserade metod kommer att göra native, tagg-fri Httex1 mer tillgänglig för forskare från olika discipliner och eliminera behovet av att använda icke-infödda sekvenser av Httex1 in vitro- . Detta är ett viktigt framsteg som kommer att underlätta framtida studier för att belysa relationen struktur och funktion av Httex1.
Protokollet beskrivs rening av Httex1 från 12 L av bakterieodling, men protokollet kan enkelt anpassas för mindre eller större skala produktioner. Protokollet beskrivs produktionen av vildtyp Httex1 (wtHttex1) med polyQ repetitionslängd nedan (23Q) och mutant Httex1 (mHttex1) med en polyQ upprepa längd ovan (43Q) patogena tröskeln (36Q).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1585px;" width="1585">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:443px;">Uranyl formate (UO2(CHO2)2)</td>
			<td style="width:193px;">EMS</td>
			<td style="width:124px;">22450</td>
			<td style="width:825px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formvar/carbon 200 mesh, Cu 50 grids</td>
			<td>EMS</td>
			<td>FCF200-Cu-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Precision Cell made of Quartz SUPRASIL 1 mm light path from Hellma Analytics</td>
			<td>HellmaAnalytics</td>
			<td>110-1-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buffer Substance Dulbecco&#39;s (PBS w/o Ca and Mg) ancinne ref 47302 (RT) SERVA</td>
			<td>Witech</td>
			<td>SVA4730203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicillin</td>
			<td>AxonLab</td>
			<td>A0839.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luria Broth (Miller&#39;s LB Broth)</td>
			<td>&#160;Chemie Brunschwig</td>
			<td>1551.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>AxonLab</td>
			<td>A1008.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E. coli B ER2566</td>
			<td>NEB</td>
			<td>NEB# E4130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56750-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cOmplete&#160;Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Huntingtin Antibody, a.a. 1-82</td>
			<td>Merck Millipore Corporation</td>
			<td>MAB5492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H + L)</td>
			<td>Licor</td>
			<td>925-68070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMSF</td>
			<td>AxonLab</td>
			<td>A0999.0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HisPrep 16/10 column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28936551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">C4 HPLC column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00G-4168.P0</td>
			<td>&#160;&#160;&#160; 10 &#181;m C4 300 &#197;, LC Column 250 x 21.2 mm, Phenomenex, 19x10 mm guard column, not temperature jacketed</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile HPLC</td>
			<td>MachereyNagel</td>
			<td>C2502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filtre seringue Filtropur S 0,45 ul sans prefiltre sterile</td>
			<td>Sarstedt AG</td>
			<td>83.1826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectrophotometer semi-micro cuvette</td>
			<td style="width:193px;">Reactolab S.A.</td>
			<td>2534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superloop, 1/16&#34; fittings (&#196;KTAdesign), 50 ml</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>18111382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>302031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GREINER Tubes fo FPLC 16 x 100 mm, cap. 12.0 ml</td>
			<td style="width:193px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>7.160 102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;100 kD Microcon&#160; fast flow filters</td>
			<td style="width:193px;">Merck Millipore Corporation</td>
			<td>MRCF0R100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vibra-cell VCX130 ultrasonic liquid processor</td>
			<td>Sonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#196;kta 900 equipped with a fraction collector&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Jasco J-815 Circular Dichroism</td>
			<td>Jasco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters UPLC system&#160;</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>C8 BEH acquity 2.1x100 mm 1.7 micron column&#160; , preheated column (40 &#176;C), flow rate of 0.6 mL/min, injection volume of 4 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">waters HPLC system</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>2489 UV detector and 2535 quaternary gradient module, 20 mL loop in a FlexInject housing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ESI-MS: Finnigan LTQ</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">lyophylizer instrument</td>
			<td>FreeZone 2.5 Plus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tecnai Spirit BioTWIN&#160;</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td>electron microscope equipped with a LaB6 gun and a 4K x 4K FEI Eagle CCD camera (FEI) and operated at 80 kV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C shaking&#160; incubator</td>
			<td>Infors HT multitron Standard</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biophotometer plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of native, untagged huntingtin exon1 monomer and fibrils using a sumo fusion strategy

Huntingtons sjukdom (HD) är en ärftlig dödlig neurodegenerativ sjukdom orsakas av en CAG expansion (≥36) i den första exon av HS-genen, vilket resulterar i uttrycket av Huntingtin proteinet (Htt) eller N-terminala fragment därav med en utökad polyglutamine ( polyQ) stretch.
Exon1 av proteinet Huntingtin (Httex1) är den minsta Htt fragment som recapitulates många av funktionerna i HD i mobilnät och djur modeller och är en av de mest studerade fragment av Htt. Den lilla storleken på Httex1 gör det experimentellt mer mottagliga för biofysiska karakterisering med hjälp av standard- och högupplösta tekniker jämfört med längre fragment eller fullängds Htt. Dock har hög aggregering benägenhet mutant Httex1 (mHttex1) med ökad polyQ innehåll (≥42) gjort det svårt att utveckla effektiva uttryck och reningssystem att producera dessa proteiner i tillräckliga mängder och göra dem tillgängliga för forskare från olika discipliner utan användning av fusionsproteinerna eller andra strategier som förändrar den infödda sekvensen av protein. Vi presenterar här en robust och optimerad metod för produktion av milligram mängder native, tagg-fri Httex1 baserat på övergående fusion av små ubiquitin relaterade modifierare (SUMO). Enkelheten och effektiviteten av strategin kommer att eliminera behovet av att använda icke-infödda sekvenser av Httex1, vilket gör detta protein mer tillgängliga för forskare och förbättra reproducerbarheten av experiment över olika laboratorier. Vi anser att dessa framsteg kommer också att underlätta framtida studier syftar till att belysa relationen struktur och funktion av Htt samt utveckla nya diagnostiska verktyg och terapier för att behandla eller bromsa utvecklingen av HD.

Httex1 uttrycks i E. coli med en N-terminal hans6-SUMO tagg. De representativa resultat av uttryck och rening av proteinet fusion sammanfattas i figur 1. Sekvensen av Httex1 består av rester 2-90 Htt och börjar med Ala2, eftersom Met1 är fullt klyvs i vivo42. Numreringen av de amino syrorna hänvisar till den 23Q varianten, komplett sekvensen av proteinet uttrycks fusion visas i figur 1A. Plasmidsna kommer att deponeras på Addgene inom en snar framtid ska delas med gemenskapen. En schematisk bild av Plasmiden och proteinet uttrycks fusion visas i figur 1B. His6-SUMO Httex1 uttrycker på en medelhög nivå (figur 1C) och de flesta av fusionsprotein förekommer i lösliga fraktionen efter Lys, både för 23Q och den 43Q varianten. Fusionsprotein migrerar högre än väntat, baserat på molekylvikten. Detta är delvis på grund av det starka vecket av SUMO men främst på grund av ovanliga sekvens sammansättningen av Httex1, som huvudsakligen innehåller glutamin och prolin. Både vildtyp (23Q) och mutant (43Q) fusionsprotein kan berikas till ~ 80% renhet av IMAC (figur 1D) förekomsten av samtidig rening värddator protein kan förklaras av den jämförelsevis låga uttryck Httex1 och det stora provet volym tillämpas på kolumnen.
Klyvning av hans6-SUMO tagg och rening av Httex1 visas i figur 2A. UPLC är ett effektivt verktyg för att övervaka klyvning av hans6-SUMO tag (figur 2B). Den ursprungliga toppen av fusionsprotein förbrukas och två nya och väl separerade topparna motsvarande hans6-SUMO tagg och Httex1 visas. Klyvning reaktionen är klar i 10-20 min. Western Blot (WB) är för långsamt för att övervaka klyvning reaktionen effektivt, men det har inkluderats i figuren för referens och demonstrera fullständighet SUMO klyvning. Både Httex1 23Q och 43Q kan separeras väl från hans6-SUMO tagga genom RP-HPLC (figur 2C) och erhölls i hög renhet som framgår av UPLC, MS och SDS-PAGE analys (figur 2D).
För att illustrera att de Httex1 proteiner som utarbetats av denna metod behålla beräknade aggregering egenskaperna för Httex1, vi bedömde fibrillization kinetik av muterade Httex1 vid 37 ° C med en sedimentering assay, övervakas förändringarna i sekundärt strukturera av CD spektroskopi, och kännetecknas av aggregaten av TEM morfologi. En representativ uppsättning data av aggregation kineticsen av mHttex1 fibrill formation som bestäms av en sedimentering analysen visas ifigur 3A. Förlusten av lösliga Httex1 43Q över tid, på grund av fibrillcellulosa bildandet kvantifierades genom UPLC. Vi observerar en komplett uttömning av lösligt protein efter 48 timmars inkubation. Dessutom kan utifrån vi det sekundära strukturerar av proteinet CD spektroskopi (figur 3B). Httex1 43Q skiftar från ostrukturerade (λmin 205 nm) till huvudsakligen β-arks rika konformation (λmin 215 nm) efter 48 timmars inkubation. Denna strukturella förändring åtföljs av bildandet av långa fibrillar aggregat som observerbara av TEM på 48 timmar (figur 3C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig1.jpg"> Figur 1 . Uttryck och rening av hans6-SUMO Httex1 fusionsprotein.  (A) den amino syra ordnar av hans6-SUMO-Httex1-QN fusion konstruktioner (hans6-SUMO i grönt och Httex1-QN i orange); (B) Schematisk översikt över uttryck och rening av proteinet fusion; (C) SDS-PAGE analys av uttrycket och lösligheten av proteinet fusion efter Lys; (D) kromatogrammet för IMAC rening av proteinet fusion och analys av fraktionerna av SDS-PAGE (röd stapel: obundna fraktionen, blue bar: tvätta bråkdel, svart bar: fraktioner som innehåller eluering peak); <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig2.jpg"> Figur 2 . Klyvning av hans6 SUMO tagg och rening av tagg-fri Httex1-QN proteiner. (A) Schematisk översikt; (B) analys av klyvning av taggen SUMO med ULP1 av UPLC (blå: före tillsats av ULP1; svart: 20 min (23Q), respektive 10 min (43Q) efter tillsats av ULP1) och WB (MAB5492 1: 2000, sekundära get anti mus-antikropp 1: 5000); (C) kromatogrammet för preparativ RP-HPLC rening av Httex1; D: analys av den renade Httex1 av UPLC, SDS-PAGE och ESI-MS; den beräknade molekylvikten är 9943 Da (23Q) respektive 12506 Da (43Q). <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig3.jpg"> Figur 3 . Aggregering av Httex1-43Q: (A) sedimentering analys utifrån UPLC. (B) CD spektra av det sekundära strukturerar vid 0 h och 48 h. (C) TEM micrographs av aggregaten på 48 h (skala barer är 200 nm). <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy at JoVE.com

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

Här presenterar vi ett robust och optimerade protokoll för produktion av milligram mängder infödda, tagg-fria monomerer och fibriller av den exon1 av proteinet Huntingtin (Httex1) baserat på övergående fusion av små ubiquitin relaterade modifierare (SUMO).

Generation av infödda, otaggade Huntingtin Exon1 Monomer och fibriller med en SUMO Fusion strategi

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identifiering av liten molekyl-bindande proteiner i en Native Cellular miljö med Live-cell fotoaffinitetsmärkning

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Lösa affinitetsrenat proteinkomplex av Blue Native PAGE och protein Korrelation profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Analysera superkomplex av den mitokondriella elektrontransportkedjan med naturliga elektrofores, in-gel-analyser och elektrolys

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Fraktionering för upplösning av lösliga och olösliga Huntingtin arter

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Fånga och identifiering av RNA-bindande proteiner med hjälp av klick kemi-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) strategi

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Användning av rekombinanta fusionsproteinerna i en fluorescerande proteas Assay plattform och deras i-gel utvinningsarbete

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Hybrid Clear/blå Native Electrophoresis för separation och analys av mitokondriella respiratoriska kedjan Superkomplex

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

En strategi för att identifiera substanser som påverkar cell tillväxt och överlevnad i odlade däggdjursceller vid låg till måttlig genomströmning

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Lokalisering av SUMO-modifierade proteiner med fluorescerande Sumo-fångst proteiner

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interaktioner med och membran permeabilisering av hjärnans Mitokona av amyloid fibriller

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...