Name: toeprinting analysis of translation initiation complex formation on mammalian mrnas
Uploaded: 2018-05-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs at JoVE.com

Este trabalho foi financiado por um ciências naturais e engenharia Conselho de Canadá-Discovery bolsa de investigação (05463-RGPIN-2017), a Fundação de Canadá para inovação-John R. Evans líderes fundo (35017), o programa inova do Campus Alberta e Ministério de Alberta Comércio e desenvolvimento econômico.

Nota: O RNA é altamente suscetível à degradação por ribonucleases (RNases). Tome precauções padrão para manter o RNA intacto. Luvas mudam com frequência. Utilize pontas de pipetas filtrada, plasticware nuclease-free e livre de nuclease produtos químicos em todas as etapas do protocolo. Utilização livre de nuclease ou pyrocarbonate de dietilo (DEPC)-tratamento de água para todas as soluções.
1. preparação de soluções
<ol><li>Preparar o tampão de Toeprinting: 20 mM Tris-HCl...

<ol>
	<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+stress+and+apoptosis.">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li><li>Lacerda, R., Menezes, J., Romao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+just+scanning:+the+importance+of+cap-independent+mRNA+translation+initiation+for+cellular+stress+response+and+cancer.">More than just scanning: the importance of cap-independent mRNA translation initiation for cellular stress response and cancer.</a> Cell Mol Life Sci. 74 (9), 1659-1680 (2017).</li><li>Sharma, D. K., Bressler, K., Patel, H., Balasingam, N., Thakor, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Eukaryotic+Initiation+Factors+during+Cellular+Stress+and+Cancer+Progression.">Role of Eukaryotic Initiation Factors during Cellular Stress and Cancer Progression.</a> J Nucleic Acids. 2016, 8235121 (2016).</li><li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+translational+control.">Molecular mechanisms of translational control.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (10), 827-835 (2004).</li><li>Anthony, D. D., Merrick, W. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+IRES-mediated+translation+of+the+c-myc+and+BiP+mRNAs+by+the+poly(A)+tail+is+independent+of+intact+eIF4G+and+PABP.">Enhancement of IRES-mediated translation of the c-myc and BiP mRNAs by the poly(A) tail is independent of intact eIF4G and PABP.</a> Mol Cell. 15 (6), 925-935 (2004).</li><li>Baird, S. D., Lewis, S. M., Turcotte, M., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+search+for+structurally+similar+cellular+internal+ribosome+entry+sites.">A search for structurally similar cellular internal ribosome entry sites.</a> Nucleic Acids Res. 35 (14), 4664-4677 (2007).</li><li>Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+a+single+GTP+is+used+in+the+formation+of+80+S+initiation+complexes.">Evidence that a single GTP is used in the formation of 80 S initiation complexes.</a> J Biol Chem. 254 (10), 3708-3711 (1979).</li><li>Arnaud, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+34-Kilodalton+Isoform+of+Human+Fibroblast+Growth+Factor+2+Is+Cap+Dependently+Synthesized+by+Using+a+Non-AUG+Start+Codon+and+Behaves+as+a+Survival+Factor.">A New 34-Kilodalton Isoform of Human Fibroblast Growth Factor 2 Is Cap Dependently Synthesized by Using a Non-AUG Start Codon and Behaves as a Survival Factor.</a> Mol Cell Biol. 19 (1), 505-514 (1999).</li><li>Dmitriev, S. E., Pisarev, A. V., Rubtsova, M. P., Dunaevsky, Y. E., Shatsky, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+48S+translation+preinitiation+complexes+into+80S+initiation+complexes+as+revealed+by+toeprinting.">Conversion of 48S translation preinitiation complexes into 80S initiation complexes as revealed by toeprinting.</a> FEBS Lett. 533 (1-3), 99-104 (2003).</li><li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+selective+mRNA+translation+in+mammalian+cells+by+polysome+profiling.">Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling.</a> J Vis Exp. (92), e52295 (2014).</li><li>Duncan, C. D. S., Mata, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cycloheximide+on+the+interpretation+of+ribosome+profiling+experiments+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Effects of cycloheximide on the interpretation of ribosome profiling experiments in Schizosaccharomyces pombe.</a> Sci Rep. 7 (1), 10331 (2017).</li><li>Beck, H. J., Janssen, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Translation+Initiation+Regulation+Mechanism+in+Escherichia+coli+ptrB+Mediated+by+a+5'-Terminal+AUG.">Novel Translation Initiation Regulation Mechanism in Escherichia coli ptrB Mediated by a 5'-Terminal AUG.</a> J Bacteriol. 199 (14), (2017).</li></ol>

Toeprinting é uma técnica poderosa para medir diretamente a capacidade de um RNA de interesse para apoiar a formação de complexos de iniciação da tradução em circunstâncias altamente controlados. Este protocolo descreve uma técnica simplificada para toeprinting mamíferos RNAs. Reticulócito coelho lisado (RRL) é usado como uma fonte conveniente de ribossomos, eIFs, iniciador tRNA e IRES trans-agindo fatores (ITAFs). O experimentador fornece seu RNA de escolha e também pode complementar a reação de...

Como tradução consome energia mais celular, faz sentido que a tradução é fortemente regulamentado1. Por outro lado, a desregulação da tradução- e as consequentes alterações na saída de proteína-é frequentemente observada nos Estados-resposta ao estresse e doenças, como câncer,1,2. Uma grande vantagem do controle de translação é a velocidade com que as células podem alterar sua saída de proteína para responder a vários estímulos3. Regulamento de tradução, portanto, representa um importante mecanismo que pode influenciar a sobrevivência da pilha e morte1,2,3. As etapas da tradução, a iniciação é o mais altamente regulamentado e complexo3. Brevemente, mais eucarióticos mRNAs contêm uma 5' m7G tampa que quase sempre é essencial para a sua tradução. Cap-dependente iniciação requer iniciação eucariótico fatores eIF4E, eIF4A e eIF4G (o complexo cap-reconhecimento) para interagir com a extremidade 5' do mRNA. 43S preinitiation ribosome complexo, que contém o limite eIF2 iniciador tRNA e eIF3, é recrutado à extremidade 5' do mRNA através de uma interação de eIF4G com eIF3. A complexo de pré-iniciação é pensada para fazer a varredura do mRNA, auxiliado por eIF4A (um RNA helicase) até que o códon de início (AUG) está localizado. A complexo de iniciação 48S posteriormente é formada e tRNA é entregue para o P-site do ribosome. Finalmente, as subunidades 60S e 40S do Ribossoma são Unidas para formar o início dos anos 80 complexo, seguido de tradução alongamento1,3,4. Em contraste, sites de entrada interno Ribossoma (IRESes) contornar a exigência de uma 5' cap, recrutando a subunidade ribossomal 40S diretamente para o codão de iniciação3. Condições de estresse fisiológico atenuam global tradução de mRNA devido a modificações dos fatores chave geral iniciação eucariótico (eIFs). No entanto, mecanismos de iniciação da tradução não-canônicos permitam tradução seletiva de certos mRNAs que muitas vezes codificam proteínas de estresse-resposta, e desregulação da iniciação da tradução não-canônicos está implicada em doenças como o câncer 1 , 2. elementos reguladores de RNA discreto, tais como IRESes celular, permitam a tradução de tais mRNAs2,3.
Um aspecto particularmente interessante de controle de translação é compreender os mecanismos da canonical versus não-canônicos tradução de um mRNA determinado. Toeprinting é uma técnica que permite o estudo detalhado e mecanicista de iniciação da tradução de RNAs específicos in vitro. O objectivo geral de toeprinting é para avaliar a capacidade de um RNA de interesse de nucleada a formação de um início de tradução complexa com o ribossoma sob uma variedade de condições, a fim de determinar quais sequências, elementos estruturais ou acessório fatores são necessários para a iniciação da tradução eficiente. Por exemplo, recrutamento de Ribossoma pode ser prejudicado na ausência de um cap 5' mas estimulado pela presença de um IRES.
O princípio da técnica é in vitro transcrever um RNA de interesse, incube-lo na presença de extratos celulares contendo componentes de tradução (ou os componentes purificados) para permitir que transcrevem complexos de iniciação ao formulário e para reverter o RNA com um primer específico. Complexos estáveis de RNA-Ribossoma causará a transcrição reversa de empatar na extremidade 3' do Ribossoma, o so-called 'toeprint'5,6,7.
No presente protocolo, subunidades ribossomais, eIFs, os tRNAs e IRES trans-fatores de atuação (ITAFs) são convenientemente contribuídos por Reticulócito coelho lisado (RRL). Outra vantagem deste protocolo é o uso de um primer fluorescente-etiquetadas e Imageador de fluorescência com base em gel, ao invés de um primer radiolabeled. Isso elimina etapas extras, incluindo radioativos o primer, bem como a secagem do gel e expô-lo a uma intensificação da tela. As bandas fluorescentes são registadas em tempo real, como a execução de gel, permitindo a maior resolução. Destampada ligada ao X inibidor da apoptose RNA de IRES de proteína (XIAP) é usado como exemplo aqui, apesar de mRNAs tampados também podem ser analisados por esta técnica8.
Ao contrário da análise ocidental, que mede a saída final do processo de tradução em lisados celulares, toeprinting é uma abordagem in vitro para medir a formação do complexo tradução iniciação em um RNA. Esta abordagem reducionista permite o estudo altamente detalhado de substratos ou fatores que regulam a iniciação da tradução (EG., tampadas ou un-tampado mRNA, IRES estrutura, presença ou ausência de cauda poli-A, disposição de fatores específicos da proteína, etc.). Daí, toeprinting pode ser usado para estudar os diferentes modos de tradução8 ou os efeitos das estruturas de mRNA, tais como IRESes, na síntese de proteína9,10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1045px;" width="1043">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:405px;">DEPC (Diethyl pyrocarbonate)</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:191px;">D5758-100ML</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TRIS base, Ultrapure</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>4109-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KOAc (Potassium acetate)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>PB0438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mg(OAc)2 (Magnesium acetate tetrahydrate)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>MB0326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sucrose, molecular biology grade</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>573113-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spermidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>85558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GMP-PNP (Guanosine 5&#8242;-[&#946;,&#947;-imido]triphosphate trisodium salt hydrate) 0.1 M solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G0635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ATP (Adenosine 5&#8242;-triphosphate) disodium salt, 100 mM solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">19:1 Acrylamide:bis-acrylamide, 40%</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>A0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Urea</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>UB0148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">500mL bottle top filtration units, 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1823.101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Formamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9037-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EDTA (disodium salt, dihydrate)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>EB0185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SDS</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>SB0485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bromophenol blue</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>BDB0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Xylene cyanol FF</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>XB0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MEGAshortscript T7 transcription kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">mMESSAGE mMACHINE T7 transcription kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Acid Phenol:Chloroform (5:1)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:405px;">25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:191px;">15593-049</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL). Should NOT be nuclease-treated.</td>
			<td>Green Hectares, USA</td>
			<td></td>
			<td>Contact Green Hectares, ask for 1:1 RRL:water</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RiboLock RNase Inhibitor (40 U/&#181;L)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>E00382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 mM dNTPs</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56172, 56173, 56174, 56175</td>
			<td>Mix equal parts for a stock of 25 mM each.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AMV-RT, 10 U/&#181;L</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M5101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>707701KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Model 4200 IR2 DNA analyzer</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td></td>
			<td>Product has been discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">APS (Ammonium Persulfate)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>AB0072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TEMED</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>TB0508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Phusion High Fidelity Polymerase</td>
			<td style="width:159px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:191px;">M0530</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Turbo Dnase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toeprinting analysis of translation initiation complex formation on mammalian mrnas

Iniciação da tradução é a etapa limitante da síntese de proteínas e representa um ponto-chave na qual células regulam a produção de proteína. Regulação da síntese de proteínas é a chave para a resposta de estresse celular e desregulação é central para muitos Estados de doença, como o câncer. Por exemplo, embora o estresse celular leva para a inibição da tradução global pela atenuante cap-dependente iniciação, certas proteínas de estresse-resposta seletivamente são traduzidas em uma forma independente de cap. Discreto do RNA dos elementos reguladores, tais como sites de entrada celular Ribossoma interno (IRESes), permitem a tradução destes mRNAs específicos. Identificação de tais mRNAs e a caracterização dos seus mecanismos reguladores, tem sido uma área-chave em biologia molecular. Toeprinting é um método para o estudo da estrutura do RNA e função no que tange a iniciação da tradução. O objetivo do toeprinting é avaliar a capacidade do in vitro transcrito de RNA para formar complexos estáveis com ribossomas sob uma variedade de condições, a fim de determinar quais sequências, elementos estruturais ou acessórios fatores estão envolvidos no Ribossoma ligação — um pré-cursor para a iniciação da tradução eficiente. Ao lado de outras técnicas, tais como análise ocidental e polysome de perfil, toeprinting permite uma caracterização robusta de mecanismos para a regulação da iniciação da tradução.

Descrevemos anteriormente a capacidade da IRES XIAP para apoiar a iniciação de tradução tampão-independente em vitro8,10. Toeprinting foi a chave técnica para interrogar os detalhes mecanicistas da iniciação XIAP IRES complexo. Uma construção de DNA codificação um mRNA contendo o XIAP IRES (Figura 1A) estava em vitro transcritas e submetidas a análise de...

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Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Análise de Toeprinting de formação do complexo iniciação tradução de mRNAs mamíferos

Toeprinting visa medir a capacidade de in vitro transcrito de RNA para formar complexos de iniciação de tradução com ribossomas sob uma variedade de condições. Este protocolo descreve um método para mamíferos RNA toeprinting e pode ser usado para estudar a tradução tanto cap-dependente e IRES-driven.

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Research

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