Name: toeprinting analysis of translation initiation complex formation on mammalian mrnas
Uploaded: 2018-05-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs at JoVE.com

Este trabajo fue financiado por una Ciencias naturales e Ingeniería investigación Consejo de Canadá-Discovery Grant (RGPIN-2017-05463), la Fundación de Canadá para la innovación-John R. Evans líderes fondo (35017), el programa de Innova Campus Alberta y Alberta Ministerio de Desarrollo económico y comercio.

Nota: El ARN es altamente susceptible a la degradación por ribonucleasas (RNasas). Tomar las precauciones normales para mantener intacto el ARN. Cambiar guantes con frecuencia. Usar filtrado pipetas, recipientes de plástico libre de nucleasas y productos químicos libre de nucleasas en todas las etapas del protocolo. Uso libre de nucleasas o dietil pirocarbonato (DEPC)-tratamiento de agua para todas las soluciones.
1. preparación de soluciones
<ol><li>Preparación de buffer de Toeprinting...

<ol>
	<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+stress+and+apoptosis.">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li><li>Lacerda, R., Menezes, J., Romao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+just+scanning:+the+importance+of+cap-independent+mRNA+translation+initiation+for+cellular+stress+response+and+cancer.">More than just scanning: the importance of cap-independent mRNA translation initiation for cellular stress response and cancer.</a> Cell Mol Life Sci. 74 (9), 1659-1680 (2017).</li><li>Sharma, D. K., Bressler, K., Patel, H., Balasingam, N., Thakor, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Eukaryotic+Initiation+Factors+during+Cellular+Stress+and+Cancer+Progression.">Role of Eukaryotic Initiation Factors during Cellular Stress and Cancer Progression.</a> J Nucleic Acids. 2016, 8235121 (2016).</li><li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+translational+control.">Molecular mechanisms of translational control.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (10), 827-835 (2004).</li><li>Anthony, D. D., Merrick, W. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+IRES-mediated+translation+of+the+c-myc+and+BiP+mRNAs+by+the+poly(A)+tail+is+independent+of+intact+eIF4G+and+PABP.">Enhancement of IRES-mediated translation of the c-myc and BiP mRNAs by the poly(A) tail is independent of intact eIF4G and PABP.</a> Mol Cell. 15 (6), 925-935 (2004).</li><li>Baird, S. D., Lewis, S. M., Turcotte, M., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+search+for+structurally+similar+cellular+internal+ribosome+entry+sites.">A search for structurally similar cellular internal ribosome entry sites.</a> Nucleic Acids Res. 35 (14), 4664-4677 (2007).</li><li>Merrick, W. 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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+48S+translation+preinitiation+complexes+into+80S+initiation+complexes+as+revealed+by+toeprinting.">Conversion of 48S translation preinitiation complexes into 80S initiation complexes as revealed by toeprinting.</a> FEBS Lett. 533 (1-3), 99-104 (2003).</li><li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+selective+mRNA+translation+in+mammalian+cells+by+polysome+profiling.">Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling.</a> J Vis Exp. (92), e52295 (2014).</li><li>Duncan, C. D. S., Mata, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cycloheximide+on+the+interpretation+of+ribosome+profiling+experiments+in+Schizosaccharomyces+pombe.">Effects of cycloheximide on the interpretation of ribosome profiling experiments in Schizosaccharomyces pombe.</a> Sci Rep. 7 (1), 10331 (2017).</li><li>Beck, H. J., Janssen, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Translation+Initiation+Regulation+Mechanism+in+Escherichia+coli+ptrB+Mediated+by+a+5'-Terminal+AUG.">Novel Translation Initiation Regulation Mechanism in Escherichia coli ptrB Mediated by a 5'-Terminal AUG.</a> J Bacteriol. 199 (14), (2017).</li></ol>

Toeprinting es una técnica poderosa para medir directamente la capacidad de un RNA de interés para apoyar la formación de complejos de iniciación de traducción bajo circunstancias muy controladas. Este protocolo describe una técnica simplificada para toeprinting RNAs mamíferos. Lisado de reticulocitos de conejo (RRL) se utilizaban como una fuente conveniente de los ribosomas, eIFs, iniciador ARNt y IRES trans-actuando factores (ITAFs). El experimentador proporciona su RNA de elección y también puede com...

Como traducción consume energía celular más, es lógico que la traducción es bien regulada1. Por el contrario, la desregulación de la traducción- y las consiguientes alteraciones en la producción de proteína-se observa a menudo en Estados de la respuesta de estrés y enfermedad, como cáncer1,2. Una ventaja importante de control traduccional es la velocidad con que las células pueden alterar su producción de proteína para responder a diferentes estímulos3. Regulación de la traducción representa así un mecanismo importante que puede influir en la supervivencia celular y la muerte1,2,3. De los pasos de la traducción, la iniciación es la más altamente regulado y complejo3. Brevemente, más eukaryotic mRNAs contiene una 5' m7G tapa que casi siempre es esencial para su traducción. Dependiente de la tapa de iniciación requiere eIF4A y eucariótico de iniciación factores eIF4E y eIF4G (el complejo cap-reconocimiento) para interactuar con el extremo 5' del mRNA. 43S preinitiation ribosome complejo, que contiene eIF2-limite iniciador ARNt y eIF3, es reclutado para el extremo 5' de los ARNm a través de una interacción de eIF4G con eIF3. El complejo de preiniciación está pensado para escanear mRNA, ayudados por eIF4A (una RNA helicasa) hasta que encuentra el codón de inicio (AUG). Posteriormente se forma el complejo de iniciación 48S y tRNA se entrega en el sitio P del ribosoma. Finalmente, las subunidades 60S y 40S del ribosoma se unen para formar el inicio de los años 80 complejo, seguido por la traducción elongación1,3,4. En cambio, sitios de entrada interna del ribosoma (IRESes) eludir el requisito para un casquillo de 5' mediante la contratación de la subunidad ribosómica 40S directamente a la del codón de iniciación3. Condiciones de estrés fisiológico atenúan mundial traducción del mRNA debido a las modificaciones de los factores clave general eucariótico de iniciación (eIFs). Sin embargo, mecanismos de iniciación de traducción no-canónico permiten traducción selectiva de ciertos mRNAs que codifican a menudo proteínas de respuesta al estrés, y la desregulación de la iniciación de la traducción no-canónico está implicada en Estados de enfermedades como el cáncer 1 , 2. elementos reguladores RNA discreto, como IRESes celular, permiten la traducción de estos mRNAs2,3.
Un aspecto particularmente interesante de control traduccional es entender los mecanismos de la canónica versus no-canónico traducción de un ARNm determinado. Toeprinting es una técnica que permite el estudio detallado de mecanicista de la iniciación de la traducción de ARN específica in vitro. El objetivo de toeprinting es evaluar la capacidad de un RNA de interés nuclear la formación de una iniciación de la traducción con el ribosoma en una variedad de condiciones, para determinar que secuencias de elementos estructurales y accesorios factores son necesarios para la iniciación de la traducción eficaz. Por ejemplo, contratación de ribosoma puede obstaculizado en la ausencia de una 5' cap pero estimulado por la presencia de un IRES.
El principio de la técnica es en vitro transcribe un RNA de interés, incubar en presencia de extractos celulares que contienen componentes de traducción (o los componentes purificados) permitan transcriben de complejos de iniciación para formar y para invertir el ARN con una imprimación específica. Complejos estables de RNA ribosoma hará transcripción reversa a estancar en el 3' borde del ribosoma, el supuesto 'toeprint'5,6,7.
En este protocolo, subunidades ribosomales, eIFs, tRNAs y IRES trans-acción (ITAFs) están convenientemente contribuyeron por lisado de reticulocitos de conejo (RRL). Otra ventaja de este protocolo es el uso de una cartilla marcada con fluorescencia y reproductor de imágenes de fluorescencia basada en gel, en lugar de una cartilla radiactiva. Esto elimina pasos adicionales, incluyendo radiolabeling la cartilla, así como el gel de secado y exponerlo a una pantalla de intensificación. Las bandas fluorescentes se registran en tiempo real, como el gel, lo que permite una mayor resolución. Esté sin X-ligado inhibidor de apoptosis (XIAP) la proteína IRES ARN se usa como un ejemplo aquí, aunque tapado mRNAs también puede ser analizada por esta técnica8.
A diferencia de los análisis de western, que mide el resultado final del proceso de traducción en los lysates de la célula, toeprinting es un enfoque en vitro para medir la formación de complejos de iniciación traducción en un RNA. Este enfoque reduccionista permite el estudio muy detallado de sustratos o factores que regulan la iniciación de la traducción (ej., con o sin tapón mRNA, IRES estructura, presencia o ausencia de cola poly-A, disposición de los factores de la proteína específica, etcetera). Por lo tanto, toeprinting puede utilizarse para estudiar los diferentes modos de traducción8 o los efectos de estructuras de mRNA como IRESes, en síntesis de proteínas9,10.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1045px;" width="1043">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:405px;">DEPC (Diethyl pyrocarbonate)</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:191px;">D5758-100ML</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TRIS base, Ultrapure</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>4109-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KOAc (Potassium acetate)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>PB0438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mg(OAc)2 (Magnesium acetate tetrahydrate)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>MB0326</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sucrose, molecular biology grade</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>573113-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Spermidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>85558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">GMP-PNP (Guanosine 5&#8242;-[&#946;,&#947;-imido]triphosphate trisodium salt hydrate) 0.1 M solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G0635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">ATP (Adenosine 5&#8242;-triphosphate) disodium salt, 100 mM solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">19:1 Acrylamide:bis-acrylamide, 40%</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>A0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Urea</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>UB0148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">500mL bottle top filtration units, 0.2 &#181;m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1823.101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Formamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9037-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">EDTA (disodium salt, dihydrate)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>EB0185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">SDS</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>SB0485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bromophenol blue</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>BDB0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Xylene cyanol FF</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>XB0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MEGAshortscript T7 transcription kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">mMESSAGE mMACHINE T7 transcription kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Acid Phenol:Chloroform (5:1)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:405px;">25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:191px;">15593-049</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL). Should NOT be nuclease-treated.</td>
			<td>Green Hectares, USA</td>
			<td></td>
			<td>Contact Green Hectares, ask for 1:1 RRL:water</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RiboLock RNase Inhibitor (40 U/&#181;L)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>E00382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 mM dNTPs</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>56172, 56173, 56174, 56175</td>
			<td>Mix equal parts for a stock of 25 mM each.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AMV-RT, 10 U/&#181;L</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M5101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>707701KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Model 4200 IR2 DNA analyzer</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td></td>
			<td>Product has been discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">APS (Ammonium Persulfate)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>AB0072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TEMED</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>TB0508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:405px;">Phusion High Fidelity Polymerase</td>
			<td style="width:159px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:191px;">M0530</td>
			<td style="width:291px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Turbo Dnase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toeprinting analysis of translation initiation complex formation on mammalian mrnas

Iniciación de la traducción es el paso tarifa-limitador de la síntesis de proteínas y representa un punto clave en el cual las células regulan su producción de proteínas. Regulación de la síntesis de proteínas es la clave para la respuesta de estrés celular, y la desregulación es central a muchos Estados de enfermedad, como el cáncer. Por ejemplo, aunque estrés celular conduce a la inhibición de la traducción global de atenuación dependiente de la tapa de iniciación, ciertas proteínas de respuesta al estrés se convierten selectivamente en forma independiente de la tapa. Elementos reguladores discretos de RNA, como sitios de entrada interna del ribosoma celular (IRESes), permiten la traducción de los mRNAs específicos. Identificación de estos mRNAs y la caracterización de sus mecanismos, han sido una zona clave en biología molecular. Toeprinting es un método para el estudio de RNA estructura y función lo que respecta a la iniciación de la traducción. El objetivo de toeprinting es evaluar la capacidad de in vitro transcrito RNA para formar complejos estables con los ribosomas en una variedad de condiciones, para determinar que secuencias, elementos estructurales o factores accesorios participan en ribosoma vinculante, un pre-cursor de iniciación de traducción eficiente. Junto con otras técnicas, como análisis occidental y polysome perfilado, toeprinting permite una sólida caracterización de mecanismos para la regulación de la iniciación de la traducción.

Anteriormente hemos descrito la capacidad de los IRES XIAP para apoyar la iniciación de la traducción de la casquillo-independiente en vitro8,10. Toeprinting fue la técnica clave para interrogar los detalles mecanicistas de la iniciación de XIAP IRES complejo. Una construcción de ADN codifican un ARNm que contiene el IRES XIAP (figura 1A) fue en vitro transcrita...

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Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Toeprinting análisis de formación de complejos de iniciación traducción de mRNAs mamíferos

Toeprinting tiene como objetivo medir la capacidad de in vitro transcrito RNA para formar complejos de iniciación de traducción con los ribosomas en una variedad de condiciones. Este protocolo describe un método para RNA mamíferos toeprinting y puede utilizarse para estudiar traducción dependiente de la tapa y IRES-conducido.

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

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