Name: generation of native, untagged huntingtin exon1 monomer and fibrils using a sumo fusion strategy
Uploaded: 2018-06-27T13:30:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy at JoVE.com

Bu eser öncelikle hibe CHDI Vakfı ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından finanse edildi. Biz Dr Sophie Vieweg yararlı tartışmalar için bu yeni ifade sisteminin geliştirilmesi ve Lashuel grubunun diğer üyeleriyle sırasında bu ifade sistemi ile deneyimlerini paylaşmak ve giriş ve değerli geribildirim için teşekkür ederiz. Biz de Prof. Oliver Hantschel ULP1 plazmid verdiğiniz için teşekkür ederiz. Yazarlar Dr John B. Warner ve Dr Senthil K. Thangaraj el yazması kritik İnceleme için teşekkür ederiz

Yazarlar bu makalenin içeriği ile hiçbir çıkar çatışması var bildirin.

Alma miligram miktarda yerli, etiketlenmemiş için Httex1 bu protokol için biz verimli bir yordam belirttiğimiz 23 ya da 43 glutamin kalıntılar içeren. Bu bir onun bir C-terminal fusion olarak Httex1 ifade ederek başarıldı6-IMAC tarafından lysate hücreden füzyon proteini izole etmek için kullanılır ve Httex1 HPLC arıtma önce i ciddi SUMO etiketi. SUMO strateji birkaç diğer proteinler üretiminde kullanılan iken, bizim Yöntem SUMO özünde oluşturmak için de kullanılabilir benzersiz özellikleri, toplama eğilimli, daha önce olduğu kanıtlanmıştır amyloidogenic protein düzensiz olduğunu gösterir 43,44üretmek ve işlemek son derece zor. Biz bir "su kuyusu-davranmak" protein üretimi için basit, kullanımı kolay ve bir iletişim kuralına benzer bir iletişim kuralı mevcut. SUMO fusion solubilizes ve Httex1 ifade ve IMAC arıtma adım sırasında stabilize. İntein strateji10 ve toplama ile gözlemlediği gibi etiketin erken bölünme olduğunu artık bir sorun.
Özünde düzensiz protein yıkımı için özellikle güvenlik açığından etkilenir. N-terminal bozulması N17 bölgesinde bu iletişim kuralını kullanan bir mesele değil, truncations Httex1 PRD içinde gelişebilir. Kesilmiş proteinler hydrophobicity, ücret ve boyut olarak Httex1 için çok benzer gibidir, kromatografik yöntemle çıkardıktan meydan okuyor, böylece ilk etapta onların oluşumunu önlemek en iyisidir. Yakından protokole yapışma, her zaman buz üzerinde çalışma ve proteaz inhibitörü yeterli miktarda kullanarak gözlenen kesme düzeyi çok düşük tutmak yardımcı olacaktır. Kesilmiş protein benzeşme etiketi de kaybetmek gibi bir füzyon etiketi C-terminus Httex1 in itibariyle uygulamak truncations PRD kolayca kaldırabilirsiniz. Ancak, yerli dizi prolin ve bizim bilgimize Httex1 sona ererken bu seçeneği uygulanamaz muhafaza edilmesi gerekiyorsa traceless ve verimli bölünme prolin sonra ikna etmek için bilinen hiçbir C-terminal füzyon Etiketler vardır.
En önemli protokol SUMO etiketi bölünme sonra ULP1 tarafından kurtarılmış Httex1 işlenmesi parçasıdır. Protein hemen RP-HPLC tarafından saf. Neyse ki, bu genellikle 10-20 dk 4 ° C'de tamamlanır bir verimli ve hızlı tepki Buna ek olarak, intein strateji birkaç saat böylece verimi en üst düzeye çıkarmak için eksik bölünme ve başlangıç toplama arasında bir denge gerektiren intein, tam bölünme için gerekli. O-ecek başlamak gibi hızlı bir iş Httex1, mutant için gereklidir 23Q değişken daha uzun süre stabil ise nispeten yüksek konsantrasyon bölünme reaksiyon mevcut toplanacak. RP-HPLC arıtma sırasında SUMO bir diğer avantajı ortaya çıkıyor: Ssp DnaB intein hidrofobik ve sopalarla güçlü sütuna iken, SUMO daha Hidrofilik ve tamamen C4 ters faz sütundan elutes. Ticari ULP1 oldukça pahalıya mal olsa da, protein yüksek verim daha önce yayımlanmış protokolleri29takip kolayca üretilmektedir.
Httex1 kullanmadan önce yükünün iletişim kuralı uygulayarak kritik öneme sahip olamaz yeterli vurguladı. PolyQ liyofilize proteinler Httex1 gibi stabildir ve saklı uzun süre olabilir ama su ve arabellekleri tamamen çözünür değildir. Varlığı ön şekillendirilmesi reaksiyonlar ya liflerinde toplama kinetik ve protein45biyofiziksel özellikleri üzerinde önemli bir etkisi olabilir. Burada açıklanan yükünün iletişim kuralı yükünün protein, ön şekillendirilmesi toplamları kaldırılması ve lyophilized bir örnek üzerinden monomeric Httex1 lik üretimi sağlar. SUMO ve intein strateji ile elde Httex1 için benzer toplama kinetik ve fibril görünümdeki görülmektedir.
Httex1 üretimi için önceki yöntemleri ile karşılaştırıldığında, burada açıklanan SUMO strateji birçok avantaj sunar ve yapısı araştırmak için olası çalışmalar aralığını ve sağlık ve hastalık bu proteinin fonksiyonel özellikleri genişletir. SUMO-Httex1 füzyon proteini kolay, bu donmuş ve depolanan veya ücretsiz mHttex1 hızlı bir şekilde toplamak çözüm için 24 saat içinde ortam sıcaklığında tuttum. İstikrar ve SUMO-Httex1 füzyon proteinlerin yüksek çözünürlük protein işlemek ve/veya aksi takdirde sonra bölünme mümkün olmazdı mHttex1 içine enzimatik ve kimyasal değişiklikler tanıtmak için büyük esneklik sağlar. Bu giriş içerir translasyonel modifikasyonlar, fluorophores, spin etiketleri, biotin Etiketler, vb burada sunulan gelişmeler 1 olmalıdır) Httex1; ilişkilerin yapı-fonksiyon aydınlatmak için gelecekteki çalışmaları kolaylaştırmak 2) Htt toplama ve patoloji yayılan araştırmak için yeni araçlar oluşturur; 3) mutant Httex1 stabilize etmek ve onun toplama önlemek moleküller tanımlamak için yeni deneyleri geliştirme sağlamak; ve 4) bilim adamları diğer alanlardan bu protein üzerinde çalışmak ve Huntington hastalığı için tedaviler bulmak için bizim macera katılmak getirmek için teşvik ediyoruz.

HTT 348 kDa protein ve birçok fizyolojik fonksiyonları1' karıştığı olmuştur. HTT fazla 36 kalıntılarında onun N-terminus bir genişletilmiş polyQ bölgesini içerdiğinde, HD2,3neden olur. HD patoloji striatum ve nöronal ölüm ve atrofi etkilenen doku4,5yol açar korteks hücresel kapanımlar karakterizedir. PolyQ tekrar yolu içeren birkaç N-terminal Htt parçaları otopsi beyin HD hastalardan tespit ve huntingtin protein6proteolitik işlem tarafından oluşturulacak sanıyordum. Son yıllarda yapılan çalışmalarda Httex1 de anormal mRNA'ın porno versiyonunu nedeniyle bir araya ki öneririz. Httex1 patolojik polyQ mutasyon içerir ve onun overexpression hayvanlarda HD7böylece olası bir rol HD patoloji ve hastalık ilerleme '6Bu parçası vurgulayarak, anahtar özellikleri birçok özetlemek, 8,9.
Yüksek toplama eğilimi mutant Httex1 nedeniyle (mHttex1) genişletilmiş polyQ yolu ile Httex1 geçici füzyon proteinler için varolan ifade sistemleri çoğunluğu dayanmaktadır (glutatyon-S-transferaz (GST), thioredoxin (TRX) gibi veya maltoz bağlayıcı protein (MBP) ve/veya onun ifade, istikrar, arıtma ve/veya çözünürlük10,11,12,13,14 differentially artıran peptidler (poli-histidin) ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. Füzyon ortak Httex1 için kısa bir sıra tripsin gibi proteaz için bir bölünme site içeren ile bağlantılı, tütün etch virüs (TEV) proteaz veya bölünme ve Httex1 sürümünden önce toplama başlatılması için izin vermek için PreScission veya Arıtma. Bu yöntemlerin eksikliklerini traceless bölünme nedeniyle ek artıkları ve miscleavage heterojenlik nedeniyle eksik bölünme () yanı sıra Httex1, dizisi içinde nedeniyle kesilmiş parçaları oluşturulması bırakma olasılığını içerir Vieweg ve ark. avantajları ve sınırlamalar bu yaklaşımın daha kapsamlı açıklama için bakınız)10. Biz bu sınırlamaları gidermek için son zamanlarda Synechocystis sp. geçici bir N-terminal füzyonu kullanarak etiket içermeyen yerli Httex1 üretimi ilk kez etkinleştirme bir ifade stratejisi geliştirdi (Ssp) DnaB intein Httex110. İntein göğüs arası traceless ve belirli ve mg protein miktarı verir iken, hala verimi azaltabilir iki dezavantajı uğrar: Ifade ve üzerinde bir bölünme oluşur aslında gerçekleşebileceğini intein Yani, erken bölünme birkaç saat, toplama, genişletilmiş polyQ tekrarlar ile Httex1 için özellikle nedeniyle protein kaybına neden olabilir.
Bu sınırlamaları gidermek ve yerli üretim için bizim strateji geliştirmek için etiket içermeyen Httex1, SUMO, daha tam olarak Maya homolog Smt3 Httex1 için geçici füzyon dayalı yeni bir ifade sistemi geliştirdik. SUMO sistemi rekombinant proteinlerin üretimi için ilk nerede bir artış oranı ifade ve çözünürlük SUMO füzyon protein gösterilmiştir 200429, yayınlandı. SUMO etiketi Ubikuitin protein özgü proteaz 1 (ULP1), hangi does değil istemek bir tanıma site ama SUMO Tersiyer yapısını tanır ve pratik miscleavage30olasılığını ortadan kaldırır gibi i ciddi. Ayrıca, ULP1-aracılı bölünme hızlı ve traceless ve ek artıkları bırakmaz. Füzyon etiketi, erken bölünme ile otokatalitik intein10, gözlemlediği gibi tamamen dış bir proteaz gereksinimi tarafından önlenmiş olur. SUMO strateji Rekombinant protein üretim31,32,33için günümüzde yaygın olarak kullanılırken, biz özünde düzensiz bir nesil için özellikle yararlı olur bu yazıda göstermek, toplama eğilimli, amyloidogenic protein Httex1 gibi. Biz sadelik, verimlilik ve sağlamlığı bizim SUMO-fusion tabanlı yöntemi yerli, etiket içermeyen Httex1 farklı disiplinlerden araştırmacılar için daha erişilebilir kılan ve Httex1 vitro non-yerli dizileri kullanma gereksinimini ortadan kaldırmak inanıyoruz . Httex1 yapı-fonksiyon ilişkinin aydınlatmak için gelecekteki çalışmaları kolaylaştıracak önemli bir ilerleme bu.
Protokol Httex1 bakteri kültürü 12 l arıtma açıklar, ancak protokol kolayca daha küçük veya daha büyük ölçekli üretimler için adapte. Bir polyQ tekrar uzunluğu (23Q) aşağıda ve mutant Httex1 ile üretim vahşi türü Httex1 (wtHttex1) protokolünü açıklar (mHttex1) bir polyQ ile patojenik eşik (36Q) uzunluğu (43Q) yukarıda tekrarlayın.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1585px;" width="1585">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:443px;">Uranyl formate (UO2(CHO2)2)</td>
			<td style="width:193px;">EMS</td>
			<td style="width:124px;">22450</td>
			<td style="width:825px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formvar/carbon 200 mesh, Cu 50 grids</td>
			<td>EMS</td>
			<td>FCF200-Cu-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Precision Cell made of Quartz SUPRASIL 1 mm light path from Hellma Analytics</td>
			<td>HellmaAnalytics</td>
			<td>110-1-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buffer Substance Dulbecco&#39;s (PBS w/o Ca and Mg) ancinne ref 47302 (RT) SERVA</td>
			<td>Witech</td>
			<td>SVA4730203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicillin</td>
			<td>AxonLab</td>
			<td>A0839.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luria Broth (Miller&#39;s LB Broth)</td>
			<td>&#160;Chemie Brunschwig</td>
			<td>1551.05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>AxonLab</td>
			<td>A1008.0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E. coli B ER2566</td>
			<td>NEB</td>
			<td>NEB# E4130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imidazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56750-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cOmplete&#160;Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693116001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Huntingtin Antibody, a.a. 1-82</td>
			<td>Merck Millipore Corporation</td>
			<td>MAB5492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H + L)</td>
			<td>Licor</td>
			<td>925-68070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PMSF</td>
			<td>AxonLab</td>
			<td>A0999.0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HisPrep 16/10 column&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28936551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">C4 HPLC column</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>00G-4168.P0</td>
			<td>&#160;&#160;&#160; 10 &#181;m C4 300 &#197;, LC Column 250 x 21.2 mm, Phenomenex, 19x10 mm guard column, not temperature jacketed</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile HPLC</td>
			<td>MachereyNagel</td>
			<td>C2502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Filtre seringue Filtropur S 0,45 ul sans prefiltre sterile</td>
			<td>Sarstedt AG</td>
			<td>83.1826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectrophotometer semi-micro cuvette</td>
			<td style="width:193px;">Reactolab S.A.</td>
			<td>2534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Superloop, 1/16&#34; fittings (&#196;KTAdesign), 50 ml</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>18111382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>302031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GREINER Tubes fo FPLC 16 x 100 mm, cap. 12.0 ml</td>
			<td style="width:193px;">Greiner Bio-One</td>
			<td>7.160 102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#160;100 kD Microcon&#160; fast flow filters</td>
			<td style="width:193px;">Merck Millipore Corporation</td>
			<td>MRCF0R100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vibra-cell VCX130 ultrasonic liquid processor</td>
			<td>Sonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#196;kta 900 equipped with a fraction collector&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Jasco J-815 Circular Dichroism</td>
			<td>Jasco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Waters UPLC system&#160;</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>C8 BEH acquity 2.1x100 mm 1.7 micron column&#160; , preheated column (40 &#176;C), flow rate of 0.6 mL/min, injection volume of 4 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">waters HPLC system</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td>2489 UV detector and 2535 quaternary gradient module, 20 mL loop in a FlexInject housing</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ESI-MS: Finnigan LTQ</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">lyophylizer instrument</td>
			<td>FreeZone 2.5 Plus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tecnai Spirit BioTWIN&#160;</td>
			<td>FEI</td>
			<td></td>
			<td>electron microscope equipped with a LaB6 gun and a 4K x 4K FEI Eagle CCD camera (FEI) and operated at 80 kV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37 &#176;C shaking&#160; incubator</td>
			<td>Infors HT multitron Standard</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Biophotometer plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of native, untagged huntingtin exon1 monomer and fibrils using a sumo fusion strategy

Huntington hastalığı (HD) bir devralınan ölümcül nörodejeneratif hastalık bir CAG genişletme (≥36) tarafından neden içinde HD gen exon ilk Huntingtin protein (Htt) ifadesinde kaynaklanan ya da N-terminal bunların parçaları bir genişletilmiş polyglutamine () ile polyQ) streç.
Huntingtin protein (Httex1) exon1 HD özellikleri cep içinde birçok beyannamedir en küçük Htt parçası ve hayvan modelleri ve Htt en çok çalışılmış parçaları biridir. Httex1 küçük boyutu deneysel olarak daha mükellef ile karşılaştırıldığında daha uzun parçaları veya tam uzunlukta Htt standart ve yüksek çözünürlüklü teknikleri kullanarak biyofiziksel karakterizasyonu için yapar. Ancak, yüksek toplama eğilimi mutant Httex1 (mHttex1) artan polyQ içeriği (≥42) ile verimli ifade ve bu proteinler yeterli miktarlarda üretmek ve onları erişilebilir yapmak için arıtma sistemleri geliştirmek zor yaptı Füzyon protein veya protein yerli dizi alter diğer stratejileri kullanmanıza gerek kalmadan farklı disiplinlerden bilim adamları. Burada sağlam ve en iyi duruma getirilmiş bir yöntem mevcut miligram miktarda yerli üretimi için etiket ücretsiz-küçük Ubikuitin ilgili değiştirici (SUMO) geçici fusion tabanlı Httex1. Sadelik ve verimliliği strateji Httex1, böylece bu proteinin araştırmacılar için daha erişilebilir hale getirmek ve deneyler tekrarlanabilirlik farklı laboratuvarlar arasında artırma non-yerli dizileri kullanma gereksinimini ortadan kaldırır. Bizce bu gelişmeler de Htt yanı sıra gelişmekte olan yeni tanı araçları ve tedaviler tedavi etmek ya da HD ilerlemesini yavaşlatmak yapı-fonksiyon ilişkisi elucidating yönelik gelecekteki çalışmaları kolaylaştıracaktır.

Httex1 E. coli bir N-terminal ile ifade onun6-SUMO etiket. İfade ve arıtma füzyon proteinin temsilcisi sonuçları Şekil 1' de özetlenmiştir. Çünkü Met1 tam i ciddi vivo içinde42Htt ve Ala2 ile başlar 2-90 kalıntılarının Httex1 dizisi oluşur. Tam sırası ifade füzyon proteinin Şekil 1içindeAgösterilir, amino asitler numaralandırma 23Q değişkenine anlamına gelir. Plazmid, yakın bir gelecekte toplumla paylaşılması gereken Addgene yatırılacaktır. Plazmid ve ifade füzyon protein bir şematik resim 1'Bgösterilir. His6-SUMO Httex1 bir orta seviye (Şekil 1C) ifade eder ve en füzyon proteinin çözünür kesir mevcut lizis, 23Q ve 43Q değişken için hem de sonra. Füzyon proteini beklenen, daha yüksek molekül ağırlıklı dayalı geçirir. Bu kısmen nedeniyle SUMO güçlü kat ama çoğunlukla Httex1, esas olarak glutamin ve prolin kalıntılar içeren alışılmadık sıra bileşimi nedeniyle değildir. Wildtype (23Q) ve (43Q) mutant füzyon protein zenginleştirilmiş ~ %80 saflık için ana protein Co arındırıcı varlığını Httex1 ve büyük örnek nispeten düşük ifade düzeyi tarafından açıkladı IMAC (Şekil 1D) tarafından sütuna uygulanan birim.
Onun göğüs arası6-SUMO etiket ve Httex1 arınma Şekil 2içindeAgösterilir. UPLC bölünme onun izlemek için verimli bir araçtır6-SUMO etiket (Şekil 2B). Füzyon proteini özgün zirvesine tüketilen ve onun karşılık gelen iki yeni ve iyi ayrı doruklarına6-SUMO etiket ve Httex1 görünür. Bölünme reaksiyon 10-20 dk içinde sona erdi. Western Blot (WB) bölünme tepki verimli bir şekilde izlemesini çok yavaştır, ancak başvuru ve SUMO bölünme completeness göstermek için şekilde dahil. Her iki Httex1 23Q ve 43Q de onun ayrılabilir6-SUMO tag RP-HPLC (Şekil 2C) ve yüksek saflık UPLC, MS ve SDS-sayfa Analizi (Şekil 2D) tarafından gösterildiği gibi elde edilmiştir.
Bu yöntem tarafından hazırlanan Httex1 protein Httex1 beklenen toplama özelliklerini korumak, mutant Httex1 37 ° C'de fibrillization kinetik sedimantasyon tahlil tarafından değerlendirildi göstermek için CD tarafından ikincil yapı değişiklikleri izlenen Spektroskopi ve TEM göre toplamları morfolojisi ile karakterizedir. Şekil 3' teAtoplama kinetik sedimantasyon tahlil tarafından belirlenen mHttex1 fibril oluşumu temsil eden veri kümesi gösterilir. Fibril oluşumu nedeniyle zamanla 43Q UPLC tarafından sayısal çözünür Httex1 kaybı. Biz tam bir çözünür protein tükenmesi, kuluçka 48 saat sonra görmekteyiz. Ayrıca, ikincil yapı protein CD spektroskopisi (Şekil 3B) tarafından belirlenir. Httex1 43Q vardiya üzerinden yapılandırılmamış (λmin 205 nm) esas olarak β-yapraklık zengin uyum (λmin 215 nm), kuluçka 48 saat sonra için. Bu yapısal değişim TEM göre olarak gözlemlenebilir uzun fibriler toplamları oluşumu, 48 saat (Şekil 3C) eşlik ediyor.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig1.jpg"> Resim 1 . İfade ve arıtma onun6-SUMO Httex1 füzyon proteini.  (A) onun amino asit dizisi6-SUMO-Httex1-QN füzyon yapıları (onun6-SUMO yeşil ve turuncu Httex1-QN ); (B) şematik genel ifade ve arıtma füzyon proteinin; (C) ifade ve çözünürlük lizis sonra; füzyon proteinin SDS-sayfa Analizi (D) kromatografik füzyon proteinin IMAC arıtma ve kesirler SDS-sayfa tarafından analiz (kırmızı çubuk: ilişkisiz kesir, mavi bar: yıkama kesir, siyah bar: elüsyon tepe içeren kesirler); <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig2.jpg"> Resim 2 . Bölünme onun6 SUMO etiket ve etiket içermeyen Httex1-QN proteinlerin saflaştırılması. (A)şematik genel bakış; (B) analizi ULP1 UPLC tarafından SUMO etiketiyle dekolte (mavi: ULP1; toplamadan önce siyah: 20 min (23Q), sırasıyla 10 min (43Q) ULP1 yanı sıra sonra) ve WB (MAB5492 1:2000, ikincil keçi anti fare antikor 1: 5000); (C) kromatografik Httex1 partiye hazırlık RP-HPLC arınma; D: UPLC tarafından arıtılmış Httex1 Analizi SDS-sayfa ve ESI-MS; beklenen molekül ağırlığı 9943 Da (23Q) ve 12506 Da (43Q) sırasıyla var. <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig3.jpg"> Şekil 3 . Toplama Httex1-43Q: (a)sedimantasyon tahlil UPLC üzerinde dayalı. (B) 0 h ve 48 h. (C) TEM Filmler, 48 h toplamları ikincil yapılara sahip CD spectra (ölçek çubukları çoğu 200 nm). <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy at JoVE.com

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

Burada, yerli, etiket içermeyen monomerleri miktarlarda miligram ve liflerinde küçük Ubikuitin ilgili değiştirici (SUMO) geçici fusion tabanlı exon1 Huntingtin protein (Httex1) üretimi için sağlam ve en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralı mevcut.

Yerli, etiketsiz Huntingtin Exon1 Monomer ve SUMO Fusion strateji kullanarak liflerinde nesil

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Canlı hücre fotoafinite Etiketleme tarafından Yerli Hücresel Ortamında Küçük Molekül bağlayıcı proteinlerin belirlenmesi

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Mitokondriyal Elektron Nakil Zincirinin Süper Komplekslerinin Yerli Elektroforez, In-Jel Testleri ve Elektroelüsyon ile İncelenmesi

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Çözünür ve çözünmez Huntingtin türler çözümlenmesi için ayırma

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Yakalama ve tıklama Kimya destekli RNA-interactome kullanarak RNA bağlanıcı proteinler tanımlaması (CARIC) strateji yakalama

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Rekombinant füzyon protein flüoresan proteaz tahlil Platform ve onların jel Renaturation kullanımı

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Mitokondriyal solunum zinciri Süperkompleksleri ayrımı ve analizi için hibrid Clear/mavi yerli Elektroforez

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...

A Strategy to Identify Compounds that Affect Cell Growth and Survival in Cultured Mammalian Cells at Low-to-Moderate Throughput

Düşük-Orta Throughput'ta Kültürlü Memeli Hücrelerinde Hücre Büyümesini ve SağkalımLarını Etkileyen Bileşikleri Belirleme Stratejisi

Cytotoxicity is a critical parameter that needs to be quantified when studying drugs that may have therapeutic benefits. Because of this, many drug ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Floresan Sumo-bindirme proteinleri kullanarak SUMO-modifiye proteinlerin lokalizasyonu

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Amiloid Fibrils ile Beyin Mitokondrisi ile Etkileşimler ve Membran Permeabilizasyonu

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...