Name: toeprinting analysis of translation initiation complex formation on mammalian mrnas
Uploaded: 2018-05-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch eine Natur- und Engineering Research Council von Kanada-Discovery Grant (RGPIN-2017-05463), der Kanada-Stiftung für Innovation-John R. Evans Leaders Fund (35017), am Campus Alberta innoviert Programm und das Ministerium für Alberta finanziert. Wirtschaftliche Entwicklung und Handel.

Hinweis: RNA ist sehr anfällig gegen Abbau durch Ribonuclease (RNases). Vorkehrungen Sie treffen, standard, die RNA intakt zu halten. Ändern Sie häufig Handschuhe. Verwenden Sie gefilterte Pipettenspitzen, Nuklease-freie Plastikware und Nuklease-freie Chemikalien in allen Schritten des Protokolls. Nuklease-freie Nutzung oder Diethyl-Pyrocarbonate (DEPC)-behandeltes Wasser für alle Lösungen.
1. Vorbereitung der Lösungen
<ol><li>Toeprinting Puffer vorzubereiten: 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), ...

<ol>
	<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+stress+and+apoptosis.">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li><li>Lacerda, R., Menezes, J., Romao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+just+scanning:+the+importance+of+cap-independent+mRNA+translation+initiation+for+cellular+stress+response+and+cancer.">More than just scanning: the importance of cap-independent mRNA translation initiation for cellular stress response and cancer.</a> Cell Mol Life Sci. 74 (9), 1659-1680 (2017).</li><li>Sharma, D. K., Bressler, K., Patel, H., Balasingam, N., Thakor, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Eukaryotic+Initiation+Factors+during+Cellular+Stress+and+Cancer+Progression.">Role of Eukaryotic Initiation Factors during Cellular Stress and Cancer Progression.</a> J Nucleic Acids. 2016, 8235121 (2016).</li><li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+translational+control.">Molecular mechanisms of translational control.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (10), 827-835 (2004).</li><li>Anthony, D. D., Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+40+S+and+80+S+complexes+with+mRNA+as+measured+by+sucrose+density+gradients+and+primer+extension+inhibition.">Analysis of 40 S and 80 S complexes with mRNA as measured by sucrose density gradients and primer extension inhibition.</a> J Biol Chem. 267 (3), 1554-1562 (1992).</li><li>Hartz, D., McPheeters, D. S., Traut, R., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extension+inhibition+analysis+of+translation+initiation+complexes.">Extension inhibition analysis of translation initiation complexes.</a> Methods Enzymol. 164, 419-425 (1988).</li><li>Shirokikh, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+ribosome-mRNA+complexes+at+different+translation+stages.">Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages.</a> Nucleic Acids Res. 38 (3), 15 (2010).</li><li>Thakor, N., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRES-mediated+translation+of+cellular+messenger+RNA+operates+in+eIF2alpha-+independent+manner+during+stress.">IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress.</a> Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).</li><li>Liwak, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+suppressor+PDCD4+represses+internal+ribosome+entry+site-mediated+translation+of+antiapoptotic+proteins+and+is+regulated+by+S6+kinase+2.">Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2.</a> Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).</li><li>Thakor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+mRNA+recruits+the+ribosome+via+eIF3-PABP+bridge+to+initiate+internal+translation.">Cellular mRNA recruits the ribosome via eIF3-PABP bridge to initiate internal translation.</a> RNA Biol. , 1-15 (2016).</li><li>Thoma, C., Bergamini, G., Galy, B., Hundsdoerfer, P., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+IRES-mediated+translation+of+the+c-myc+and+BiP+mRNAs+by+the+poly(A)+tail+is+independent+of+intact+eIF4G+and+PABP.">Enhancement of IRES-mediated translation of the c-myc and BiP mRNAs by the poly(A) tail is independent of intact eIF4G and PABP.</a> Mol Cell. 15 (6), 925-935 (2004).</li><li>Baird, S. D., Lewis, S. M., Turcotte, M., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+search+for+structurally+similar+cellular+internal+ribosome+entry+sites.">A search for structurally similar cellular internal ribosome entry sites.</a> Nucleic Acids Res. 35 (14), 4664-4677 (2007).</li><li>Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+a+single+GTP+is+used+in+the+formation+of+80+S+initiation+complexes.">Evidence that a single GTP is used in the formation of 80 S initiation complexes.</a> J Biol Chem. 254 (10), 3708-3711 (1979).</li><li>Arnaud, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+34-Kilodalton+Isoform+of+Human+Fibroblast+Growth+Factor+2+Is+Cap+Dependently+Synthesized+by+Using+a+Non-AUG+Start+Codon+and+Behaves+as+a+Survival+Factor.">A New 34-Kilodalton Isoform of Human Fibroblast Growth Factor 2 Is Cap Dependently Synthesized by Using a Non-AUG Start Codon and Behaves as a Survival Factor.</a> Mol Cell Biol. 19 (1), 505-514 (1999).</li><li>Dmitriev, S. E., Pisarev, A. V., Rubtsova, M. P., Dunaevsky, Y. E., Shatsky, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+48S+translation+preinitiation+complexes+into+80S+initiation+complexes+as+revealed+by+toeprinting.">Conversion of 48S translation preinitiation complexes into 80S initiation complexes as revealed by toeprinting.</a> FEBS Lett. 533 (1-3), 99-104 (2003).</li><li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+selective+mRNA+translation+in+mammalian+cells+by+polysome+profiling.">Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling.</a> J Vis Exp. (92), e52295 (2014).</li><li>Duncan, C. D. S., Mata, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cycloheximide+on+the+interpretation+of+ribosome+profiling+experiments+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Effects of cycloheximide on the interpretation of ribosome profiling experiments in Schizosaccharomyces pombe.</a> Sci Rep. 7 (1), 10331 (2017).</li><li>Beck, H. J., Janssen, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Translation+Initiation+Regulation+Mechanism+in+Escherichia+coli+ptrB+Mediated+by+a+5'-Terminal+AUG.">Novel Translation Initiation Regulation Mechanism in Escherichia coli ptrB Mediated by a 5'-Terminal AUG.</a> J Bacteriol. 199 (14), (2017).</li></ol>

Toeprinting ist eine leistungsstarke Technik, die Möglichkeit einer RNA von Interesse, die Bildung von Übersetzung Einleitung komplexen unter sehr kontrollierten Bedingungen unterstützen direkt zu messen. Dieses Protokoll beschreibt eine vereinfachte Technik für Toeprinting Säugetieren RNAs. Kaninchen Retikulozytenzahl lysate (RRL) dient als bequeme Quelle von Ribosomen, WDVS, Initiator tRNA und IRES Trans-wirkenden Faktoren (ITAFs). Der Experimentator bietet ihre RNA der Wahl und kann auch die Toeprinting ...

Wie die Übersetzung die zelluläre Energie verbraucht, ist es sinnvoll, dass Übersetzung streng regulierte1ist. Umgekehrt, Dysregulation der Übersetzung- und den daraus resultierenden Änderungen in Protein-Ausgabe-oft in Stress-Reaktion und Krankheit Staaten, z. B. Krebs1,2eingehalten wird. Ein großer Vorteil der translational Control ist die Geschwindigkeit, mit der Zellen ihre Protein-Produktion verändern können, um auf verschiedene Reize3reagieren. Übersetzung-Verordnung stellt somit einen wichtigen Mechanismus, der Zelle überleben und Tod1,2,3beeinflussen können. Von den Stufen des Übersetzung ist Initiation die meisten hoch regulierten und komplexen3. Kurz, enthalten die meisten eukaryontischen mRNAs eine 5' m7G Mütze, die fast immer für ihre Übersetzung unerlässlich. GAP-abhängige Initiation erfordert eukaryotic Initiation Faktoren eIF4E, eIF4A und eIF4G (GAP-Anerkennung Komplex), mit 5'-Ende der mRNA zu interagieren. 43 preinitiation Ribosomen Komplex, enthält eIF2 gebundene Initiator tRNA und eIF3, wird eingestellt, um die 5'-Ende der mRNA durch eine Wechselwirkung von eIF4G mit eIF3. Die komplexen Preinitiation wird gedacht, um mRNA, unterstützt von eIF4A Scannen (ein RNA-Helikase) bis der Start-Codon (AUG) befindet. Die 48er Einleitung komplexer entsteht anschließend und tRNA wird in der P-Seite von dem Ribosom geliefert. Schließlich sind die 60er und 40er Ribosomen-Untereinheiten vereint bilden die 80er Jahre Einleitung Komplex, gefolgt von Übersetzung Dehnung1,3,4. Im Gegensatz dazu umgehen interne Ribosom Eintrag Websites (IRESes) die Voraussetzung für eine 5' Kappe durch die Rekrutierung der 40er Jahre ribosomalen Untereinheit direkt an die Einleitung Codon3. Physiologischen Spannungszustände dämpfen globale mRNA Übersetzung aufgrund von Änderungen der wichtigsten allgemeinen eukaryotischen Einleitung Faktoren (WDVS). Jedoch nicht-kanonischen Übersetzung Einleitung Mechanismen erlauben selektive Übersetzung bestimmter mRNAs, die oft Stressantwort Proteine codieren und Dysregulation der nicht-kanonischen Übersetzung Initiation ist bei Krankheitszuständen wie Krebs verwickelt 1 , 2. diskret RNA regulatorische Elemente, wie z. B. zelluläre IRESes zu ermöglichen, für die Übersetzung von solchen mRNAs2,3.
Ein besonders interessanter Aspekt von translational Control ist es, Mechanismen der kanonischen versus nicht-kanonischen Übersetzung von einem bestimmten mRNA zu verstehen. Toeprinting ist eine Technik, die der mechanistischen Detailstudie über Übersetzung Einleitung der spezifischen RNAs in Vitroermöglicht. Das Ziel des Toeprinting ist die Fähigkeit einer RNA von Interesse, die Bildung von einer Übersetzung Initiation Komplex mit dem Ribosom unter verschiedensten Bedingungen, um festzustellen, welche Sequenzen, Strukturelemente oder Accessoire Keimbildung zu bewerten Faktoren sind für effiziente Übersetzung Einleitung erforderlich. Beispielsweise könnte Ribosom Rekrutierung in Ermangelung eines 5'-Cap behindert aber angeregt durch die Anwesenheit von einer IRES.
Das Prinzip der Technik ist, in-vitro- transkribieren eine RNA von Interesse, es in Anwesenheit von Zellextrakten mit Übersetzung (oder die gereinigten Komponenten) ermöglichen Einleitung komplexe zu bilden, und umgekehrt zu transkribieren inkubieren die RNA mit einem speziellen Primer. Stabile RNA-Ribosom komplexe verursacht reversen Transkription zum Strömungsabriss am 3' Rand der Ribosom-die so genannte 'Toeprint'5,6,7.
In diesem Protokoll der ribosomalen Untereinheiten, WDVS, tRNAs und IRES Trans-wirkenden Faktoren (ITAFs) werden bequem durch Kaninchen Retikulozytenzahl lysate (RRL) beigetragen. Ein weiterer Vorteil dieses Protokolls ist die Verwendung von Primer eindringmittel beschriftet und Fluoreszenz Gel-basierte Imager, anstatt einer radioaktiven Grundierung. Dadurch entfallen zusätzliche Schritte, einschließlich enzymatische die Grundierung sowie das Gel Trocknen und setzen Sie sie auf eine Intensivierung Bildschirm. Die fluoreszierende Bänder werden in Echtzeit, als die Gel läuft, ermöglicht größere Auflösung aufgezeichnet. Entdeckelte X-chromosomal-Inhibitor von Apoptosis Protein (XIAP) IRES RNA wird hier, als Beispiel verwendet, obwohl angeschnittene Ärmel mRNAs auch mit dieser Technik8analysiert werden kann.
Im Gegensatz zu westlichen Analyse, die die endgültige Ausgabe des Übersetzungsprozesses in Zelle Lysates misst, ist Toeprinting ein in-vitro- Ansatz zur Übersetzung Einleitung Komplexbildung auf einer RNA zu messen. Diese reduktionistische Ansatz ermöglicht es, für die sehr detaillierte Untersuchung von Substraten oder Faktoren, die Übersetzung Einleitung zu regulieren (zB., angeschnittene Ärmel oder UN-angeschnittene Ärmel mRNA, IRES-Struktur, Vorhandensein oder Fehlen von Poly-A Tail, Bestimmung von spezifischen Proteins Faktoren, ( usw.). Daher kann Toeprinting verwendet werden, verschiedene Modi der Übersetzung8 oder die Auswirkungen der mRNA Strukturen, z. B. IRESes, am Protein Synthese9,10zu studieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1045px;" width="1043">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:405px;">DEPC (Diethyl pyrocarbonate)</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:191px;">D5758-100ML</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TRIS base, Ultrapure</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>4109-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KOAc (Potassium acetate)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>PB0438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mg(OAc)2 (Magnesium acetate tetrahydrate)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>MB0326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sucrose, molecular biology grade</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>573113-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spermidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>85558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GMP-PNP (Guanosine 5&#8242;-[&#946;,&#947;-imido]triphosphate trisodium salt hydrate) 0.1 M solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G0635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ATP (Adenosine 5&#8242;-triphosphate) disodium salt, 100 mM solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">19:1 Acrylamide:bis-acrylamide, 40%</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>A0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Urea</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>UB0148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">500mL bottle top filtration units, 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1823.101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Formamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9037-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EDTA (disodium salt, dihydrate)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>EB0185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SDS</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>SB0485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bromophenol blue</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>BDB0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Xylene cyanol FF</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>XB0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MEGAshortscript T7 transcription kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">mMESSAGE mMACHINE T7 transcription kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Acid Phenol:Chloroform (5:1)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:405px;">25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:191px;">15593-049</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL). Should NOT be nuclease-treated.</td>
			<td>Green Hectares, USA</td>
			<td></td>
			<td>Contact Green Hectares, ask for 1:1 RRL:water</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RiboLock RNase Inhibitor (40 U/&#181;L)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>E00382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 mM dNTPs</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56172, 56173, 56174, 56175</td>
			<td>Mix equal parts for a stock of 25 mM each.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AMV-RT, 10 U/&#181;L</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M5101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>707701KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Model 4200 IR2 DNA analyzer</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td></td>
			<td>Product has been discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">APS (Ammonium Persulfate)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>AB0072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TEMED</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>TB0508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Phusion High Fidelity Polymerase</td>
			<td style="width:159px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:191px;">M0530</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Turbo Dnase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toeprinting analysis of translation initiation complex formation on mammalian mrnas

Übersetzung Einleitung ist der Rate-limiting Schritt der Proteinsynthese und ist einen wesentlichen Punkt, bei dem Zellen ihre Protein-Produktion regulieren. Verordnung der Proteinsynthese ist der Schlüssel zur zellulären Stressantwort und Dysregulation ist zentral zu vielen Krankheitszuständen, wie z. B. Krebs. Obwohl zellulären Stress zu die Hemmung der globalen Übersetzung durch mildernde GAP-abhängige Initiation führt, sind bestimmte Stressantwort Proteine beispielsweise selektiv auf GAP-unabhängige Weise übersetzt. Diskrete RNA regulatorische Elemente, wie z. B. zelluläre interne Ribosom Eintrag Websites (IRESes), ermöglichen die Übersetzung dieser spezifischen mRNAs. Identifizierung von solchen mRNAs und die Charakterisierung ihrer regulatorischen Mechanismen wurden ein wichtiger Bereich in der molekularen Biologie. Toeprinting ist eine Methode für die Untersuchung von RNA-Struktur und Funktion betrifft Übersetzung Einleitung. Das Ziel des Toeprinting ist zur Beurteilung der Fähigkeit von in-vitro- transkribierte RNA bilden stabile komplexe mit Ribosomen unter verschiedensten Bedingungen, um festzustellen, welche Sequenzen, Strukturelemente oder Zubehör Faktoren im Ribosom beteiligt sind verbindlich – ein Vorläufer für effiziente Übersetzung Einleitung. Neben anderen Techniken, wie westliche Analyse und Polysome profiling ermöglicht Toeprinting eine robuste Charakterisierung der Mechanismen zur Regulierung der Übersetzung Einleitung.

Zuvor haben wir die Möglichkeit der XIAP IRES zur Unterstützung von GAP-unabhängige Übersetzung Einleitung in-vitro-8,10beschrieben. Toeprinting war der Key-Technik, die mechanistischen Details der komplexen XIAP IRES Einleitung zu befragen. Ein DNA-Konstrukt Codierung eine mRNA mit XIAP IRES (Abb. 1A) wurde in Vitro transkribiert und Toeprinting Analyse unterzog...

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Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Toeprinting Analyse der Übersetzung Einleitung Komplexbildung auf Säugetier-mRNAs

Toeprinting zielt darauf ab, die Möglichkeit der in-vitro- Messung transkribierte RNA zu Form Übersetzung Einleitung komplexe mit Ribosomen unter den unterschiedlichsten Bedingungen. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode für Toeprinting Säugetieren RNA und kann zur GAP-abhängige und IRES-driven Übersetzung zu studieren.

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

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Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Forschung

Biochemie

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

Quantitative Immunfluoreszenz Maßnahme Global lokalisierte Übersetzung

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Genomweite Quantifizierung der Übersetzung in der angehenden Hefe durch Ribosom Profilierung

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

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Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

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Komplementierung der Spleißaktivität durch einen Galectin-3 - U1 snRNP Komplex auf Perlen

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Entwicklung und Anwendung biophysikalischer Assays zur Evaluierung der Bildung ternärer Komplexe, die durch Proteolyse-Targeting-Chimären (PROTACS) induziert werden

E3 ligases and proteins targeted for degradation can be induced to form complexes by heterobifunctional molecules in a multi-step process. The kinetics ...