Name: toeprinting analysis of translation initiation complex formation on mammalian mrnas
Uploaded: 2018-05-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs at JoVE.com

تم تمويل هذا العمل علوم الطبيعية والهندسة المجلس من كندا-اكتشاف "منحة بحثية" (رجبين-2017-05463)، و "المؤسسة الكندية" للابتكار-جون ر. إيفانز قادة الصندوق (35017) وبرنامج يبتكر ألبرتا للحرم الجامعي ووزارة ألبرتا التنمية الاقتصادية والتجارة.

ملاحظة: الجيش الملكي النيبالي عرضه للتدهور ب ribonucleases (رنسيس). اتخاذ الاحتياطات القياسية للحفاظ على سلامة الجيش الملكي النيبالي. تغيير القفازات في كثير من الأحيان. استخدام تصفية نصائح ماصة، وخالية من نوكلاس بلاستيكواري والمواد الكيميائية نوكلاس مجاناً في جميع الخطوات للبروتوكول. استخدام ?...

<ol>
	<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+stress+and+apoptosis.">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li><li>Lacerda, R., Menezes, J., Romao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+just+scanning:+the+importance+of+cap-independent+mRNA+translation+initiation+for+cellular+stress+response+and+cancer.">More than just scanning: the importance of cap-independent mRNA translation initiation for cellular stress response and cancer.</a> Cell Mol Life Sci. 74 (9), 1659-1680 (2017).</li><li>Sharma, D. K., Bressler, K., Patel, H., Balasingam, N., Thakor, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Eukaryotic+Initiation+Factors+during+Cellular+Stress+and+Cancer+Progression.">Role of Eukaryotic Initiation Factors during Cellular Stress and Cancer Progression.</a> J Nucleic Acids. 2016, 8235121 (2016).</li><li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+translational+control.">Molecular mechanisms of translational control.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (10), 827-835 (2004).</li><li>Anthony, D. D., Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+40+S+and+80+S+complexes+with+mRNA+as+measured+by+sucrose+density+gradients+and+primer+extension+inhibition.">Analysis of 40 S and 80 S complexes with mRNA as measured by sucrose density gradients and primer extension inhibition.</a> J Biol Chem. 267 (3), 1554-1562 (1992).</li><li>Hartz, D., McPheeters, D. S., Traut, R., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extension+inhibition+analysis+of+translation+initiation+complexes.">Extension inhibition analysis of translation initiation complexes.</a> Methods Enzymol. 164, 419-425 (1988).</li><li>Shirokikh, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+ribosome-mRNA+complexes+at+different+translation+stages.">Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages.</a> Nucleic Acids Res. 38 (3), 15 (2010).</li><li>Thakor, N., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRES-mediated+translation+of+cellular+messenger+RNA+operates+in+eIF2alpha-+independent+manner+during+stress.">IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress.</a> Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).</li><li>Liwak, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+suppressor+PDCD4+represses+internal+ribosome+entry+site-mediated+translation+of+antiapoptotic+proteins+and+is+regulated+by+S6+kinase+2.">Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2.</a> Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).</li><li>Thakor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mRNA+recruits+the+ribosome+via+eIF3-PABP+bridge+to+initiate+internal+translation.">Cellular mRNA recruits the ribosome via eIF3-PABP bridge to initiate internal translation.</a> RNA Biol. , 1-15 (2016).</li><li>Thoma, C., Bergamini, G., Galy, B., Hundsdoerfer, P., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+IRES-mediated+translation+of+the+c-myc+and+BiP+mRNAs+by+the+poly(A)+tail+is+independent+of+intact+eIF4G+and+PABP.">Enhancement of IRES-mediated translation of the c-myc and BiP mRNAs by the poly(A) tail is independent of intact eIF4G and PABP.</a> Mol Cell. 15 (6), 925-935 (2004).</li><li>Baird, S. D., Lewis, S. M., Turcotte, M., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+search+for+structurally+similar+cellular+internal+ribosome+entry+sites.">A search for structurally similar cellular internal ribosome entry sites.</a> Nucleic Acids Res. 35 (14), 4664-4677 (2007).</li><li>Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+a+single+GTP+is+used+in+the+formation+of+80+S+initiation+complexes.">Evidence that a single GTP is used in the formation of 80 S initiation complexes.</a> J Biol Chem. 254 (10), 3708-3711 (1979).</li><li>Arnaud, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+34-Kilodalton+Isoform+of+Human+Fibroblast+Growth+Factor+2+Is+Cap+Dependently+Synthesized+by+Using+a+Non-AUG+Start+Codon+and+Behaves+as+a+Survival+Factor.">A New 34-Kilodalton Isoform of Human Fibroblast Growth Factor 2 Is Cap Dependently Synthesized by Using a Non-AUG Start Codon and Behaves as a Survival Factor.</a> Mol Cell Biol. 19 (1), 505-514 (1999).</li><li>Dmitriev, S. E., Pisarev, A. V., Rubtsova, M. P., Dunaevsky, Y. E., Shatsky, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+48S+translation+preinitiation+complexes+into+80S+initiation+complexes+as+revealed+by+toeprinting.">Conversion of 48S translation preinitiation complexes into 80S initiation complexes as revealed by toeprinting.</a> FEBS Lett. 533 (1-3), 99-104 (2003).</li><li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+selective+mRNA+translation+in+mammalian+cells+by+polysome+profiling.">Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling.</a> J Vis Exp. (92), e52295 (2014).</li><li>Duncan, C. D. S., Mata, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cycloheximide+on+the+interpretation+of+ribosome+profiling+experiments+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Effects of cycloheximide on the interpretation of ribosome profiling experiments in Schizosaccharomyces pombe.</a> Sci Rep. 7 (1), 10331 (2017).</li><li>Beck, H. J., Janssen, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Translation+Initiation+Regulation+Mechanism+in+Escherichia+coli+ptrB+Mediated+by+a+5'-Terminal+AUG.">Novel Translation Initiation Regulation Mechanism in Escherichia coli ptrB Mediated by a 5'-Terminal AUG.</a> J Bacteriol. 199 (14), (2017).</li></ol>

توبرينتينج تقنية قوية لقياس قدرة الحمض النووي الريبي للفائدة لدعم تشكيل مجمعات بدء الترجمة تحت ظروف درجة عالية من التحكم مباشرة. هذا البروتوكول وصف تقنية مبسطة توبرينتينج الكشف الثدييات. أرنب خلية شبكية ليستي (ررل) يستخدم كمصدر مناسب ريبوسوم، ايفس، البادئ الحمض الريبي النووي النقال، واي...

كما الترجمة يستهلك الطاقة الخلوية أكثر، فمن المنطقي أن الترجمة هي محكم التنظيم1. على العكس من ذلك، من التقلبات للترجمة-والتعديلات اللاحقة في إنتاج البروتين-كثيرا ما يلاحظ في الدول الاستجابة للإجهاد والأمراض، مثل السرطان1،2. وميزة رئيسية لمراقبة متعدية الجنسيات هو السرعة التي يمكن أن يغير خلايا إنتاج البروتين من أجل الاستجابة لمختلف المحفزات3. وهكذا يمثل التنظيم الترجمة إليه هامة التي يمكن أن تؤثر على بقاء الخلية والموت1،،من23. خطوات الترجمة، هو البدء بدرجة عالية من التنظيم والمعقدة معظم3. بإيجاز، مرناس الأكثر حقيقية النواة تحتوي على cap7ز م 5 ' ضروري دائماً تقريبا لترجمتها. يتطلب الشروع في كاب-تعتمد على بدء التوكسينات العوامل eIF4E، و eIF4A، و eIF4G (كاب-الاعتراف بالمجمع) للتفاعل مع نهاية 5 ' مرناً. 43S بريينيتييشن الريبوسوم المعقدة، التي تتضمن البادئ eIF2 زمنياً الحمض الريبي النووي النقال و eIF3، يتم تجنيده لنهاية 5 ' مرناً عن طريق تفاعل eIF4G مع eIF3. بريينيتييشن معقدة ويعتقد أن تفحص مرناً، بمساعدة eIF4A (الجيش الملكي النيبالي هيليكاز) حتى يقع كودون ابدأ (أغسطس). بدء 48S المعقدة هو شكلت لاحقاً ويتم تسليم الحمض الريبي النووي النقال في الرتبة فموقع الريبوسوم. أخيرا، متحدون مفارز الريبوسوم 40S و 60S تشكل بدء 80S المعقدة، تليها الترجمة الاستطالة1،،من34. وفي المقابل، تجاوز مواقع دخول الريبوسوم الداخلية (إيريسيس) شرط لسقف 5 ' بتجنيد الوحيدات ريبوسومال 40S مباشرة إلى كودون الشروع في3. تخفيف ظروف الإجهاد الفسيولوجية العالمية مرناً الترجمة بسبب تعديلات عوامل الرئيسية العامة بدء حقيقية النواة (ايفس). بيد أن الترجمة غير متعارف عليه الشروع في آليات تسمح بترجمة الانتقائي لبعض مرناس التي غالباً ما ترميز البروتينات الاستجابة للإجهاد وتورط التقلبات لبدء الترجمة غير متعارف عليه في الحالات المرضية مثل السرطان 1 , 2-العناصر التنظيمية "سرية الجيش الملكي النيبالي"، مثل إيريسيس الخلوية، تسمح لترجمة هذه2،مرناس3.
أحد جوانب مثيرة للاهتمام لا سيما مراقبة متعدية فهم آليات متعارف عليه مقابل الترجمة غير المقبول من مرناً معين. توبرينتينج هو أسلوب الذي يسمح آليا إلى الدراسة التفصيلية لبدء الترجمة محددة الكشف في المختبر. والهدف العام من توبرينتينج لتقييم قدرة الحمض النووي الريبي للفائدة على نوكليتي تشكيل بدء الترجمة المعقدة مع الريبوسوم تحت مجموعة متنوعة من الظروف، من أجل تحديد تسلسل، والعناصر الهيكلية، أو الملحقات عوامل مطلوبة من أجل الشروع في ترجمة تتسم بالكفاءة. على سبيل المثال، قد أعاق في غياب سقف 5 ' تجنيد الريبوسوم لكن يحفزه وجود آيريس.
ومبدأ هذه التقنية إلى في المختبر نسخ الحمض النووي الريبي للفائدة، احتضان ذلك حضور مقتطفات الخلوية التي تحتوي على مكونات الترجمة (أو مكونات المنقي) للسماح بالشروع في مجمعات للنموذج، وعكس نسخ الجيش الملكي النيبالي بكتاب معين. سوف يتسبب مستقرة الجيش الملكي النيبالي-الريبوسوم مجمعات النسخ العكسي المماطلة على حافة 3 '6،75،الريبوسوم، ما يسمى' توبرينت '.
في هذا البروتوكول ومفارز ريبوسومال، ايفس، ترنس وايريس ترانس-العوامل بالنيابة (إيتافس) هي أسهم مريح بأرنب خلية شبكية ليستي (ررل). وهناك ميزة أخرى لهذا البروتوكول هو استخدام تمهيدي المسمى فلوريسسينتلي وتصوير المستندة إلى جل الأسفار، بدلاً من كتاب راديولابيليد. وهذا يلغي خطوات إضافية، بما في ذلك راديولابيلينج التمهيدي، فضلا عن تجفيف الجل ويعرضها على شاشة تكثيف. تسجل العصابات الفلورسنت في الوقت الحقيقي، كما يدير هلام، مما يسمح للقرار أكبر. لم يسبق لهم اللعب المانع مرتبطة بالعاشر من البروتين (شياب) المبرمج آيريس رنا كمثال هنا، على الرغم من أن يمكن أيضا أن تحلل مرناس توج بهذا الأسلوب8.
على عكس التحليل الغربي، الذي يقيس الناتج النهائي لعملية الترجمة في الخلية ليساتيس، توبرينتينج نهج في المختبر لقياس الترجمة بدء تشكيل معقدة في الجيش الملكي النيبالي. يسمح هذا النهج التخفيضي لدراسة مفصلة للغاية من ركائز أو العوامل التي تنظم الشروع في ترجمة (على سبيل المثال-، توج أو الأمم المتحدة توج مرناً، إيريس الهيكل، ووجود أو عدم وجود الذيل بولي-أ، وتوفير عوامل محددة من البروتين، إلخ.). ومن ثم، يمكن استخدام توبرينتينج لدراسة أوضاع مختلفة للترجمة8 أو آثار هياكل مرناً، مثل إيريسيس، في البروتين التوليف9،10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1045px;" width="1043">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:405px;">DEPC (Diethyl pyrocarbonate)</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:191px;">D5758-100ML</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TRIS base, Ultrapure</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>4109-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KOAc (Potassium acetate)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>PB0438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mg(OAc)2 (Magnesium acetate tetrahydrate)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>MB0326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sucrose, molecular biology grade</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>573113-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spermidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>85558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GMP-PNP (Guanosine 5&#8242;-[&#946;,&#947;-imido]triphosphate trisodium salt hydrate) 0.1 M solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G0635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ATP (Adenosine 5&#8242;-triphosphate) disodium salt, 100 mM solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">19:1 Acrylamide:bis-acrylamide, 40%</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>A0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Urea</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>UB0148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">500mL bottle top filtration units, 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1823.101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Formamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9037-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EDTA (disodium salt, dihydrate)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>EB0185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SDS</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>SB0485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bromophenol blue</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>BDB0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Xylene cyanol FF</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>XB0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MEGAshortscript T7 transcription kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">mMESSAGE mMACHINE T7 transcription kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Acid Phenol:Chloroform (5:1)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:405px;">25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:191px;">15593-049</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL). Should NOT be nuclease-treated.</td>
			<td>Green Hectares, USA</td>
			<td></td>
			<td>Contact Green Hectares, ask for 1:1 RRL:water</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RiboLock RNase Inhibitor (40 U/&#181;L)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>E00382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 mM dNTPs</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56172, 56173, 56174, 56175</td>
			<td>Mix equal parts for a stock of 25 mM each.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AMV-RT, 10 U/&#181;L</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M5101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>707701KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Model 4200 IR2 DNA analyzer</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td></td>
			<td>Product has been discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">APS (Ammonium Persulfate)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>AB0072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TEMED</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>TB0508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Phusion High Fidelity Polymerase</td>
			<td style="width:159px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:191px;">M0530</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Turbo Dnase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toeprinting analysis of translation initiation complex formation on mammalian mrnas

بدء الترجمة خطوة الحد من معدل تخليق البروتين ويمثل إحدى نقاط رئيسية التي تنظم الخلايا على إنتاج البروتين. التنظيم تخليق البروتين هو مفتاح الاستجابة الخلوية للإجهاد، والتقلبات المركزية للعديد من الدول الأمراض، مثل السرطان. على سبيل المثال، على الرغم من أن الإجهاد الخلوي يؤدي إلى تثبيط الترجمة العالمية المخففة كاب-تعتمد على الشروع، تترجم بعض البروتينات الاستجابة للإجهاد بشكل انتقائي بطريقة مستقلة عن عملية النداءات الموحدة. العناصر التنظيمية سرية الجيش الملكي النيبالي، مثل مواقع دخول الريبوسوم الداخلية الخلوية (إيريسيس)، تسمح لترجمة هذه مرناس محددة. تم تحديد هذه مرناس، وتوصيف آلياتها التنظيمية، مجالاً رئيسيا في البيولوجيا الجزيئية. توبرينتينج أسلوب لدراسة بنية الحمض النووي الريبي ووظيفة فيما يتعلق بالشروع في الترجمة. وهدف توبرينتينج لتقييم القدرة في المختبر نسخها من الحمض النووي الريبي تشكيل مجمعات مستقرة مع ريبوسوم تحت مجموعة متنوعة من الظروف، بهدف تحديد تسلسل أو العناصر الهيكلية التبعي العوامل التي تشترك في الريبوسوم ملزمة – مؤشر قبل بدء الترجمة الفعالة. جنبا إلى جنب مع أساليب أخرى، مثل تحليل الغربية والتنميط polysome، يسمح توبرينتينج لوصف قوي لآليات لتنظيم بدء الترجمة.

التي وصفناها سابقا قدرة "آيريس شياب" لدعم بدء الترجمة المستقلة كاب في المختبر8،10. وكان توبرينتينج هذه التقنية الرئيسية استجواب آليا إلى تفاصيل بدء "آيريس شياب" المعقدة. بنية الحمض النووي ترميز مرناً تتضمن "آيريس شياب" (الشكل...

Watch this Scientific Journal Video about Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs at JoVE.com

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

تحليل توبرينتينج "الترجمة بدء تشكيل معقدة" في مرناس الثدييات

توبرينتينج يهدف إلى قياس القدرة في المختبر نسخها الجيش الملكي النيبالي لنموذج المجمعات بدء الترجمة مع ريبوسوم تحت ظروف متنوعة. هذا البروتوكول وصف أسلوب للثدييات الجيش الملكي النيبالي توبرينتينج ويمكن استخدامها لدراسة الترجمة تعتمد على عملية النداءات الموحدة ويحركها إيريس.

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

البروتين مجمع القبض على الانجذاب من خلايا الثدييات Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

الفلورة الكمية لقياس عالمية مترجمة ترجمة

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

على نطاق الجينوم الكمي للترجمة في مهدها الخميرة بالتنميط الريبوسوم

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

طريقة بسيطة لفحص المواد الكيميائية عالية الإنتاجية في ايليجانس كاينورهابديتيس

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

دراسة عن الأيض من المبيدات الحشرية النظامية الستة في ثقافة تعليق الخلية المنشأة حديثا المستمدة من الشاي(كاميليا سينينسيس L.) يترك

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

اختبار تصوير أحادي الجزيء في المختبر لتحليل حركية الترجمة المعتمدة على الغطاء

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads

استكمال نشاط الربط بواسطة Galectin-3 - U1 SnRNP مجمع على الخرز

Classic depletion-reconstitution experiments indicate that galectin-3 is a required splicing factor in nuclear extracts. The mechanism of incorporation of ...

Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex

قياس تكوين CD95 الموت المسببة للإشارات المعقدة ومعالجة Procaspase-8 في هذا المجمع

Extrinsic apoptosis is mediated by the activation of death receptors (DRs) such as CD95/Fas/APO-1 or tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

الجمع الروتيني لمجموعات بيانات التبريد EM عالية الدقة باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل 200 كيلو فولت

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

Characterization of Ternary Complex Formation in PROTACs Using Biophysical Assays

The Development and Application of Biophysical Assays for Evaluating Ternary Complex Formation Induced by Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACS)

Evaluating Biophysical Assays for Characterizing PROTACS Ternary Complexes (Video) | JoVE

تطوير وتطبيق المقايسات الفيزيائية الحيوية لتقييم تكوين المركب الثلاثي الناجم عن التحلل البروتيني الذي يستهدف الوهم (PROTACS)

E3 ligases and proteins targeted for degradation can be induced to form complexes by heterobifunctional molecules in a multi-step process. The kinetics ...