Name: evaluating vascular hyperpermeability-inducing agents in the skin with the miles assay
Uploaded: 2018-06-19T13:30:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay at JoVE.com

Vi takke Laura Denti, Valentina Senatore og ansatte i den biologiske ressourcer enhed ved UCL Institute of Ophthalmology for hjælpe med musen dyrehold og Camille Charoy for teknisk support. Dette arbejde blev støttet af en Medical Research Council grant (hr./N011511/1) til C. Ruhrberg og en British Heart Foundation PhD studentship til J.T. fræk (FS/13/59/30649).

Alle dyr arbejde blev udført efter britiske Home Office og institutionelle retningslinjer for dyrevelfærd og etiske gennemgang kroppen (AWERB).
1. Mouse forberedelse
Bemærk: Udføre eksperimenter på voksne mus på mindst 8 uger gamle, op til 6 måneder. For at vise tekniske reproducerbarhed og konsekvent timing for hvert trin i denne procedure mellem forskellige dyr, skal du bruge mindst 2 og højst 6 mus for hvert eksperimentelle session. For at vurdere effekten af en mutation på en permeabilitet-fremkaldende stof i genmodificerede mus, ideelt set, bruge 2 mutant mus og 2 littermate kontrol pr. eksperimenter.
<ol><li>24 timer før stimulerende kar hyperpermeability, bedøver mus ved hjælp af en egnet indånding bedøvelsesmiddel som isofluran. Bruge 3% isofluran til anæstesi induktion, indtil den oprettende refleks er tabt og musen ikke reagerer på eksterne stimuli. Bruge 1,5% isofluran til anæstesi vedligeholdelse (sikre at musen har konstant respiratorisk satser). Under anæstesi, omhyggeligt barbere begge flanker af hver mus med en elektrisk shaver, at undgå skader på huden. Bemærk: Anæstesi anvendes ikke kan fremkalde stress for dyr og for at minimere bevægelse under barbering, hvilket kan medføre hudskader.</li>
	<li>Returnere glatbarberet musen til sit hjem bur. For mandlige mus, placere hver mand i en individuel bur efter anæstesi opsving til at forhindre kæmper og, derfor, beskadige huden. For kvindelige mus, skal du returnere dem i en gruppe til deres hjem bur. Bemærk: Hvis en kæmper adfærd er observeret blandt mandlige mus i bur, før proceduren, adskille dem i individuelle bure til 3 dage før forsøget at give potentielle skader i huden til at helbrede.</li>
	<li>Overvåge mus, indtil de inddrive bevidsthed (normalt inden for et par sekunder) og flytte rundt på buret (normalt inden for 1 min).</li>
</ol>2. intravenøs injektion af Evans blå farvestof
<ol><li>I en laminar flow kabinet, forberede separate sterile løsninger af histamin hæmmer pyrilamine maleat (4 µg/µL i 0,9% saltvand) og Evans blå farvestof (1% w/v i 0,9% saltvand). Sterilisere ved at passere løsningerne gennem en 22 µm filter.</li>
	<li>Bruge en steril 1 mL sprøjte med 30 G nål til intraperitoneal indsprøjtes hver mus med 10 µL pyrilamine maleat løsning/gram kropsvægt (figur 1A). At udføre injektion, første, Harmoniske musen og derefter vippe det således, at hovedet er rettet mod jorden og maven er rettet opad. Indsprøjtes i de nederste kvadranter af maven væk fra midterlinjen at undgå at ramme blæren. Bemærk: Vægten af mus mellem 8 uger og 6 måneders alder normalt svinger mellem 15 og 30 g. Pyrilamine maleat vil hæmme frigivelsen af endogene histamin, som ellers ville fremme vaskulær lækage uafhængigt af agent skal testes.</li>
	<li>Placere musen i et 37 ° C varme kammer i 10 min at fremme vasodilation. Alternativt, brug en egnet varmelampe fokuseret på halen for at fremme vasodilatation, hvis brugen af en varmelampe er tilladt af de lokale etiske retningslinjer.</li>
	<li>Flytte en mus på et tidspunkt til en mus Tilbageholderen og gnid hale med 70% ethanol til at rense området injektion og yderligere fremme vasodilation.</li>
	<li>Bruge en steril 1 mL sprøjte med 30G nål til at administrere 100 µL Evans blå farvestof intravenøst gennem halen vene (figur 1B). Straks lægge pres på injektionsstedet ved at holde halen mellem en finger og tommelfinger til at forhindre blødning. Bemærk: Visualisering af hale vene kan forbedres ved at dirigere lamplight til området injektion. Yderligere detaljer om at udføre intravenøse injektioner i mus hale vene kan findes i et offentliggjort protokol18.</li>
	<li>Tillad farvestof til at cirkulere i 30 min.</li>
</ol>3. stimulere vaskulær Hyperpermeability
<ol><li>Ved hjælp af steril løsninger i en laminar flow kabinet, fortyndes den permeabilitet-fremkaldende agent af interesse for en koncentration, der giver den endelige dosis leveres i et volumen på 20 µL. Bemærk: I eksempel forsøget vist i figur 1-figur 2, VEGFA bruges til at stimulere vaskulær hyperpermeability i en koncentration på 2,5 ng/µL i PBS, hvilket giver en total dosis på 50 ng og PBS bruges som et køretøj kontrol.</li>
	<li>Indlæse permeabilitet-fremkaldende agent for interesse og kontrolelementet køretøjets i 2 separate sterile 300 µL sprøjter med en nål for 31 G. Indlæse tilstrækkelig løsning at injicere hver mus med 20 µL af opløsningen i tre eksemplarer (dvs. forberede 60 µL af agent og køretøj pr. mus, plus ekstra volumen for at tage højde for den nål dødvolumen).</li>
	<li>Bedøver den første mus skal testes med isofluran (3% for anæstesi induktion indtil oprettende refleks er tabt og musen ikke reagerer på eksterne stimuli, og 1,5% for anæstesi vedligeholdelse, sørge for at musen har konstant respiratorisk satser).</li>
	<li>Indsprøjtes intradermalt 20 µL af fremme af permeabilitet agent ind i flanken på musen (figur 1 c). Sikre, at nålen er i en vinkel på 15° til huden. Check for dannelsen af en hævet boble i huden, hvilket indikerer en vellykket injektion. Gentag intradermal injektion på 2 ekstra websteder, en mindst 1 cm fra hinanden.</li>
	<li>Aktivere mus for at afsløre den 2nd flanke og Gentag tredobbelt injektioner med køretøjet styringsløsning. Optage på papir placeringen af hver injektion websted at lette deres identifikation for efterfølgende indsamling af hud prøver. Bemærk: Håndtere musen huden med forsigtighed på dette stadium; for eksempel undgå at klemme hud, når du udfører intradermale indsprøjtninger.</li>
	<li>Returnere den injicerede mus til sit hjem bur og overvåge musen, indtil det genopretter bevidsthed (normalt inden for et par sekunder) og bevæger sig rundt i buret.</li>
	<li>Mens den første mus bedres, straks gentage trin 3.3 og 3.5 med den anden mus, og så videre (op til 6 mus maksimalt per session). Registrere tid hver mus blev sprøjtet for at justere tiden til at gå videre til de efterfølgende trin.</li>
</ol>4. kvantificering af akkumulerede Evans blå i Dermis
<ol><li>Frasortering hver mus af cervikal dislokation 20 min, efter at den har modtaget de intradermale injektioner, observere den samme rækkefølge som musene blev injiceret. Bemærk: Varigheden af vaskulær lækage kan variere alt efter den permeabilitet-fremkaldende agent bruges, og derfor tiden mellem intradermal injektion og nedslagtning muligvis optimering.</li>
	<li>Sted hver aflivet mus på sin ryg og pin sine fødder på en kork bord omviklet med en ren væv (figur 1 d).</li>
	<li>Brug sløv saks, lave et lodret snit på ca 3-4 cm fra underlivet op til brystet af en død mus. Med pincet og en skalpel, tirre væk hud fra begge flanker at afsløre den indvendige side af dermis og websteder af Evans blå ophobning (figur 1E). PIN ned den løs hud og fjerne fedt fra regionerne omkring lækage site med en skalpel. Hvis det er nødvendigt, tage et repræsentativt billede at vise omfanget af Evans blå lækage ind i huden.</li>
	<li>Brug af pincet og en skalpel, punktafgifter hud regioner bestående af den rende Evans blå farvestof for hvert websted injiceret med permeabilitet-fremkaldende agent eller køretøj. Bemærk: Vær omhyggelig med at punktafgifter ligeledes mellemstore regioner i huden til at sørge for, at på de efterfølgende trin 4.7, vil være adsorberet en tilsvarende del af formamid volumen af hver hudprøve, tillader den udpakkede farvestof til fortyndes i et lignende antal resterende formamid . Injektion kortet registreres i trin 3.5 vil hjælpe med at definere område at blive skåret ud.</li>
	<li>Placer hver prøve i en 1,5 mL tube og mærket det i overensstemmelse hermed, og sørg for hver prøve hviler på bunden af røret. Gemme prøver på - 20 ° C indtil videre anvendelse. Hvis behandling straks, skal du følge nedenstående trin.</li>
	<li>Tør hud prøver natten over ved at placere åbent rør i en ovn eller i brønden af en varme blok ved 55 ° C.</li>
	<li>At udtrække Evans blå farvestof, tilføje 250 µL med deioniseret formamid til prøver i et stinkskab, lukke rør. Sørg for, at huden prøver er alle dækket af formamid og inkuberes natten over i en ovn eller en opvarmning blok ved 55 ° C.</li>
	<li>Centrifugeres prøver i en benchtop centrifuge med maksimal hastighed (> 10.000 x g) i 40 min.</li>
	<li>I et stinkskab, overføres 100 µL af dye-holdige supernatanten fra hver prøve til et særskilt godt af en gennemsigtig, flad bund 96-brønd plade (figur 2A).</li>
	<li>Foranstaltning peak Evans blå absorbans på 620 nm med en reference læsning af 740 nm på et spektrofotometer. Bemærk: 620 nm er peak af Evans blå absorbans, mens 740 nm absorberes ikke af Evans blå og fungerer som en reference bølgelængde.</li>
	<li>Gennemsnitlig absorbans aflæsninger af tredobbelt injektioner af samme agent eller køretøj for hver mus for at tage højde for tekniske variation (figur 2B).</li>
	<li>Beregne fold forskellen af aflæsninger fra permeabilitet-fremkaldende agent versus køretøj kontrol (figur 2 c).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nagy, J. A., Benjamin, L., Zeng, H. Y., Dvorak, A. M., Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability,+vascular+hyperpermeability+and+angiogenesis.">Vascular permeability, vascular hyperpermeability and angiogenesis.</a> Angiogenesis. 11, 109-119 (2008).</li><li>Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+blood-brain+barrier.">Development of the blood-brain barrier.</a> Cell and Tissue Research. 314, 119-129 (2003).</li><li>Ruhrberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+and+shaping+the+vascular+tree:+multiple+roles+for+VEGF.">Growing and shaping the vascular tree: multiple roles for VEGF.</a> Bioessays. 25, 1052-1060 (2003).</li><li>Risau, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Endothelium.">Differentiation of Endothelium.</a> FASEB Journal. 9, 926-933 (1995).</li><li>Strbian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier+is+continuously+open+for+several+weeks+following+transient+focal+cerebral+ischemia.">The blood-brain barrier is continuously open for several weeks following transient focal cerebral ischemia.</a> Neuroscience. 153, 175-181 (2008).</li><li>Weis, S. M., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiological+consequences+of+VEGF-induced+vascular+permeability.">Pathophysiological consequences of VEGF-induced vascular permeability.</a> Nature. 437, 497-504 (2005).</li><li>Campochiaro, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+of+retinal+and+choroidal+vascular+diseases.">Molecular pathogenesis of retinal and choroidal vascular diseases.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 49, 67-81 (2015).</li><li>Aman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+Treatment+of+Edema+and+Endothelial+Barrier+Dysfunction+with+Imatinib.">Effective Treatment of Edema and Endothelial Barrier Dysfunction with Imatinib.</a> Circulation. , 126 (2012).</li><li>Claesson-Welsh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability-the+essentials.">Vascular permeability-the essentials.</a> Upsala J Med Sci. 120, 135-143 (2015).</li><li>Schulte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+the+VE-cadherin-catenin+complex+blocks+leukocyte+extravasation+and+vascular+permeability.">Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability.</a> Embo Journal. 30, 4157-4170 (2011).</li><li>Heinolainen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR3+Modulates+Vascular+Permeability+by+Controlling+VEGF/VEGFR2+Signaling.">VEGFR3 Modulates Vascular Permeability by Controlling VEGF/VEGFR2 Signaling.</a> Circulation Research. 120, (2017).</li><li>Eliceiri, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+requirement+for+Src+kinases+during+VEGF-induced+angiogenesis+and+vascular+permeability.">Selective requirement for Src kinases during VEGF-induced angiogenesis and vascular permeability.</a> Molecular Cell. 4, 915-924 (1999).</li><li>Sun, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR2+induces+c-Src+signaling+and+vascular+permeability+in+vivo+via+the+adaptor+protein+TSAd.">VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd.</a> Journal of Experimental Medicine. 209, 1363-1377 (2012).</li><li>Fantin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF165-induced+vascular+permeability+requires+NRP1+for+ABL-mediated+SRC+family+kinase+activation.">VEGF165-induced vascular permeability requires NRP1 for ABL-mediated SRC family kinase activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 214, 1049-1064 (2017).</li><li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR2+pY949+signalling+regulates+adherens+junction+integrity+and+metastatic+spread.">VEGFR2 pY949 signalling regulates adherens junction integrity and metastatic spread.</a> Nat Commun. 7, (2016).</li><li>Senger, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cells+secrete+a+vascular+permeability+factor+that+promotes+accumulation+of+ascites+fluid.">Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid.</a> Science. 219, 983-985 (1983).</li><li>Miles, A. A., Miles, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Reactions+to+Histamine,+Histamine-Liberator+and+Leukotaxine+in+the+Skin+of+Guinea-Pigs.">Vascular Reactions to Histamine, Histamine-Liberator and Leukotaxine in the Skin of Guinea-Pigs.</a> J Physiol-London. 118, 228-257 (1952).</li><li>Radu, M., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+Assay+to+Test+Blood+Vessel+Permeability.">An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability.</a> Jove-J Vis Exp. , e50062 (2013).</li><li>Roth, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-1+mediates+vascular+permeability+independently+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptor-2+activation.">Neuropilin-1 mediates vascular permeability independently of vascular endothelial growth factor receptor-2 activation.</a> Sci Signal. 9, (2016).</li><li>Acevedo, L. M., Barillas, S., Weis, S. M., Gothert, J. R., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+3A+suppresses+VEGF-mediated+angiogenesis+yet+acts+as+a+vascular+permeability+factor.">Semaphorin 3A suppresses VEGF-mediated angiogenesis yet acts as a vascular permeability factor.</a> Blood. 111, 2674-2680 (2008).</li><li>Teesalu, T., Sugahara, K. N., Kotamraju, V. R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-end+rule+peptides+mediate+neuropilin-1-dependent+cell,+vascular,+and+tissue+penetration.">C-end rule peptides mediate neuropilin-1-dependent cell, vascular, and tissue penetration.</a> P Natl Acad Sci USA. 106, 16157-16162 (2009).</li><li>Ho, V. C., Duan, L. J., Cronin, C., Liang, B. T., Fong, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Receptor-2+Abundance+Contributes+to+Increased+Angiogenesis+in+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Receptor-1-Deficient+Mice.">Elevated Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Abundance Contributes to Increased Angiogenesis in Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1-Deficient Mice.</a> Circulation. 126, (2012).</li><li>Chislock, E. M., Pendergast, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abl+Family+Kinases+Regulate+Endothelial+Barrier+Function+In+Vitro+and+in+Mice.">Abl Family Kinases Regulate Endothelial Barrier Function In Vitro and in Mice.</a> PLoS ONE. 8, e85231 (2013).</li><li>Busch, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+ketamine+on+hypoxic+pulmonary+vasoconstriction+in+the+isolated+perfused+lungs+of+endotoxaemic+mice.">Effects of ketamine on hypoxic pulmonary vasoconstriction in the isolated perfused lungs of endotoxaemic mice.</a> Eur J Anaesth. 27, 61-66 (2010).</li><li>Sinclair, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+physiological+effects+of+alpha2-agonists+related+to+the+clinical+use+of+medetomidine+in+small+animal+practice.">A review of the physiological effects of alpha2-agonists related to the clinical use of medetomidine in small animal practice.</a> Can Vet J. 44, 885-897 (2003).</li></ol>

Forfatterne har ingen modstridende interesser at erklære.

Siden sin første beskrivelse i 195217har Miles analysen givet forskere med en forholdsvis hurtig, enkel og pålidelig metode til at studere de molekylære mekanismer af vaskulær hyperpermeability. For eksempel er Miles assay blevet brugt til at teste den evne og/eller styrken af forskellige agenter til at fremkalde hyperpermeability19,20,21 eller at teste effekten af hyperpermeability blokerende agenter8 ,22,23. Som et andet eksempel, er agenter, der inducerer vaskulær permeabilitet blevet testet i genmodificerede mus og deres littermate kontrolelementer til at fastsætte krav om specifikke receptorer og signal transducing proteiner for ligand-induceret hyperpermeability svar10,11,12,13,14,15,20,23. Flere modificerede versioner af Miles assay er siden blevet brugt, for eksempel med hensyn til tracer anvendes. Således er Evans blå blevet erstattet i nogle undersøgelser med fluorescens-mærket dextrans i forskellige størrelser eller mikrokugler11,13.
Den største fordel af Miles analysen over andre assays for at undersøge vaskulær hyperpermeability mekanismer er at det er forholdsvis nemt at udføre og kræver ikke dyrt udstyr. Desuden, som en i vivo teknik, dette assay modeller vaskulær lækage i forbindelse med intakt blodkar, i modsætning til måling af lækage gennem undersøgelser in vitro- , såsom trans såvel flux assays eller trans endotel elektrisk modstand ( TEER) assays, som udelukkende, fokusere på i endothelial éncellelag. Alternative i vivo assays af vaskulær hyperpermeability kan afvige fra Miles analysen beskrives her ved at udnytte en anden leveringsbetingelser rute for den hyperpermeability-fremkaldende agent eller ved at analysere vaskulær lækage på forskellige steder, for eksempel ved systemisk levering af en agent via hale vene efterfulgt af vaskulær lækage undersøgelsen i lungerne eller luftrør11,13,15. En begrænsning af Miles analysen er at intradermal injektion af visse agenser kan i princippet også påvirke blodtrykket og flow ud over endotel barriere forstyrrelser og, derfor, indflydelse vaskulær permeabilitet også indirekte. Ikke desto mindre dette assay har for nylig været vist at måle vaskulær permeabilitet induceret af VEGF-et uafhængigt af effekter på systemisk blodtryk15. En anden begrænsning af Miles assay er, at vaskulær senge i forskellige væv kan reagere forskelligt til fremme af permeabilitet agenter, og resultater, der opnås med en Miles assay i huden ikke kan derfor være repræsentant, for eksempel, af hvad der sker i den lunge eller hjernen.
Dyrets alder og vægt kan påvirke lækage observeret i Miles assay. For at minimere effekten af disse variabler, forskere skal bruge littermates eller tilsvarende størrelse og alderen mus som kontrol. Ved vurderingen af musen mutanter for et bestemt gen af interesse, bør mus genereres gennem en heterozygous versus heterozygous avl strategi og vildtype littermates bruges som kontrol. Derudover er det tilrådeligt at bruge hurtigt reversible gasanæstetika, såsom isofluran, at undgå vasokonstriktion, som er blevet beskrevet for nogle bedøvende medicin administreres via parenteral injektioner24,25. Injektion af Evans blå farvestof i mus laterale hale vene er et afgørende skridt i denne protokol og høj grad kan påvirke kvaliteten af eksperiment og data. Således forskere skal være kompetente i at udføre hale vene injektioner og vil sandsynligvis har brug for forudgående erfaring eller praksis før begyndelsen Miles assay eksperimentere. Alternativt, kunne forskerne bruge andre intravenøs ruter til at levere Evans blå, såsom retro-orbital injektion hvis de er erfarne med den. Intradermal injektion af permeabilitet-fremme løsninger kan forårsage agent-uafhængig skader på huden. Derfor bør intradermale indsprøjtninger bør ikke overstige 20 µl i volumen, altid udføres i nærværelse af histamin-hæmmer og normaliseret til køretøjet kontrol injektioner.
Miles assay er blevet brugt af mange forskere til at evaluere komponenter af den VEGF-A signalvejen, for eksempel fordi VEGF-A-induceret vaskulær permeabilitet forårsager ascites i kræft patienter16 og vision-forringer ødem i flere neovaskulær øje sygdom7. Dermed, vi og andre har brugt Miles analysen sammenlignes VEGF-A induceret vaskulære lækage i mus, der har været genetisk modificeret til at mangle bestemte komponenter i den VEGF-signalering cascade12,13,14, 15 , 20 , 23. vores seneste undersøgelse ved hjælp af denne metode afslørede, at de væsentligste patologiske VEGF-A isoform, VEGF165, signaler gennem et kompleks af VEGFR2 og NRP1, hvorved NRP1 cytoplasmatisk domæne fremmer ABL kinase-medieret aktivering af SRC familie kinaser til at fremkalde en hyperpermeability svar14. VEGFA også fremmer blodkar vækst og kunne derfor bruges terapeutisk at gendanne blodgennemstrømning til iskæmisk væv, hvis dens hyperpermeability aktiviteter kunne være specifikt hæmmet. Forskning belyse de molekylære mekanisme, der styrer VEGF-et svar af vascular endothelial celler mod vaskulær hyperpermeability kan derfor identificere veje, der selektivt kan manipuleres til at hæmme patologiske VEGF-A induceret ødem i sygdomme, som kræft eller iskæmisk øjensygdom. Miles assay vil utvivlsomt fortsat være et nyttig metode til at underbygge disse og mange andre typer af funktionelle studier til at belyse molekylære regulatorer og effektorer af vaskulær hyperpermeability.

Den primære funktion af hjerte-kar-systemet er at muliggøre overførsel af gasser, næringsstoffer, og affaldsprodukter mellem omsætning og væv i alle organer. Blodkar har orgel-specifikke niveauer af basal permeabilitet til at muliggøre sådanne udvekslinger1. For eksempel, er blodkar i nyrerne stærkt permeable, mens blod-hjerne barrieren danner en stram, meget uigennemtrængelige grænseflade2,3,4. I endothelial celler, der danner den indvendige foring af blodkar give en fysisk barriere mellem omsætning og underliggende væv og regulere vaskulær permeabilitet i en orgel-specifikke måde. Dog forårsager visse stimuli en delvis opdeling af endotel barriere til at øge den flydende ekstravasation fra omsætning i interstitium ovenfor basal niveauer1. Sådanne hyperpermeability er iagttaget, for eksempel på lokaliteter af væv traumer, i betændelse i tumorer, under sepsis, i øjnene med neovaskulær sygdom eller i hjernen og hjertet, når væv iskæmi opstår på grund af et slagtilfælde eller myokardieinfarkt, henholdsvis 5 , 6 , 7 , 8. Når kronisk forhøjet, hyperpermeability fører til ødem, hvilket igen forårsager vævsskader såsom tab af synet på øjet sygdom9. Således er modellering vaskulær hyperpermeability svar ønskeligt for at forstå de mekanismer, der øger endotel permeabilitet og at teste effekten af agenter designet til at hæmme dette.
Miles assay er en veletableret, almindeligt anvendte og forholdsvis enkel teknik, der måler vaskulær lækage i vivo som en surrogat måling af vaskulær hyperpermeability. Selvom det ikke tager hensyn compounding faktorer, der kan øge vaskulær lækage uafhængigt af endotel barriere regulering, såsom blodtryk eller blodgennemstrømning, Miles assay er generelt tænkt at give en pålidelig metode til at vurdere de permeabilitet-modulerende aktivitet af stoffer, og identificere de signaling mæglere, der fremmer deres aktivitet. Følgelig Miles analysen har været integrerende til talrige undersøgelser, der har identificeret mediatorer af vaskulær hyperpermeability og deres mekanismer i aktion10,11,12,13, 14,15, såsom den vaskulære endotel vækstfaktor VEGF-A der blev oprindeligt identificeret som vaskulær permeabilitet faktor VPF16.
Oprindeligt udviklet af Miles og Miles at studere vaskulær permeabilitet i marsvin17, blev deres assay efterfølgende tilpasset til ved hjælp af mus, som nu er model organisme valg at belyse molekylære mekanismer af vaskulær permeabilitet forordning på grund af deres udsøgte egnethed til genmanipulation. Kort, Evans blå farvestof er intravenøst injiceres voksne mus og lov til at cirkulere i 30 minutter (figur 1). Permeabilitet-inducerende agenter versus køretøj kontrol er derefter intradermalt injiceres i flere steder på modstand mod flanker af musen til at fremkalde vaskulær lækage (figur 1). Derfor, albumin-bundne Evans blå farvestof extravasates og ophobes i dermis (figur 1). Efter humant aflive mus, Evans blå er udvundet af dermis og niveau af vaskulær lækage beregnes som forholdet mellem test stof - til køretøjet-induceret optisk densitet (figur 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="972">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:320px;">Pyrilamine maleate salt</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">P5514-5G</td>
			<td style="width:167px;">Resuspend in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Deionised Formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4117</td>
			<td>Use in fume cupboard</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microlance Needles 30g x 0.5&#34;</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sterile Plastipak 1ml Luer</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:320px;">Sterile MicroFine syriinges 0.3 ml - 8 mm - 30G&#160;</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>324826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Evans blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse restrainer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heat chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hair clippers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isoflurane</td>
			<td>Merial</td>
			<td>ap/drugs/220/96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Scalpal&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Blunt scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heatblock</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cork board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Benchtop refrigerated centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor 165</td>
			<td>Reliatech</td>
			<td>M30-004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating vascular hyperpermeability-inducing agents in the skin with the miles assay

Den vaskulære endotel i hvirveldyr organismer primære funktion er at fungere som en barriere mellem blod og hvert væv i kroppen, hvorved permeabiliteten af endotel blodlegemer, plasma makromolekyler og vand kan tilpasses i henhold til de fysiologiske behov. I visse sygdomme, er cytokiner og vækstfaktorer udgivet som target i endothelial hindring for forbigående øge vaskulær permeabilitet; men deres langvarige tilstedeværelse kan forårsage kronisk vaskulære hyperpermeability og dermed væv-skadelige ødem. Miles assay er en i vivo -teknik, der giver forskere til at studere vaskulær hyperpermeability gennem proxy måling af vaskulær lækage. Her give vi en detaljeret protokol om, hvordan du udfører denne procedure i mus, som er den mest udbredte model organisme at studere pattedyr fysiologi og patologi. Proceduren indebærer intravenøs injektion af Evans blå farvestof til at mærke den cirkulerende albumin efterfulgt af flere intradermale indsprøjtninger af permeabilitet-inducerende agenter og køretøj kontrol løsninger ind mod flanker af musen. Derfor siver Evans blå farvestof gradvist ind i dermis, hvor det ophobes og kan udvindes til kvantificering som lækage induceret af den permeabilitet-fremkaldende agent i forhold til køretøjet. Miles analysen kan være udført i vildtype eller genetisk modificerede musemodeller og kan kombineres med drug administration at studere molekylære mekanismer, der regulerer vaskulær permeabilitet og identificere agenter/mål i stand til at inducere eller blokering hyperpermeability.

Vi brugte Miles analysen for at vurdere VEGF-en evne til at fremkalde vaskulær lækage i forhold til koeretoejets styring (PBS) i vildtype C57/Bl6 mus. Her viser vi en repræsentativ eksperiment ved hjælp af vildtype mus stimuleret med intradermal injektion af 20 µL opløsning indeholdende 50 ng af VEGF-A i PBS eller køretøjet PBS kun. En klar stigning i Evans blå farvestof lækage i hud prøver injiceres med VEGF-A i forhold til PBS var tilsyneladende i situ (figur 1E) og efter udvinding af farvestof i formamid (figur 2A). Kvantificering af flere eksperimenter viser, at 50 ng af VEGF-A inducerer betydeligt mere Evans blå lækage end PBS alene (figur 2B), med en gennemsnitlig 3-fold øget vaskulær lækage i forhold til køretøjet (figur 2 c).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig1.jpg"> Figur 1: induktion af vaskulær lækage i Miles assay. Skematisk repræsentation (top paneler) og tilsvarende billeder (bunden paneler) af de sekventielle trin, når du udfører Miles assay i musen. (A) Pyrilamine maleat sprøjtes intraperitoneal for at forhindre frigivelse af endogene histamin 10 til 30 minutter før (B) intravenøs injektion af 100 µl 1% Evans blå i halen vene af musen. (C) 30 min senere, vaskulær lækage er foranlediget ved intradermal indsprøjtning af agent (50 ng af VEGF-A; grønne cirkler) versus køretøj kontrol (PBS, hvide cirkler). (D, E) For at få adgang til websteder af Evans blå ophobning, musen er nedfalden 20 minutter efter de intradermale indsprøjtninger og huden på begge flanker dissekeret og holdt nede. i.p.: intraperitoneal; i.v.: intravenøs; i.d.: intradermal; skalere barer, 1 cm. <a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig1large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig2.jpg"> Figur 2: kvantificering af vaskulær lækage i Miles assay. (A) Evans blå farvestof er udvundet i formamid fra hud prøver fremstillet af hver enkelt intradermal injektion i figur 1 og indlæses i en 96-brønd plade for absorbans læsning med et spektrofotometer. (B, C) Grafisk repræsentation af absorbans aflæsninger fra flere eksperimenter af plotte enten (B) den normaliserede absorbans værdier (optisk tæthed, OD) af begge permeabilitet-fremkaldende agent (VEGF-A; mørk grøn cirkler) og køretøjet (PBS, grå cirkler), eller (C) fold ændre i OD for agent versus køretøj (fejllinjer: SEM). Absorbansen aflæsninger af tredobbelt PBS og VEGF-A prøver vist i (A) er i gennemsnit og vist (B, C) som hvide eller grønne cirkler, henholdsvis. <a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay at JoVE.com

Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

Vi præsenterer her, en protokol for at måle den vaskulær lækage følge af intradermal indgift af permeabilitet fremme agenter ind i murine huden. Denne teknik kan bruges til at bestemme molekyler evne til at fremme eller hæmme vaskulær lækage eller at studere de molekylære mekanismer, der regulerer vaskulær permeabilitet.

Evaluering af vaskulære Hyperpermeability-fremkaldende stoffer i huden med Miles Assay

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby ...

Research

JoVE Journal

Biology

Construction and Implantation of a Microinfusion System for Sustained Delivery of Neuroactive Agents.

Sustained delivery of neuroactive agents is widely used in neuroscience, but poses many technical challenges. It is necessary to deliver the agent with ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiering af Nyfødte musehud afledt stamceller i Germ-lignende celler<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Isolering af murint koronar vaskulær glat muskelceller

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

Vurdering af vaskulær tone reaktionsevne ved hjælp af isolerede Mesenteriske arterier med fokus på graduering af Perivaskulære fedtvæv

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic ...

Deep Vascular Imaging in the Eye with Flow-Enhanced Ultrasound

Dyb vaskulær billeddannelse i øjet med flow-forbedret ultralyd

The retina within the eye is one of the most energy-demanding tissues in the body and thus requires high rates of oxygen delivery from a rich blood ...

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

Imaging Molekylær vedhæftning i Cell Rolling ved vedhæftning Fodaftryk Assay

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Anvendelse af passiv hovedbevægelse til at generere definerede accelerationer ved gnaverhovederne på gnavere

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Isolering af hjerte- og vaskulære glatte muskelceller fra voksne, unge, larve- og embryonale zebrafisk til elektrofysiologiske undersøgelser

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...