Name: isolation and characterization of extracellular vesicles from adult schistosoma japonicum
Uploaded: 2018-05-22T13:00:00
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Este estudio fue, en parte o en conjunto, apoyados por la Fundación de Ciencias naturales nacionales de China (31472187 y 31672550) y la ciencia agrícola y tecnología programa de innovación de la Academia China de ciencias agrícolas.

Todos los experimentos en animales fueron aprobados por el Comité de ética local de Shanghai Instituto de investigación veterinaria, Academia China de ciencias agrícolas (permiso número: SHVRIAU-14-0101).
1. in Vitro cultura de esquistosomas
Nota: Esquistosomas representan un riesgo biológico. Los trabajadores deben usar guantes de látex en todo momento cuando manejo de gusanos, schistosomal suspensiones u otras relac...

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	<li>Tetta, C., Ghigo, E., Silengo, L., Deregibus, M. C., Camussi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+an+emerging+mechanism+of+cell-to-cell+communication.">Extracellular vesicles as an emerging mechanism of cell-to-cell communication.</a> Endocrine. 44 (1), 11-19 (2013).</li><li>Abels, E. R., Breakefield, X. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+and+small+non-coding+RNA-enriched+extracellular+vesicles+are+released+by+the+pathogenic+blood+fluke+Schistosoma+mansoni.">Protein and small non-coding RNA-enriched extracellular vesicles are released by the pathogenic blood fluke Schistosoma mansoni.</a> J Extracell Vesicles. 4, 28665 (2015).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-like+vesicles+derived+by+Schistosoma+japonicum+adult+worms+mediates+M1+type+immune-+activity+of+macrophage.">Exosome-like vesicles derived by Schistosoma japonicum adult worms mediates M1 type immune- activity of macrophage.</a> Parasitol Res. 114 (5), 1865-1873 (2015).</li><li>Koh, Y. Q., Almughlliq, F. B., Vaswani, K., Peiris, H. N., Mitchell, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+enrichment+by+ultracentrifugation+and+size+exclusion+chromatography.">Exosome enrichment by ultracentrifugation and size exclusion chromatography.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 23, 865-874 (2018).</li><li>Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+endurance+exercise-derived+exosomes+to+treat+metabolic+diseases.">The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases.</a> Nat Rev Endocrinol. 12 (9), 504-517 (2016).</li><li>Livshits, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+exosomes+by+differential+centrifugation:+Theoretical+analysis+of+a+commonly+used+protocol.">Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol.</a> Sci Rep. 5, 17319 (2015).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+extracellular+vesicles+containing+small+RNAs+from+the+eggs+of+Schistosoma+japonicum.">Release of extracellular vesicles containing small RNAs from the eggs of Schistosoma japonicum.</a> Parasit Vectors. 9 (1), 574 (2016).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+S.+japonicum+exosome-like+vesicles+reveals+their+regulatory+roles+in+parasite-host+interactions.">Molecular characterization of S. japonicum exosome-like vesicles reveals their regulatory roles in parasite-host interactions.</a> Sci Rep. 6, 25885 (2016).</li><li>Lewis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis.">Schistosomiasis.</a> Curr Protoc Immunol. , 11 (2001).</li><li>Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+miRNAs:+roles+in+cancer+diagnosis,+prognosis+and+therapy.">Circulating miRNAs: roles in cancer diagnosis, prognosis and therapy.</a> Adv Drug Deliv Rev. 81, 75-93 (2015).</li></ol>

Estudios recientes sobre EVs han demostrado eso schistosome que EVS juegan un papel importante en huésped-patógeno interacciones3,9,12,16. Atender más sus funciones reguladoras es esencial aislar EVs de esquistosomas. Aquí, describimos un método alternativo para el aislamiento de SjEV. Este método produce un tamaño de amplia gama de SjEVs, de 100 nm a 400 nm, en adultos S. japonicum<...

Las vesículas extracelulares (EVs) son una población de pequeñas vesículas de membrana-limita con varias proteínas, lípidos y ácidos nucleicos. Estudios recientes demostraron que EVs desempeñan un papel crucial en la comunicación de la célula y participan en la regulación de numerosos procesos fisiológicos, incluyendo el desarrollo de las células, regulación inmune, angiogénesis y migración de célula2, 3,4,5. La acumulación de pruebas indica que EVs, circulación de exosomas y su carga de miRNA representan potenciales biomarcadores de ciertas enfermedades6.
Varios protozoos como Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruziy Leishmania spp., han demostrado ser capaces de secretar EVs; helmintos, además se han encontrado secretar EVs en vida alberga7. EVs parasitarias han demostrado para estar implicado en el mantenimiento de la infección, patogenicidad8y9de la regulación inmune. Recientes estudios en esquistosomas ambos Schistosoma mansoni (S. mansoni) 10,11 y S. japonicum12 han indicado que los esquistosomas adultos secretan exosomas como vesículas que pueden ser involucrados en las normas funcionales de procesos biológicos específicos.
Hasta la fecha, se han utilizado varios métodos para aislar las vesículas extracelulares, como la ultracentrifugación, ultrafiltración13, el uso de reactivos basados en polímeros, cromatografía por exclusión de tamaño y aislamiento de inmunoafinidad. Estos métodos poseen sus propias ventajas y limitaciones de la14. Generalmente, la ultracentrifugación se considera el método estándar de oro para el aislamiento de la vesícula. Sin embargo, este método adolece de la limitación del potencial de agregación EV14.
De esquistosomas, han divulgado un par de métodos para el aislamiento de EV: Estos incluyen ultracentrifugación11,12,10 y el uso de comerciales EV aislamiento kit16 para varias etapas (huevos16, esquistosómula11, esquistosomas adultos10,12,17). Dado que microvesículas son de una amplia gama de tamaño de varios cientos nanómetros a mil nanómetros, desarrollamos un método alternativo que combina con el uso de la centrífuga de banco, ultrafiltración y un kit de aislamiento comercial de EV para aislar el servicio voluntario europeo de adultos Schistosoma japonicum. El servicio voluntario europeo aislado típicamente poseía un diámetro de 100-400 nm y con éxito fueron internalizado por las células del receptoras.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1161px;" width="1160">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:459px;">Material</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:188px;"></td>
			<td style="width:319px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:459px;">Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media)</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td style="width:188px;">4478359</td>
			<td style="width:319px;">For isolating S. japonicum extracellular vesicles</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:459px;">PKH67</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:188px;">MINI67</td>
			<td style="width:319px;">For labeling Evs</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">RPMI 1640 Medium</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>11875119</td>
			<td>For parasite culture</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:196px;">ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;">0.22&#956;m syringe filter</td>
			<td style="width:196px;">Merck</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;">SnakeSkin Dialysis Tubing</td>
			<td style="width:196px;">Thermo SCIENTIFIC</td>
			<td>68035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">PEG8000</td>
			<td style="width:196px;">Sangon Biotech</td>
			<td>A100159&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;">RIPA</td>
			<td style="width:196px;">Beyotime</td>
			<td>P0013B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">EMD Millipore&#8482; Immobilon&#8482; Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL)</td>
			<td style="width:196px;">Fisher scientific</td>
			<td>WBKLS0100&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;">DAPI</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;">BCA kit</td>
			<td style="width:196px;">Beyotime</td>
			<td>P0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">CD63 antibodies</td>
			<td style="width:196px;">Sangon Biotech</td>
			<td>D160973-0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;">PVDF</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Formvar/Carbon 400 mesh</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>01754-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Phosphotungstic Acid</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>19402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;">anti-mouse IgG-HRP</td>
			<td>CWBIO</td>
			<td>CW0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:459px;">NCTC clone 1469 cells</td>
			<td style="width:196px;">ATCC</td>
			<td style="width:188px;">ATCC&#174; CCL-9.1&#8482;</td>
			<td style="width:319px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:459px;">FBS</td>
			<td style="width:196px;">HyClone</td>
			<td style="width:188px;">SV30087.02</td>
			<td style="width:319px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:459px;">Equipments</td>
			<td style="width:196px;"></td>
			<td style="width:188px;"></td>
			<td style="width:319px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">GE chemoluminescance imaging system</td>
			<td>GE</td>
			<td>ImageQuant LAS4000mini</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;">Transmission electron microscopy</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>H-7600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;">Milli-Q water</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Milli-Q Elix</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;">Eppendor Centrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;">Zetasizer Nano</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Zetasizer Nano ZS&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:196px;">Beckman</td>
			<td colspan="2">Optima L-100 XP Ultracentrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Incubator</td>
			<td style="width:196px;">ESCO</td>
			<td>CCL-107B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Microscope</td>
			<td style="width:196px;">Zeiss</td>
			<td>Zeiss Axin Observer Z1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of extracellular vesicles from adult schistosoma japonicum

Las vesículas extracelulares (EVs) son vesículas membranosas por una variedad de células en el microambiente extracelular. EVs representan una población de vesículas heterogéneas, cuyo rango de tamaño entre 40 y 1.000 nm. Evidencia acumulada indica que EVs desempeñan importantes funciones reguladoras en las interacciones patógeno-host. Una profunda comprensión del schistosome EVs debe proporcionar penetraciones en los mecanismos subyacentes a las interacciones host esquistosoma, permitir el desarrollo de nuevas estrategias contra la esquistosomiasis. Aquí, nuestro objetivo es profundizar el estudio funciones de EVs en esquistosomas presentando un protocolo para el aislamiento y la caracterización de los vehículos eléctricos de adultos Schistosoma japonicum (S. japonicum). EVs se aislaron en vitro el medio de cultivo utilizando centrifugación combinada con un kit de aislamiento comercial exosomas. Los aislados de S. japonicum EVs (SjEVs) por lo general poseen un diámetro de 100-400 nm y se caracterizan por microscopía electrónica de transmisión y el borrar occidental. El uso de PKH67 SjEVs de marcado tinte ha demostrado que SjEVs es internalizados por las células del receptoras. En general, el protocolo proporciona un método alternativo para aislar EVs de esquistosomas adultos; el SjEVs aislado puede ser adecuado para el análisis funcional.

Para cuantificar el rendimiento de SjEVs aislados usando el protocolo descrito, se utilizan análisis de proteína BCA para acceder a la concentración de proteína de la SjEVs aislada de esquistosomas adultos de 28 días. Como se muestra en la tabla 1, la concentración de proteína de SjEV sido 208 μg 250 μg por 100 mL de medio (tabla 1). El tamaño de partícula, según lo determinado por análisis de nanopartículas de Malvern, indica que el aislado...

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Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Aislamiento y caracterización de las vesículas extracelulares de adultos Schistosoma japonicum

Aquí, presentamos un protocolo para describir el aislamiento de las vesículas extracelulares (EVs) en medio de cultivo en vitro de adultos Schistosoma japonicum.

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

Transformación y cercarias In vitro El cultivo de la Schistosoma mansoni Schistosomules

Schistosome parasites are the causative agents of schistosomiasis, a chronically debilitating disease that affects over 200 million people globally and ...

Investigación

Inmunología e Infección

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Con óvulos de<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Como un<em&gt; En vivo</em&gt; Modelo de la inflamación pulmonar inducida por helmintos

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe ...

Isolation and Characterization of Dendritic Cells and Macrophages from the Mouse Intestine

Aislamiento y caracterización de las células dendríticas y los macrófagos del intestino delgado de ratón

Within the intestine reside unique populations of innate and adaptive immune cells that are involved in promoting tolerance towards commensal flora and ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Simplificado Humanos neutrófilos extracelular Trampas (TNE) Aislamiento y manipulación

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Aislamiento y caracterización de los neutrófilos con propiedades antitumorales

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El aislamiento, caracterización y examen funcional de la red celular gingival Inmune

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Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes

El aislamiento y la citometría de flujo Caracterización de murino Small intestinal linfocitos

The intestines &#8212; which contain the largest number of immune cells of any organ in the body &#8212; are constantly exposed to foreign antigens, both ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Flujo Virometry para analizar antigénica Spectra de viriones y extracelular Vesículas

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Legionella pneumophila exterior vesículas de membrana: Aislamiento y análisis de su potencial pro-inflamatoria en los macrófagos

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Aislamiento, caracterización y purificación de los macrófagos de los tejidos afectados por la inflamación relacionados con la obesidad

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...