Name: toeprinting analysis of translation initiation complex formation on mammalian mrnas
Uploaded: 2018-05-10T13:00:00
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이 작품 혁신 존 R. 에반스 지도자 기금 (35017), 캠퍼스 앨버타 혁신 프로그램 및 앨버타 정부는 자연과학 및 공학 연구 위원회의 캐나다 발견 그랜트 (RGPIN-2017-05463), 캐나다 기초에 의해 투자 되었다 경제 개발 및 무역입니다.

참고: RNA는 ribonucleases (RNases)에 의해 저하에 매우 취약. RNA를 그대로 유지 하는 표준 예방 조치. 글러브를 자주 변경 합니다. 프로토콜의 모든 단계에서 필터링 된 피 펫 팁, nuclease 무료 plasticware 및 nuclease 없는 화학 물질을 사용 합니다. Nuclease 무료 사용 또는 diethyl pyrocarbonate (DEPC)-모든 솔루션에 대 한 물 처리.
1입니다. 솔루션의 준비
<ol><li>Toeprinting 버퍼 준비: 20 mM Tris HCl (pH 7...

<ol>
	<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+stress+and+apoptosis.">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li><li>Lacerda, R., Menezes, J., Romao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+just+scanning:+the+importance+of+cap-independent+mRNA+translation+initiation+for+cellular+stress+response+and+cancer.">More than just scanning: the importance of cap-independent mRNA translation initiation for cellular stress response and cancer.</a> Cell Mol Life Sci. 74 (9), 1659-1680 (2017).</li><li>Sharma, D. K., Bressler, K., Patel, H., Balasingam, N., Thakor, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Eukaryotic+Initiation+Factors+during+Cellular+Stress+and+Cancer+Progression.">Role of Eukaryotic Initiation Factors during Cellular Stress and Cancer Progression.</a> J Nucleic Acids. 2016, 8235121 (2016).</li><li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+translational+control.">Molecular mechanisms of translational control.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (10), 827-835 (2004).</li><li>Anthony, D. D., Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+40+S+and+80+S+complexes+with+mRNA+as+measured+by+sucrose+density+gradients+and+primer+extension+inhibition.">Analysis of 40 S and 80 S complexes with mRNA as measured by sucrose density gradients and primer extension inhibition.</a> J Biol Chem. 267 (3), 1554-1562 (1992).</li><li>Hartz, D., McPheeters, D. S., Traut, R., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extension+inhibition+analysis+of+translation+initiation+complexes.">Extension inhibition analysis of translation initiation complexes.</a> Methods Enzymol. 164, 419-425 (1988).</li><li>Shirokikh, N. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+IRES-mediated+translation+of+the+c-myc+and+BiP+mRNAs+by+the+poly(A)+tail+is+independent+of+intact+eIF4G+and+PABP.">Enhancement of IRES-mediated translation of the c-myc and BiP mRNAs by the poly(A) tail is independent of intact eIF4G and PABP.</a> Mol Cell. 15 (6), 925-935 (2004).</li><li>Baird, S. D., Lewis, S. M., Turcotte, M., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+search+for+structurally+similar+cellular+internal+ribosome+entry+sites.">A search for structurally similar cellular internal ribosome entry sites.</a> Nucleic Acids Res. 35 (14), 4664-4677 (2007).</li><li>Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+a+single+GTP+is+used+in+the+formation+of+80+S+initiation+complexes.">Evidence that a single GTP is used in the formation of 80 S initiation complexes.</a> J Biol Chem. 254 (10), 3708-3711 (1979).</li><li>Arnaud, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+34-Kilodalton+Isoform+of+Human+Fibroblast+Growth+Factor+2+Is+Cap+Dependently+Synthesized+by+Using+a+Non-AUG+Start+Codon+and+Behaves+as+a+Survival+Factor.">A New 34-Kilodalton Isoform of Human Fibroblast Growth Factor 2 Is Cap Dependently Synthesized by Using a Non-AUG Start Codon and Behaves as a Survival Factor.</a> Mol Cell Biol. 19 (1), 505-514 (1999).</li><li>Dmitriev, S. E., Pisarev, A. V., Rubtsova, M. P., Dunaevsky, Y. E., Shatsky, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+48S+translation+preinitiation+complexes+into+80S+initiation+complexes+as+revealed+by+toeprinting.">Conversion of 48S translation preinitiation complexes into 80S initiation complexes as revealed by toeprinting.</a> FEBS Lett. 533 (1-3), 99-104 (2003).</li><li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+selective+mRNA+translation+in+mammalian+cells+by+polysome+profiling.">Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling.</a> J Vis Exp. (92), e52295 (2014).</li><li>Duncan, C. D. S., Mata, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cycloheximide+on+the+interpretation+of+ribosome+profiling+experiments+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Effects of cycloheximide on the interpretation of ribosome profiling experiments in Schizosaccharomyces pombe.</a> Sci Rep. 7 (1), 10331 (2017).</li><li>Beck, H. J., Janssen, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Translation+Initiation+Regulation+Mechanism+in+Escherichia+coli+ptrB+Mediated+by+a+5'-Terminal+AUG.">Novel Translation Initiation Regulation Mechanism in Escherichia coli ptrB Mediated by a 5'-Terminal AUG.</a> J Bacteriol. 199 (14), (2017).</li></ol>

Toeprinting 직접 고도로 제어 된 상황에서 번역 개시 복합물의 대형을 지원 하기 위해의 RNA의 능력을 측정 하는 강력한 기술입니다. Toeprinting에 대 한 단순화 된이 프로토콜 설명 포유류 RNAs. 토끼 reticulocyte lysate (RRL) 리보솜, eIFs, 초기자의 편리한 원본으로 사용 되, tRNA와 IRES 트랜스-행동 요인 (ITAFs). 실험 선택의 그들의 RNA를 제공 하 고 또한 그들의 선택의 특정 공동 인자와 toeprinting 반응을 보...

으로 번역 가장 세포 에너지 소비, 그것은 말 번역은 단단히 규제1. 반대로, 번역의 dysregulation-그리고 단백질 출력에 따른 변경-암1,2등, 스트레스 반응과 질병의 상태에서 자주 관찰 됩니다. 변환 제어의 주요 장점은 속도는 셀 다양 한 자극3에 대응 하기 위해 그들의 단백질 출력 변경할 수입니다. 번역 규정 따라서 세포 생존과 죽음1,2,3에 영향을 미칠 수 있는 중요 한 메커니즘을 나타냅니다. 번역의 단계의 개시는 대부분 높은 규제 하 고 복잡 한3입니다. 짧게, 가장 진 핵 mRNAs 포함 5' m7G 모자는 거의 항상 그들의 번역에 대 한 필수. 모자-종속 개시 진 핵 개시 요인 eIF4E, eIF4A, 및 eIF4G 필요 (모자 인식 복합)는 mRNA의 5' 끝에 상호 작용. 43S preinitiation 리보솜, eIF2 바인딩된 초기자를 포함 하는 mRNA를 통해 eIF3와 eIF4G의 상호 작용의 5' 끝에 tRNA와 eIF3, 모집. 복잡 한 괴롭힘 스캔 mRNA, eIF4A에 의해도 왔 생각 된다 (RNA helicase) 시작 codon (8 월)는 때까지. 복잡 한 48S 개시 이후에 형성 그리고 tRNA는 리보솜의 P 사이트에 전달 됩니다. 마지막으로, 60와 40 리보솜 소 단위 번역 신장1,,34다음 80 개시, 복잡 한 형태로 결합 된다. 반면, 내부 리보솜 입장 위치 (IRESes) 개시 코 돈3에 직접 40 ribosomal 소 단위를 모집 하 여 5' 모자에 대 한 요구 사항을 무시할. 생리 적 스트레스 상태 감소 글로벌 mRNA 번역 키 일반 진 핵 개시 요인 (eIFs)의 수정으로 인. 그러나, 종종 스트레스 대응 단백질을 인코딩하는 특정 mRNAs의 선택적 번역 비 정식 번역 개시 메커니즘을 사용 하 고 비 정식 번역 개시의 dysregulation 암 같은 질병 상태에 연루 1 , 2. 세포 IRESes 등 신중 RNA 규제 요소 같은 mRNAs2,3의 번역에 대 한 허용.
변환 제어의 1 개의 특히 재미 있는 양상은 특정된 mRNA의 비 정식 번역 대 정식의 메커니즘을 이해 하는 것입니다. Toeprinting 특정 RNAs 체 외의 번역 개시의 상세한 기계 연구를 허용 하는 기술입니다. Toeprinting의 전반적인 목표는 시퀀스, 구조 요소 또는 액세서리 결정 하기 위해 다양 한 조건에서 리보솜으로 복잡 한 번역 개시의 형성을 nucleate 관심의 RNA의 능력을 평가 하는 요소는 효율적인 번역 개시에 대 한 필요 합니다. 예를 들어, 리보솜 모집 5' 캡의 부재에 방해 수도 있습니다 하지만 한 IRES의 존재에 의해 자극.
체 외에서 하는 것입니다 기술의 원리 개시 단지 형태로, 그리고 반전 녹음 수 있도록 변환 컴포넌트 (또는 순화 된 구성 요소)을 포함 하는 세포 추출의 존재 그것을 품 어 관심, RNA 녹음 특정 뇌관는 RNA 안정적인 RNA 리보솜 단지 반전 녹음 방송에 리보솜의 소위 'toeprint'5,,67의 3' 가장자리에 발생 합니다.
이 프로토콜, ribosomal 소 단위, eIFs, tRNAs, 및 IRES 트랜스-행동 요인 (ITAFs)는 편리 하 게 토끼 reticulocyte lysate (RRL)에 의해 기여. 이 프로토콜의 또 다른 장점은 붙일 표시 된 뇌관 및 형광 젤 기반 영상, 보다는 오히려 방사선된 뇌관의 사용 이다. 이 등 radiolabeling 뇌관로 젤을 건조 강화 화면에 노출 하는 추가 단계를 제거 합니다. 형광 밴드는 큰 해상도 대 한 허용 젤 실행으로 실시간으로 기록 됩니다. 비록 출장된 mRNAs 또한이 기술을8에 의해 분석 될 수 있다 apoptosis 단백질 (XIAP) IRES RNA의 세척제 X 연결 억제제 여기, 예를 들어 사용 됩니다.
세포 lysates의 번역 과정의 최종 출력을 측정, 서쪽 분석, 달리 toeprinting은 번역 개시는 RNA에 복잡 한 대형을 측정 하기 위해 생체 외에서 접근 이다. 이 reductionist 접근 기판 또는 번역 개시 통제 요인의 매우 상세한 연구에 대 한 수 있습니다 (예., 출장 또는 취소 출장 mRNA, IRES 구조, 존재 또는 부재 특정 단백질 요인의, 폴 리 A 꼬리의 등)입니다. 따라서, toeprinting 번역8 다른 모드 또는 mRNA, 같은 구조 IRESes, 단백질 합성9,10의 효과 연구에 사용할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1045px;" width="1043">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:405px;">DEPC (Diethyl pyrocarbonate)</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:191px;">D5758-100ML</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TRIS base, Ultrapure</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>4109-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KOAc (Potassium acetate)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>PB0438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mg(OAc)2 (Magnesium acetate tetrahydrate)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>MB0326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sucrose, molecular biology grade</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>573113-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spermidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>85558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GMP-PNP (Guanosine 5&#8242;-[&#946;,&#947;-imido]triphosphate trisodium salt hydrate) 0.1 M solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G0635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ATP (Adenosine 5&#8242;-triphosphate) disodium salt, 100 mM solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">19:1 Acrylamide:bis-acrylamide, 40%</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>A0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Urea</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>UB0148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">500mL bottle top filtration units, 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1823.101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Formamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9037-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EDTA (disodium salt, dihydrate)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>EB0185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SDS</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>SB0485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bromophenol blue</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>BDB0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Xylene cyanol FF</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>XB0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MEGAshortscript T7 transcription kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">mMESSAGE mMACHINE T7 transcription kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Acid Phenol:Chloroform (5:1)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:405px;">25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:191px;">15593-049</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL). Should NOT be nuclease-treated.</td>
			<td>Green Hectares, USA</td>
			<td></td>
			<td>Contact Green Hectares, ask for 1:1 RRL:water</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RiboLock RNase Inhibitor (40 U/&#181;L)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>E00382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 mM dNTPs</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56172, 56173, 56174, 56175</td>
			<td>Mix equal parts for a stock of 25 mM each.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AMV-RT, 10 U/&#181;L</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M5101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>707701KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Model 4200 IR2 DNA analyzer</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td></td>
			<td>Product has been discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">APS (Ammonium Persulfate)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>AB0072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TEMED</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>TB0508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Phusion High Fidelity Polymerase</td>
			<td style="width:159px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:191px;">M0530</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Turbo Dnase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toeprinting analysis of translation initiation complex formation on mammalian mrnas

번역 개시 단백질 합성의 속도 제한 단계 이며, 세포 단백질 출력을 조절 하는 핵심을 나타냅니다. 단백질 합성의 세포질 긴장 응답, 열쇠 이며 dysregulation 암 등 많은 질병 상태에 중앙 이다. 예를 들어, 세포 스트레스 글로벌 번역의 억제를 약하게 모자 종속 개시 리드, 비록 특정 스트레스 응답 단백질에 모자 독립적인 방식으로 선택적으로 변환 됩니다. 신중한 RNA 규제 등의 요소, 세포 내부 리보솜 입장 위치 (IRESes),이 특정 한 mRNAs의 번역에 대 한 수 있습니다. 이러한 mRNAs의 식별 및 그들의 규제 메커니즘의 특성 분자 생물학에는 핵심 영역 되었습니다. Toeprinting 번역 개시에 관련 된 RNA 구조와 기능 연구에 대 한 방법입니다. Toeprinting의 목표는 생체 외에서 의 능력을 평가 하는 시퀀스, 구조 요소 또는 액세서리 요인 리보솜에 참여를 결정 하기 위해 다양 한 조건에서 리보솜과 안정 되어 있는 복합물을 형성 하는 RNA 베 껴 바인딩-효율적인 번역 개시에 대 한 사전 커서. 서쪽 분석 및 polysome 프로 파일링와 같은 다른 기술 함께 toeprinting 번역 개시의 규칙에 대 한 메커니즘의 강력한 특성에 대 한 수 있습니다.

우리는 이전 모자 독립적인 번역 개시 생체 외에서8,10을 지원 하기 위해 XIAP IRES의 능력을 설명 했습니다. Toeprinting 복잡 한 XIAP IRES 개시의 기계적 세부가 핵심 기술 했다. 인코딩 XIAP IRES (그림 1A)를 포함 하는 mRNA는 DNA 구조에 생체 외에서 복사할 및 toeprinting 분석을 받게 했다. 여?...

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Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

번역 개시 포유류 mRNAs에 복잡 한 대형의 Toeprinting 분석

Toeprinting 목표 체 외에서 의 능력을 측정 하는 다양 한 조건에서 리보솜과 양식 번역 개시 복합물에 RNA를 복사할 수 있습니다. 이 프로토콜 toeprinting 포유류 RNA에 대 한 메서드를 설명 하 고 모자-종속 및 IRES 기반 번역 공부 하는 데 사용할 수 있습니다.

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

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연구

생화학

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Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

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Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

200KV 투과 전자 현미경을 사용한 고해상도 cryo-EM 데이터 세트의 일상적인 수집

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

Characterization of Ternary Complex Formation in PROTACs Using Biophysical Assays

The Development and Application of Biophysical Assays for Evaluating Ternary Complex Formation Induced by Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACS)

Evaluating Biophysical Assays for Characterizing PROTACS Ternary Complexes (Video) | JoVE

단백질 분해 표적 키메라(PROTACS)에 의해 유도된 삼원 복합체 형성을 평가하기 위한 생물물리학 분석법의 개발 및 적용

E3 ligases and proteins targeted for degradation can be induced to form complexes by heterobifunctional molecules in a multi-step process. The kinetics ...