Name: desthiobiotin-streptavidin-affinity mediated purification of rna-interacting proteins in mesothelioma cells
Uploaded: 2018-04-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells at JoVE.com

Эта работа была поддержана Швейцарский Национальный фонд Синергия науки Грант CRSII3 147697, Stiftung für Krebsforschung изображения и Цюрих Krebsliga.

1. Подготовка цитозольной и ядерной белковые фракции
<ol><li>Пластина АКК-МЕЗО-4 4 x 106 клеток в колбе культуры клеток T150, выращенных в RPMI - 1640 среднего дополнена 10% FBS, 1 x пенициллина/стрептомицина (100 x) и 2 мм L-глютамин (200 мм). Когда клетки достигают слияния 80-90% (~5-5.5 x 106 клеток), продол?...

<ol>
	<li>Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+and+post-transcriptional+gene+regulation.">RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation.</a> FEBS Letters. 582 (14), 1977-1986 (2008).</li><li>Mayr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+biological+roles+of+alternative+3'UTRs.">Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs.</a> Trends in Cell Biology. 26 (3), 227-237 (2016).</li><li>Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+3'+untranslated+region+in+post-transcriptional+regulation+of+protein+expression+in+mammalian+cells.">The role of the 3' untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells.</a> RNA Biology. 9 (5), 563-576 (2012).</li><li>von Roretz, C., Di Marco, S., Mazroui, R., Gallouzi, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnover+of+AU-rich-containing+mRNAs+during+stress:+a+matter+of+survival.">Turnover of AU-rich-containing mRNAs during stress: a matter of survival.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 2 (3), 336-347 (2011).</li><li>Fallmann, J., Sedlyarov, V., Tanzer, A., Kovarik, P., Hofacker, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AREsite2:+An+enhanced+database+for+the+comprehensive+investigation+of+AU/GU/U-rich+elements.">AREsite2: An enhanced database for the comprehensive investigation of AU/GU/U-rich elements.</a> Nucleic Acids Research. 44, D90-D95 (2016).</li><li>Kresoja-Rakic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranscriptional+regulation+controls+calretinin+expression+in+malignant+pleural+mesothelioma.">Posttranscriptional regulation controls calretinin expression in malignant pleural mesothelioma.</a> Frontiers in Genetics. 8 (70), (2017).</li><li>Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+to+probe+functions+and+mechanisms+of+long+noncoding+RNAs.">Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 22 (1), 29-35 (2015).</li><li>Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biotin-(strept)avidin+system:+principles+and+applications+in+biotechnology.">The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology.</a> Clinical Chemistry. 37 (5), 625-636 (1991).</li><li>Hirsch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easily+reversible+desthiobiotin+binding+to+streptavidin,+avidin,+and+other+biotin-binding+proteins:+Uses+for+protein+labeling,+detection,+and+isolation.">Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: Uses for protein labeling, detection, and isolation.</a> Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).</li><li>. Magnetic bead technology for better assay development Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/1602577-Magnetic-Bead-Technology-Brochure.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/1602577-Magnetic-Bead-Technology-Brochure.pdf</a> (2013)</li><li>Usami, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+four+malignant+pleural+mesothelioma+cell+lines+from+Japanese+patients.">Establishment and characterization of four malignant pleural mesothelioma cell lines from Japanese patients.</a> Cancer Science. 97 (5), 387-394 (2006).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Coulson, R. M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferritin+synthesis+is+controlled+by+iron-dependent+translational+derepression+and+by+changes+in+synthesis/transport+of+nuclear+ferritin+RNAs.">Ferritin synthesis is controlled by iron-dependent translational derepression and by changes in synthesis/transport of nuclear ferritin RNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (16), 7613-7617 (1993).</li><li>Leibold, E. A., Munro, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+protein+binds+in+vitro+to+a+highly+conserved+sequence+in+the+5'+untranslated+region+of+ferritin+heavy-+and+light-subunit+mRNAs.">Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5' untranslated region of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (7), 2171-2175 (1988).</li><li>Srikantan, S., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HuR+function+in+disease.">HuR function in disease.</a> Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 17, 189-205 (2012).</li><li>Morris, K. V., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+of+regulatory+RNA.">The rise of regulatory RNA.</a> Nature Reviews: Genetics. 15 (6), 423-437 (2014).</li><li>Rinn, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+demarcation+of+active+and+silent+chromatin+domains+in+human+HOX+loci+by+noncoding+RNAs.">Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs.</a> Cell. 129 (7), 1311-1323 (2007).</li><li>Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+proteins+targeted+by+a+short+repeat+RNA+to+the+mouse+X+chromosome.">Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome.</a> Science. 322 (5902), 750-756 (2008).</li><li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3.">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li></ol>

3' необычных принадлежат некодирующих генома3, и все некодирующих РНК может взаимодействовать с белками для того чтобы приложить их функции7. Когда генома млекопитающих было установлено pervasively транскрипции и производится значительная часть длиной некодирующи...

Экспрессии генов и последний уровень продукта гена могут жестко регулируется, влияющие на стабильность мРНК и мРНК перевод курса1. Эти post-transcriptional механизмы регулирования оказывается через взаимодействие некодирующих РНК и/или RNA-связывая протеинов (ОДП) с Целевая мРНК. Обычно это 3' непереведенные регионе мРНК (3' УТР - принадлежащие некодирующих часть генома2), содержащий конкретные СНГ-регуляторных элементов (КРР), которые распознаются транс-действующих факторов, таких как Мирна или ОДП 3. наиболее изученных стран СНГ-элемент внутри 3' УТР, это аденин богатые элемент (являются) мотив, который распознается по конкретным AU-связывающих белков (AUBP) и, в свою очередь, индуцирует либо деградации мРНК/deadenylation (являются опосредованной распада) или мРНК стабилизации4.
Размер 3' УТР из calretinin мРНК (CALB2) является 573 bp длинные и содержит предполагаемый AUUUA пентамера, как предсказано, AREsite2, инструмент bioinformatic5. В соответствии с наличием разоблачало это мотив, pmirGLO вектор репортер пробирного продемонстрировал роль по стабилизации этого элемента в мРНК CALB26. Наконец, в пробирке РНК пулдаун была использована для выявления AUBP, которая стабилизирует calretinin мРНК через являются мотивом.
Поскольку все некодирующих RNAs взаимодействуют белки7, в пробирке РНК пулдаун является хорошим способом и assay первого выбора для определения РНК посредники для помощи в расшифровке молекулярных механизмов. В этом методе РНК пулдаун коммерчески синтезированных РНК зондами, которые были помечены с измененной форме биотин (desthiobiotin) в отеле terminus 3' стренги РНК, были использованы. РНК desthiobiotin прикол через взаимодействие с стрептавидина на магнитной бусины, которые используются для тянуть вниз белки, которые непосредственно взаимодействуют с граница РНК интерес. Non денатурированный и активных белков из цитозольной фракции клетки мезотелиомы используются как источник белков. Такие РНК прыгните белки являются этого eluted от магнитной бусины, запустить через гель SDS-PAGE 12%, переданы мембраны и исследован с различными антителами.
В процедуре очищения сродства стандартных стрептавидина биотин, суровых денатурации необходимые условия сорвать сильный необратимым биотин стрептавидина облигаций для элюировать связанных белков-8, который может привести к диссоциации белковых комплексов. В отличие от биотин desthiobiotin обратимо связывается с стрептавидина и конкурентоспособным перемещенных с буфферезированный раствор биотина, позволяя для нежный элюции белков и избежать изоляции естественно биотинилированным молекул9, Предполагая, что этот метод идеально подходит для изоляции родной белковых комплексов в родной условиях.
В vitro условий привязки и жесткости, которые определяются концентрации соли, восстановителей и стиральный порошок процент, должна быть близка к присутствующим в сотовой связи для того, чтобы определить значение true в естественных условиях взаимодействия. Обязательного условия выполнены здесь были ранее продемонстрированы как пригодные для идентификации HuR как AU-связывания белков10. Этот подход мог бы сэкономить время, поскольку оптимизация условий надлежащего привязки может быть длительным и сложным. Кроме того этот метод может использоваться в качестве отправной протокол для любого эксперимента РНК пулдаун и постепенно может быть оптимизирована путем изменения концентрации солей и моющих средств, изменив процент отведенного под глицерина и добавления других солей. Кроме того мы показали, что даже короткий 25-нуклеотидов РНК зонд укрывательство пентамера являются мотив могут быть использованы для демонстрации взаимодействия с конкретным AUBP.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1340">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">NE-PER Nuclear and cytoplasmic extraction kit</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:124px;">78833</td>
			<td style="width:468px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">A32965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">20164</td>
			<td>Includes magnetic beads and therefore the kit need to be stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Pierce RNA 3&#8217; End Desthiobiotinylation Kit&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">20163</td>
			<td style="width:468px;">The kit is a part of the &#34;Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit&#34;, and needs to be stored at -20 &#176;C unlike the pull-down kit (4 &#176;C).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DynaMag-2,&#160; magnetic stand</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:453px;">Anti - HuR (MOUSE) monoclonal antibody</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">-</td>
			<td style="width:468px;">The antibody is included in the Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit&#160; - 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Anti - &#945; - tubulin (MOUSE) monoclonal antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td style="width:124px;">8035</td>
			<td>1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Anti - PARP (RABBIT) Polyclonal antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9542</td>
			<td>1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - goat anti-rabbit secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Anti - Mesothelin (MOUSE) Monoclonal Antibody&#160;</td>
			<td>Rockland</td>
			<td>200-301-A87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Secondary goat anti-rabbit antibody</td>
			<td style="width:295px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:124px;">7074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Secondary rabbit anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">A-9044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">RPMI - 1640 medium</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">FBS - Filtrated Bovine Serum</td>
			<td style="width:295px;">Pan Biotech&#160;</td>
			<td style="width:124px;">P40-37500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Penicillin - streptomycin (100x)</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:124px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">L-Glutamine solution (200 mM)</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:124px;">G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">0.25% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td style="width:295px;">Gibco by Life technologies&#160;</td>
			<td style="width:124px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Mini-PROTEAN 3 Cell</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:124px;">1653301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Mini Protean System Glass Plates&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:124px;">1653308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Mini-PROTEAN Spacer Plates with 1.5 mm integrated spacer</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:124px;">1653312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Mini-PROTEAN Comb, 10-well, 1.5 mm, 66 &#181;L</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:124px;">1653365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Modules</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:124px;">1658050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:453px;">Rotiphorese gel 30 - aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ration of 37.5:1</td>
			<td style="width:295px;">Roth</td>
			<td style="width:124px;">3029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">20% SDS&#160;</td>
			<td style="width:295px;">PanReac AppliChem</td>
			<td>A3942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">PVDF transfer membrane&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:124px;">NEF1002</td>
			<td>Need to be activated by incubating in pure methanol for 1 min followed by washing in water for 2 min&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Trans-Blot SD semi-dry transfer cell&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td>1703940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Clarity Western ECL Substrate</td>
			<td style="width:295px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:124px;">1705061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">FusionFX&#160; Digital Imager</td>
			<td style="width:295px;">Vilber</td>
			<td style="width:124px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">RNA oligo synthesis</td>
			<td style="width:295px;">Mycrosynth AG, Switzerland</td>
			<td style="width:124px;">-</td>
			<td>the synthesis scale - 0.04 &#181;mol - HPLC purified</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Hydrochloric Acid (HCl) 6 M</td>
			<td style="width:295px;">PanReac AppliChem</td>
			<td style="width:124px;">182883.1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Ultra Pure 1 M Tris, pH 7.5&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">15567027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Glycerol&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17904</td>
			<td>50% sterile aliquots to be stored at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:453px;">Pierce Streptavidin magnetic beads&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:124px;">88817</td>
			<td style="width:468px;">Please note that these magnetic beads have an average diameter of 1 &#181;m (range from 0.5 - 1.5 &#181;m). Furthermore, Dynabeads-M280 Streptavidin, which are beads of homogenouse size 2.8 &#181;m, are also used in RNA-pulldown but be aware that this may affect purification process.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">TEMED</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Ammonium persulfate&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:453px;">Coomassie G-250</td>
			<td style="width:295px;">Applichem</td>
			<td style="width:124px;">A3480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminiumsulfate-(14-18)-hydrate&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:124px;">368458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ortho-phosphoric acid&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Applichem</td>
			<td style="width:124px;">A0637</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

desthiobiotin-streptavidin-affinity mediated purification of rna-interacting proteins in mesothelioma cells

В vitro РНК пулдаун до сих пор широко используется в первые шаги протоколов, направленных на выявление RNA-связывая протеинов, которые признают конкретных структур РНК и мотивы. В этом протоколе РНК пулдаун, коммерчески синтезированных РНК зонды помечены с измененной форме биотина, desthiobiotin, на станции 3' strand РНК, который обратимо связывается с стрептавидина и таким образом позволяет элюции белков под более физиологических условий. РНК desthiobiotin прикол через взаимодействие с стрептавидина на магнитной бусины, которые используются для тянуть вниз белки, которые непосредственно взаимодействуют с РНК интерес. Non денатурированный и активных белков из цитозольной фракции клетки мезотелиомы используются как источник белков. Метод, описанный здесь может применяться для определения взаимодействия между известных РНК связывания белков и 25-нуклеотидов (nt) длиной РНК зонд содержащий последовательность интереса. Это полезно для завершения функциональная характеристика стабилизации или дестабилизирующих элементов, присутствующих в молекулы РНК с помощью пробирного вектор репортер.

В этом эксперименте был использован фрагмент длиной 25-nt calretinin 3' УТР укрывательстве являются мотив (CALB2 3' УТР (являются) 25-nt) для проверки, является ли он связывает специально для человека антиген R (ГУР) белка, известного мРНК стабилизатор. Для тестирования специфика явля...

Watch this Scientific Journal Video about Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells at JoVE.com

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells

Desthiobiotin стрептавидина близость опосредованной очистки белков взаимодействующих РНК в клетки мезотелиомы

Desthiobiotin маркировка синтетических 25-нуклеотидов РНК oligo, который содержит элемент аденин-богатые люди (являются) мотив, позволяет конкретной привязки цитозольной являются связывающий белок.

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

Испарение снижающих культуры Состояние увеличивает Воспроизводимость многоклеточных сфероида образования в микротитрационных планшетах

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential ...

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Подсчет белков в одиночных клетках с адресно капелька Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

A Preclinical Mouse Model of Osteosarcoma to Define the Extracellular Vesicle-mediated Communication Between Tumor and Mesenchymal Stem Cells

Доклинические мыши модель остеосаркома определить внеклеточного везикул опосредованной коммуникации между опухоли и мезенхимальных стволовых клеток

Within the tumor microenvironment, resident or recruited mesenchymal stem cells (MSCs) contribute to malignant progression in multiple cancer types. Under ...

Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines

Радиочувствительность стволовых клеток рака в линиях клеток рака легких

The presence of cancer stem cells (CSCs) has been associated with relapse or poor outcomes after radiotherapy. Studying radioresistant CSCs may provide ...

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Functional Assessment of BRCA1 variants using CRISPR-Mediated Base Editors

Функциональная оценка вариантов BRCA1 с использованием базовых редакторов CRISPR-Mediated

Recent studies have investigated the risks associated with BRCA1 gene mutations using various functional assessment methods such as fluorescent reporter ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro Оценка онкогенной трансформации в эпителиальных клетках молочной железы человека

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Fluorescence Microscopy for ATP Internalization Mediated by Macropinocytosis in Human Tumor Cells and Tumor-xenografted Mice

Флуоресцентная микроскопия для интернализации АТФ, опосредованной макропиноцитозом в опухолевых клетках человека и опухоле-ксенотрансплантированных мышах

Adenosine triphosphate (ATP), including extracellular ATP (eATP), has been shown to play significant roles in various aspects of tumorigenesis, such as ...

Generation and Expansion of Primary, Malignant Pleural Mesothelioma Tumor Lines

Генерация и расширение первичных, злокачественных опухолевых линий мезотелиомы плевры

Current methodologies for the expansion of primary tumor cell lines from rare tumor types are lacking. This protocol describes methods to expand primary ...

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Ex Vivo Organoid Model of Adenovirus-Cre Mediated Gene Deletions in Mouse Urothelial Cells

Ex Vivo Органоидная модель аденовирусно-cre опосредованных делеций генов в уротелиальных клетках мышей

Bladder cancer is an understudied area, particularly in genetically engineered mouse models (GEMMs). Inbred GEMMs with tissue-specific Cre and loxP sites ...

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Одновременная визуализация и обнаружение на основе проточной цитометрии множественных флуоресцентных маркеров старения в терапевтических стареющих раковых клетках, вызванных терапией

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...