Name: evaluating vascular hyperpermeability-inducing agents in the skin with the miles assay
Uploaded: 2018-06-19T13:30:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay at JoVE.com

Wij danken Laura Denti, Valentina Senatore en het personeel van de biologische hulpbronnen Unit van de UCL Institute van oftalmologie voor hulp bij muis veehouderij en Camille Charoy voor technische ondersteuning. Dit werk werd gesteund door een subsidie van de Medical Research Council (heer/N011511/1) C. Ruhrberg en een Britse hart Stichting PhD studententijd aan J.T. Brash (FS/13/59/30649).

Alle dierlijke werk werd uitgevoerd na UK Home Office en institutionele richtsnoeren voor dierenwelzijn en de ethische beoordeling lichaam (AWERB).
1. muis voorbereiding
Opmerking: Uitvoeren experimenten op volwassen muizen van ten minste 8 weken leeftijd, tot naar 6 maanden oud. Om aan te tonen van technische reproduceerbaarheid en consequent timing voor elke stap van deze procedure tussen verschillende dieren, minimaal 2 en maximaal 6 muizen voor elke experimentele sessie te gebruiken. Om te beoordelen van het effect van een mutatie op een permeabiliteit-inducerende stof in genetisch gemodificeerde muizen, idealiter gebruik 2 mutant muizen en 2 littermate controles per experimenten.
<ol><li>24 h vóór stimulerende vasculaire hyperpermeability, anesthetize muizen met behulp van een geschikte inademing verdoving zoals Isofluraan. Gebruik 3% Isofluraan voor inductie van de anesthesie totdat de restarmen reflex verloren is en de muis niet reageert op externe prikkels. 1,5% Isofluraan gebruiken voor anesthesie onderhoud (ervoor zorgen dat de muis constant respiratoire tarieven). Onder verdoving, zorgvuldig scheren beide flanken van elke muis met een elektrisch scheerapparaat, het vermijden van verwondingen aan de huid. Opmerking: Verdoving wordt gebruikt om te voorkomen dat de stress veroorzaken aan het dier en om te minimaliseren van beweging tijdens het scheren, wat leiden beschadiging van de huid tot kan.</li>
	<li>De geschoren muis terug naar haar kooi. Voor mannelijke muizen, plaatst u elke man in een individuele kooi na verdoving herstel om te voorkomen dat vechten en, derhalve, beschadiging van de huid. Voor vrouwelijke muizen, terugsturen in een groep naar hun kooi. Opmerking: Als een gevechten gedrag is waargenomen bij mannelijke muizen in de kooi, vóór de procedure, ze scheiden in afzonderlijke kooien voor 3 dagen voordat het experiment dat de potentiële schade van de huid om te genezen.</li>
	<li>Volgen de muizen totdat ze herstellen van bewustzijn (meestal binnen een paar seconden) en bewegen van de kooi (meestal binnen 1 min).</li>
</ol>2. intraveneuze injectie van Evans blauwe kleurstof
<ol><li>Bereiden in een laminaire flow kabinet, aparte steriele oplossingen van de histamine-remmer pyrilamine maleaat (4 µg/µL in een zoutoplossing 0,9%) en Evans blauwe kleurstof (1% w/v in een zoutoplossing 0,9%). Steriliseren in de oplossingen passeren een 22 µm filter.</li>
	<li>Kunt een steriele 1 mL injectiespuit met een naald 30 G intraperitoneally Injecteer elke muis met 10 µL pyrilamine maleaat oplossing/gram lichaamsgewicht (figuur 1A). Uitvoeren van de eerste, nekvel van injectie, de muis en vervolgens kantelen zodat het hoofd is gericht op de grond en de buik naar boven is gericht. Injecteren in de lagere kwadranten van het abdomen uit de buurt van de middellijn om te voorkomen dat het raken van de blaas. Opmerking: Het gewicht van de muizen tussen 8 weken en 6 maanden oud meestal varieert tussen 15 en 30 g. Pyrilamine maleaat zal remmen het vrijkomen van endogeen histamine, die anders vasculaire lekkage onafhankelijk van de agent te beproeven zou bevorderen.</li>
	<li>Hiermee plaatst u de muisaanwijzer in een kamer warmte 37 ° C gedurende 10 minuten ter bevordering van vasodilatatie. Anderzijds gebruiken een geschikte warmte lamp gericht op de staart om vasodilatatie, indien het gebruik van een warmte lamp is toegestaan door de lokale ethische richtsnoeren.</li>
	<li>Een muis tegelijk naar een muis afdekking en wrijf de staart met 70% ethanol te reinigen van de injectie-gebied en vasodilatatie verder te bevorderen.</li>
	<li>Gebruiken van een steriele 1 mL injectiespuit met een naald 30G voor het beheren van 100 µL Evans blauwe kleurstof intraveneus via de staart ader (figuur 1B). Onmiddellijk druk uitoefenen op de injectieplaats door het ingedrukt houden van de staart tussen een vinger en de duim te voorkomen bloeden. Opmerking: Visualisatie van de ader van de staart kan worden verbeterd door het regisseren van de lamplicht naar het gebied van de injectie. Nader op het uitvoeren van intraveneuze injecties in de muis staart ader kan worden gevonden in een gepubliceerde protocol18.</li>
	<li>Laat de kleurstof te circuleren gedurende 30 minuten.</li>
</ol>3. stimuleren van vasculaire Hyperpermeability
<ol><li>Met behulp van steriele oplossingen in een laminaire flow kabinet, Verdun de permeabiliteit-inducerende agent voor een concentratie waarmee de laatste dosis worden geleverd in een volume van 20 µL van belang. Opmerking: In de voorbeeld-experiment afgebeeld in Figuur 1-Figuur 2, dat VEGFA wordt gebruikt voor het stimuleren van vasculaire hyperpermeability bij een concentratie van 2,5 ng/µL in PBS, opbrengst van een totale dosis van 50 ng, en PBS wordt gebruikt als een voertuig-besturingselement.</li>
	<li>Laad de permeabiliteit-inducerende agent van belang en het voertuig controle in 2 aparte steriele 300 µL spuiten met een 31 G naald. Laden voldoende oplossing voor elke muis met 20 µL van de oplossing in drievoud injecteren (d.w.z. bereiden 60 µL van agent en voertuig per muis, plus extra volume ter verantwoording voor het dode volume van de naald).</li>
	<li>Anesthetize de eerste muis te beproeven met Isofluraan (3% voor de inductie van de anesthesie tot wetswijziging reflex verloren is en de muis niet reageert op externe prikkels, en 1,5% voor anesthesie onderhoud, ervoor te zorgen dat de muis constante respiratoire tarieven heeft).</li>
	<li>Intradermaal injecteren 20 µL van de agent permeabiliteit-bevordering van de flank van de muis (Figuur 1 c). Zorg ervoor dat de naald onder een hoek van 15° met de huid. Controleer of de vorming van een verhoogde zeepbel binnen de huid waarmee wordt aangegeven van een succesvolle injectie. Herhaal de intradermale injectie bij 2 extra sites, een ten minste 1 cm uit elkaar.</li>
	<li>Draai de muis naar de 2de flank bloot en herhaal drievoudige injecties met de bedieningsoplossing voor het voertuig. Opnemen op papier de positie van elke injectieplaats om hun identificatie voor de daaropvolgende verzameling van huid monsters te vergemakkelijken. Opmerking: De huid van de muis met de nodige voorzichtigheid behandelen in dit stadium; bijvoorbeeld, Vermijd knijpen van de huid bij het uitvoeren van intradermale injecties.</li>
	<li>De geïnjecteerde muis terug naar haar kooi en volgen van de muis totdat het bewustzijn (meestal binnen een paar seconden herstelt) en rond de kooi beweegt.</li>
	<li>Terwijl de eerste muis herstelt, onmiddellijk Herhaal stap 3.3 en 3.5 met de tweede muis, enzovoort (maximaal 6 muizen maximaal per sessie). Een register bijhouden van de tijd die elke muis werd geïnjecteerd om aan te passen het tijdstip om te gaan met de volgende stap.</li>
</ol>4. kwantificering van geaccumuleerde Evans blauw binnen de Dermis
<ol><li>Ruiming elke muis door cervicale dislocatie 20 min na de intradermale injecties ontvangst, observeren van dezelfde volgorde waarin de muizen werden ingespoten. Opmerking: De duur van de vasculaire lekkage kan variëren naar gelang de permeabiliteit-inducerende agent gebruikt, en dus de tijd tussen intradermale injectie en ruimen wellicht optimaliseren.</li>
	<li>Plaats elke geruimd muis op haar rug en pin zijn voeten op een bord van kurk omwikkeld met een schone tissue (Figuur 1 d).</li>
	<li>Maak een verticale insnijding van ongeveer 3-4 cm vanaf de onderbuik met botte schaar tot de borst van de dode muis. Tease weg, met een scalpel en pincet, de huid van beide flanken te onthullen van de binnenzijde van de dermis en sites van Evans blauwe accumulatie (figuur 1E). PIN omlaag de losse huid en vet verwijderen uit gebieden rond de lekkage-site met een scalpel. Indien nodig, neem een representatieve foto om aan te tonen van de omvang van Evans blauwe lekkage in de huid.</li>
	<li>Met behulp van Tang en een scalpel, accijnzen huid regio's bestaande uit de gelekte Evans blauwe kleurstof voor elke site ingespoten met de permeabiliteit-inducerende agent of voertuig. Opmerking: zorg vergelijkbaar formaat regio's van de huid om ervoor te zorgen dat bij de volgende stap 4.7, een vergelijkbaar gedeelte van het volume van formamide worden door elk monster van de huid geadsorbeerde zal, waardoor de uitgepakte kleurstof verdund moet worden in een vergelijkbare hoeveelheid resterende formamide accijnzen . De kaart van de injectie opgenomen in stap 3.5 zullen helpen definiëren van het gebied dat moet worden weggesneden.</li>
	<li>Plaats elk monster in de buis van een 1,5 mL en label het dienovereenkomstig, ervoor te zorgen dat elk monster berust op de onderkant van de buis. Opslaan van de monsters bij - 20 ° C tot verder gebruik. Als de verwerking onmiddellijk, volg de onderstaande stappen.</li>
	<li>'S nachts drogen van de monsters van de huid door het plaatsen van open buizen in een oven of in de put van een blok van de verwarming bij 55 ° C.</li>
	<li>Als u wilt uitpakken Evans blauwe kleurstof, 250 µL gedeïoniseerd formamide toevoegen aan de monsters in een zuurkast, sluit de buizen. Zorg ervoor dat de huid monsters vallen allemaal onder de formamide en na een nacht bebroeden in een oven of een blok van de verwarming bij 55 ° C.</li>
	<li>Centrifugeer steekproeven in een benchtop centrifuge met maximale snelheid (> 10.000 x g) voor 40 min.</li>
	<li>In een zuurkast, Pipetteer 100 µL van het supernatans dat kleurstof bevattende van elk monster in een aparte putje van een transparante, vlakke bodem 96-wells-plaat (figuur 2A).</li>
	<li>Maatregel piek Evans blauwe absorptie bij 620 nm met een referentie-lezing van 740 nm in een spectrofotometer. Opmerking: 620 nm is de piek van Evans blauwe extinctie, terwijl 740 nm wordt niet geabsorbeerd door Evans blauw en fungeert als een referentie-golflengte.</li>
	<li>Het gemiddelde van de lezingen van de extinctie van de drievoudige injecties van dezelfde agent of voertuig voor elke muis ter verantwoording voor technische variabiliteit (figuur 2B).</li>
	<li>Berekening van het verschil van de vouw van lezingen van permeabiliteit-inducerende agent versus voertuig controle (figuur 2C).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nagy, J. A., Benjamin, L., Zeng, H. Y., Dvorak, A. M., Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability,+vascular+hyperpermeability+and+angiogenesis.">Vascular permeability, vascular hyperpermeability and angiogenesis.</a> Angiogenesis. 11, 109-119 (2008).</li><li>Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+blood-brain+barrier.">Development of the blood-brain barrier.</a> Cell and Tissue Research. 314, 119-129 (2003).</li><li>Ruhrberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+and+shaping+the+vascular+tree:+multiple+roles+for+VEGF.">Growing and shaping the vascular tree: multiple roles for VEGF.</a> Bioessays. 25, 1052-1060 (2003).</li><li>Risau, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Endothelium.">Differentiation of Endothelium.</a> FASEB Journal. 9, 926-933 (1995).</li><li>Strbian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier+is+continuously+open+for+several+weeks+following+transient+focal+cerebral+ischemia.">The blood-brain barrier is continuously open for several weeks following transient focal cerebral ischemia.</a> Neuroscience. 153, 175-181 (2008).</li><li>Weis, S. M., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiological+consequences+of+VEGF-induced+vascular+permeability.">Pathophysiological consequences of VEGF-induced vascular permeability.</a> Nature. 437, 497-504 (2005).</li><li>Campochiaro, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+of+retinal+and+choroidal+vascular+diseases.">Molecular pathogenesis of retinal and choroidal vascular diseases.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 49, 67-81 (2015).</li><li>Aman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+Treatment+of+Edema+and+Endothelial+Barrier+Dysfunction+with+Imatinib.">Effective Treatment of Edema and Endothelial Barrier Dysfunction with Imatinib.</a> Circulation. , 126 (2012).</li><li>Claesson-Welsh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability-the+essentials.">Vascular permeability-the essentials.</a> Upsala J Med Sci. 120, 135-143 (2015).</li><li>Schulte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+the+VE-cadherin-catenin+complex+blocks+leukocyte+extravasation+and+vascular+permeability.">Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability.</a> Embo Journal. 30, 4157-4170 (2011).</li><li>Heinolainen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR3+Modulates+Vascular+Permeability+by+Controlling+VEGF/VEGFR2+Signaling.">VEGFR3 Modulates Vascular Permeability by Controlling VEGF/VEGFR2 Signaling.</a> Circulation Research. 120, (2017).</li><li>Eliceiri, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+requirement+for+Src+kinases+during+VEGF-induced+angiogenesis+and+vascular+permeability.">Selective requirement for Src kinases during VEGF-induced angiogenesis and vascular permeability.</a> Molecular Cell. 4, 915-924 (1999).</li><li>Sun, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR2+induces+c-Src+signaling+and+vascular+permeability+in+vivo+via+the+adaptor+protein+TSAd.">VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd.</a> Journal of Experimental Medicine. 209, 1363-1377 (2012).</li><li>Fantin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF165-induced+vascular+permeability+requires+NRP1+for+ABL-mediated+SRC+family+kinase+activation.">VEGF165-induced vascular permeability requires NRP1 for ABL-mediated SRC family kinase activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 214, 1049-1064 (2017).</li><li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR2+pY949+signalling+regulates+adherens+junction+integrity+and+metastatic+spread.">VEGFR2 pY949 signalling regulates adherens junction integrity and metastatic spread.</a> Nat Commun. 7, (2016).</li><li>Senger, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cells+secrete+a+vascular+permeability+factor+that+promotes+accumulation+of+ascites+fluid.">Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid.</a> Science. 219, 983-985 (1983).</li><li>Miles, A. A., Miles, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Reactions+to+Histamine,+Histamine-Liberator+and+Leukotaxine+in+the+Skin+of+Guinea-Pigs.">Vascular Reactions to Histamine, Histamine-Liberator and Leukotaxine in the Skin of Guinea-Pigs.</a> J Physiol-London. 118, 228-257 (1952).</li><li>Radu, M., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+Assay+to+Test+Blood+Vessel+Permeability.">An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability.</a> Jove-J Vis Exp. , e50062 (2013).</li><li>Roth, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-1+mediates+vascular+permeability+independently+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptor-2+activation.">Neuropilin-1 mediates vascular permeability independently of vascular endothelial growth factor receptor-2 activation.</a> Sci Signal. 9, (2016).</li><li>Acevedo, L. M., Barillas, S., Weis, S. M., Gothert, J. R., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+3A+suppresses+VEGF-mediated+angiogenesis+yet+acts+as+a+vascular+permeability+factor.">Semaphorin 3A suppresses VEGF-mediated angiogenesis yet acts as a vascular permeability factor.</a> Blood. 111, 2674-2680 (2008).</li><li>Teesalu, T., Sugahara, K. N., Kotamraju, V. R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-end+rule+peptides+mediate+neuropilin-1-dependent+cell,+vascular,+and+tissue+penetration.">C-end rule peptides mediate neuropilin-1-dependent cell, vascular, and tissue penetration.</a> P Natl Acad Sci USA. 106, 16157-16162 (2009).</li><li>Ho, V. C., Duan, L. J., Cronin, C., Liang, B. T., Fong, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Receptor-2+Abundance+Contributes+to+Increased+Angiogenesis+in+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Receptor-1-Deficient+Mice.">Elevated Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Abundance Contributes to Increased Angiogenesis in Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1-Deficient Mice.</a> Circulation. 126, (2012).</li><li>Chislock, E. M., Pendergast, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abl+Family+Kinases+Regulate+Endothelial+Barrier+Function+In+Vitro+and+in+Mice.">Abl Family Kinases Regulate Endothelial Barrier Function In Vitro and in Mice.</a> PLoS ONE. 8, e85231 (2013).</li><li>Busch, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+ketamine+on+hypoxic+pulmonary+vasoconstriction+in+the+isolated+perfused+lungs+of+endotoxaemic+mice.">Effects of ketamine on hypoxic pulmonary vasoconstriction in the isolated perfused lungs of endotoxaemic mice.</a> Eur J Anaesth. 27, 61-66 (2010).</li><li>Sinclair, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+physiological+effects+of+alpha2-agonists+related+to+the+clinical+use+of+medetomidine+in+small+animal+practice.">A review of the physiological effects of alpha2-agonists related to the clinical use of medetomidine in small animal practice.</a> Can Vet J. 44, 885-897 (2003).</li></ol>

De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen te verklaren.

Sinds zijn eerste beschrijving in 195217, heeft de bepaling van de Miles onderzoekers voorzien van een relatief snelle, eenvoudige en betrouwbare methode voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen van vasculaire hyperpermeability. Bijvoorbeeld, is de bepaling van Miles gebruikt voor het testen van het vermogen en/of sterkte van verschillende agenten voor het opwekken van hyperpermeability19,20,21 of voor het testen van de werkzaamheid van hyperpermeability blokkeren agenten8 ,22,23. Een ander voorbeeld: agenten die vasculaire permeabiliteit veroorzaken zijn getest in genetisch gemodificeerde muizen en hun littermate-besturingselementen om te bepalen wat de vereisten van de specifieke receptoren en signaal transducing eiwitten voor ligand-geïnduceerde hyperpermeability Reacties10,11,12,13,14,15,20,23. Meerdere aangepaste versies van de Miles assay hebben sindsdien gebruikt, bijvoorbeeld met betrekking tot de tracer gebruikt. Dus, blauwe Evans heeft vervangen in sommige studies met fluorescentie-label van verschillende grootte of microsferen11,13dextrans.
Het belangrijkste voordeel van de Miles bepaling over andere testen om vasculaire hyperpermeability mechanismen te onderzoeken is dat het relatief gemakkelijk uit te voeren en geen dure apparatuur vereist. Bovendien, als een in vivo techniek, deze bepaling modellen vasculaire lekkage in de context van intact bloedvaten, in tegenstelling tot het meten van lekkage via testen in vitro zoals trans goed flux testen of trans endothelial elektrische weerstand) TEER) testen, die zich, alleen, op het endotheel enkelgelaagde concentreren. De alternatieve in vivo tests van vasculaire hyperpermeability afwijken van de hier beschreven met behulp van een verschillende bezorgingsroute voor de hyperpermeability-inducerende agent of door het analyseren van vasculaire lekkage op verschillende locaties, voor Miles-bepaling voorbeeld door systemische afgifte van een agent via de ader van de staart gevolgd door vasculaire lekkage examen in de longen of de luchtpijp11,13,15. Een beperking van de Miles-bepaling is dat de intradermale injectie van bepaalde agentia kan in principe ook van invloed zijn bloeddruk en stroom naast endothelial barrière verstoring en dus ook indirect invloed vasculaire permeabiliteit. Echter deze test onlangs is gebleken voor het meten van de vasculaire permeabiliteit geïnduceerd door VEGF-A onafhankelijk van de gevolgen van de systemische bloeddruk15. Een andere beperking van de Miles-bepaling is dat vasculaire bedden in verschillende weefsels en anders op permeabiliteit-bevordering van agenten, en resultaten van een bepaling van de Miles in de huid reageert, daarom mogen geen vertegenwoordiger, bijvoorbeeld, van wat er gebeurt de longen of hersenen.
De leeftijd en het gewicht van het dier invloed kunnen zijn op de lekkage waargenomen in de bepaling van Miles. Om te minimaliseren van het effect van deze variabelen, onderzoekers nestgenoten moeten gebruiken of ook grootte en leeftijd van muizen als besturingselementen. Bij de beoordeling van muis mutanten voor een bepaald gen van belang, moeten de muizen door middel van een heterozygoot versus heterozygoot fokken strategie en wildtype nestgenoten gebruikt als besturingselementen worden gegenereerd. Bovendien is het raadzaam om snel omkeerbare gas anesthetica, zoals Isofluraan, gebruiken om te voorkomen dat vasoconstrictie, die is beschreven voor sommige verdoving drug toegediend via injecties parenterale24,25. De injectie van Evans blauwe kleurstof in de ader van de laterale staart muis is een cruciale stap in dit protocol en de kwaliteit van het experiment en de gegevens sterk kan beïnvloeden. Dus, onderzoekers moet bevoegd zijn op het uitvoeren van de staart ader injecties en zal waarschijnlijk moeten voorafgaande ervaring of praktijk voordat u begint die de mijl assay experimenteren. Ook kunnen onderzoekers gebruiken andere intraveneuze routes Evans blauw, zoals retro-orbitaal injectie als zij ervaring met het leveren. Intradermale injectie van permeabiliteit-bevordering van oplossingen agent-onafhankelijke schade aan de huid kunnen veroorzaken. Daarom moeten intradermale injecties mag niet hoger zijn dan 20 µl in volume, altijd worden uitgevoerd in het bijzijn van de histamine-remmer en genormaliseerd naar voertuig controle injecties.
De Miles-bepaling is gebruikt door vele onderzoekers te evalueren van de onderdelen van de VEGF-A signalering pathway, bijvoorbeeld omdat de VEGF-A-geïnduceerde vasculaire permeabiliteit veroorzaakt ascites in kanker patiënten16 en visie-afbreuk te doen aan oedeem in verschillende neovascular oog ziekte7. Dus, wij en anderen hebben de Miles-bepaling gebruikt om te vergelijken van VEGF-A geïnduceerde vasculaire lekkage in muizen die genetisch zijn gewijzigd om een gebrek aan bepaalde onderdelen van de VEGF-A signalering trapsgewijs12,13,14, 15 , 20 , 23. onze recent onderzoek met behulp van deze aanpak is gebleken dat de voornaamste pathologische VEGF-A isovorm, VEGF165, via een complex van VEGFR2 en NRP1 signalen, waarin het NRP1 cytoplasmatische domein de ABL kinase-gemedieerde activering van SRC familie kinases bevordert voor wekken een reactie van hyperpermeability14. VEGFA ook bevordert groei van bloedvaten en daarom therapeutisch kan worden gebruikt om te herstellen bloedstroom ischemische weefsels als haar hyperpermeability activiteiten specifiek kunnen worden geremd. Onderzoek het ophelderen van het moleculaire mechanisme dat VEGF-A reacties van vasculaire endotheliale cellen naar vasculaire hyperpermeability stuurt zou daarom identificeren trajecten die kunnen selectief worden gemanipuleerd om het remmen van pathologische VEGF-A veroorzaakt oedeem in ziekten, zoals kanker of ischemische oogziekte. De Miles bepaling zal ongetwijfeld blijven een nuttige methode ter ondersteuning van deze en vele andere soorten functionele studies ophelderen van de moleculaire regulatoren en effectoren van vasculaire hyperpermeability.

De primaire functie van het cardiovasculair systeem is om de overdracht van gassen, voedingsstoffen en afvalstoffen tussen de omloop en de weefsels in alle organen. Bloedvaten hebben orgel-specifieke niveaus van basale permeabiliteit toe te staan dergelijke uitwisselingen1. Bloedvaten in de nieren zijn bijvoorbeeld zeer doorlaatbare, terwijl de bloed-hersen-barrière een strakke, zeer ondoordringbare interface2,3,4 vormt. De endotheliale cellen die de binnenbekleding van bloedvaten vormen een fysieke barrière tussen het verkeer en de onderliggende weefsels en vasculaire permeabiliteit regelen op een orgel-specifieke wijze. Bepaalde prikkels veroorzaken echter een gedeeltelijke verdeling van het endotheel blok te verhogen van de vloeibare extravasation van het verkeer in het interstitium boven het basale niveau1. Dergelijke hyperpermeability wordt waargenomen, bijvoorbeeld op locaties van weefseltrauma, in ontsteking, tumoren, tijdens sepsis, in de ogen met neovascular ziekte of in de hersenen en het hart, wanneer weefsel ischemie als gevolg van een beroerte of hartinfarct, respectievelijk optreedt 5 , 6 , 7 , 8. Wanneer chronisch verhoogd, de hyperpermeability leidt tot oedeem, die op hun beurt weefselschade, zoals verlies van visie in oog ziekte9 veroorzaakt. Modelleren van de vasculaire hyperpermeability reactie is dus wenselijk voor het begrijpen van de mechanismen die endothelial permeabiliteit verhogen en voor het testen van de werkzaamheid van agenten die zijn ontworpen voor de remming van dit.
De Miles-bepaling is een gevestigde, gebruikte en relatief eenvoudige techniek, die vasculaire lekkage in vivo als een surrogaat meting van vasculaire hyperpermeability maatregelen. Hoewel het neemt geen rekening gehouden met factoren die vasculaire lekkage onafhankelijk van endothelial barrière verordening, zoals bloeddruk of doorbloeding verhogen kunnen, compounding de Miles-bepaling over het algemeen wordt verondersteld te bieden een betrouwbare methode om te evalueren de permeabiliteit-modulerende activiteit van stoffen en de signalering bemiddelaars ter bevordering van hun activiteit te identificeren. Dienovereenkomstig, de bepaling van Miles is integraal deel uitmaakt van tal van studies die hebben aangegeven bemiddelaars/mediators van vasculaire hyperpermeability en hun mechanismen van actie10,11,12,13, 14,15, zoals de vasculaire endotheliale groeifactor VEGF-A dat werd oorspronkelijk geïdentificeerd als de vasculaire permeabiliteit factor VPF16.
Oorspronkelijk ontwikkeld door mijlen en mijlen om te studeren vasculaire permeabiliteit van cavia's17, werd hun assay later aangepast voor het gebruik van muizen, die nu de modelorganisme voor keuze ophelderen van de moleculaire mechanismen van vasculaire permeabiliteit verordening als gevolg van hun exquise geschiktheid voor genetische manipulatie. Evans blauwe kleurstof is kort, intraveneus geïnjecteerd in volwassen muizen en toegestaan om te circuleren gedurende 30 minuten (Figuur 1). Permeabiliteit-inducerende stoffen ten opzichte van de controle van het voertuig zijn dan intradermaal geïnjecteerd in meerdere sites op tegengestelde flanken van de muis voor het opwekken van vasculaire lek (Figuur 1). Bijgevolg, albumine gebonden Evans blauwe kleurstof extravasates en hoopt zich op in de dermis (Figuur 1). Na het humaan doden de muis, Evans blauw wordt gewonnen uit de dermis en het niveau van vasculaire lek berekend als een ratio van test stof naar voertuig-geïnduceerde optische dichtheid (Figuur 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="972">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:320px;">Pyrilamine maleate salt</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">P5514-5G</td>
			<td style="width:167px;">Resuspend in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Deionised Formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4117</td>
			<td>Use in fume cupboard</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microlance Needles 30g x 0.5&#34;</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sterile Plastipak 1ml Luer</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:320px;">Sterile MicroFine syriinges 0.3 ml - 8 mm - 30G&#160;</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>324826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Evans blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse restrainer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heat chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hair clippers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isoflurane</td>
			<td>Merial</td>
			<td>ap/drugs/220/96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Scalpal&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Blunt scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heatblock</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cork board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Benchtop refrigerated centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor 165</td>
			<td>Reliatech</td>
			<td>M30-004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating vascular hyperpermeability-inducing agents in the skin with the miles assay

De primaire functie van het vasculaire endotheel in gewervelde organismen is om te dienen als een beveiligingsbarrière tussen het bloed en elk weefsel van het lichaam, waardoor de permeabiliteit van het endotheel bloedcellen, plasma macromoleculen en water aangepast volgens worden kan de fysiologische noodzaak. In bepaalde ziekten, zijn cytokines en groeifactoren die gericht zijn op het endotheel barrière om Transient vasculaire permeabiliteit; uitgebracht echter kan hun langdurige aanwezigheid chronische vasculaire hyperpermeability en daardoor beschadiging van weefsel oedeem. De Miles-bepaling is een in vivo techniek waarmee onderzoekers te bestuderen van vasculaire hyperpermeability via de proxy meting van vasculaire lekkage. Hier bieden we een gedetailleerd protocol over het uitvoeren van deze procedure in de muis, die het meest gebruikte model-organisme is te onderzoeken zoogdieren fysiologie en pathologie. De procedure hiervoor is de intraveneuze injectie van Evans blauwe kleurstof op het etiket van de circulerende albumine gevolgd door meerdere intradermale injecties van permeabiliteit-inducerende stoffen en voertuig besturingsoplossingen in verzet tegen de flanken van de muis. Daarom lekken Evans blauwe kleurstof geleidelijk in de dermis, waar het zich ophoopt en voor de kwantificering als lekkage geïnduceerd door de permeabiliteit-inducerende agent ten opzichte van het voertuig kan worden geëxtraheerd. De Miles-test kan worden uitgevoerd in wild type of genetisch gemodificeerde Muismodellen en kan gecombineerd worden met drug administration te bestuderen van de moleculaire mechanismen die regelen vasculaire permeabiliteit en identificeren van agenten/doelstellingen staat inducerende of blokkeren hyperpermeability.

Wij de Miles-bepaling gebruikt ter beoordeling van het vermogen van VEGF-A voor het opwekken van vasculaire lek ten opzichte van voertuig controle (PBS) in wildtype C57/Bl6 muizen. Hier, laten we zien een representatieve experiment wildtype muizen gestimuleerd met intradermale injectie 20 µL oplossing met 50 ng van VEGF-A in PBS of voertuig PBS alleen. Een duidelijke stijging Evans blauwe kleurstof lekkage in monsters van de huid geïnjecteerd met VEGF-A vergeleken met PBS was duidelijk in situ (figuur 1E) en na extractie van de kleurstof in formamide (figuur 2A). Kwantificering van meerdere experimenten blijkt dat 50 ng van VEGF-A induceert aanzienlijk meer Evans blauwe lekkage dan PBS alleen (figuur 2B), met een gemiddelde stijging 3 katernen van vasculaire lekkage in vergelijking met voertuig (figuur 2C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig1.jpg"> Figuur 1: inductie van vasculaire lekkage in de Miles assay. Schematische weergave (bovenste panelen) en bijbehorende beelden (onderste panelen) van de opeenvolgende stappen bij het uitvoeren van de bepaling van de Miles in de muis. (A) Pyrilamine maleaat intraperitoneally wordt geïnjecteerd om te voorkomen dat het vrijkomen van endogeen histamine 10 tot 30 minuten voorafgaand aan de intraveneuze injectie (B) voor 100 µl 1% Evans in de staart blauwe ader van de muis. (C) 30 min later, vasculaire lekkage wordt veroorzaakt door een intradermale injectie van de agent (50 ng van VEGF-A; groene cirkels) versus voertuig controle (PBS; witte cirkels). (D, E) Voor toegang tot de sites van Evans blauwe accumulatie, is de muis gedode 20 minuten na de intradermale injecties en de huid van beide flanken ontleed en vastgemaakt naar beneden. i.p.: intraperitoneaal; i.v.: intraveneuze; id: intradermale; bars, 1 cm. schaal <a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig2.jpg"> Figuur 2: kwantificering van vasculaire lekkage in de Miles assay. (A) Evans blauwe kleurstof wordt gewonnen in formamide van monsters van de huid elke intradermale injectie in Figuur 1 verkregen en geladen in een 96-wells-plaat voor extinctie lezen met een spectrofotometer. (B, C) Grafische weergave van de lezingen van de extinctie van meerdere experimenten door ofwel (B) de genormaliseerde extinctie waarden (optische dichtheid, OD) van zowel de permeabiliteit-inducerende agent (VEGF-A; donker groene cirkels) en voertuig (PBS; grijs cirkels), of (C) de vouw wijzigen in OD voor de agent versus voertuig (foutbalken: SEM). De lezingen van de extinctie van de drievoudige PBS en de VEGF-A voorbeelden getoond in (A) zijn gemiddeld en in (B, C) weergegeven als witte of groene cirkels, respectievelijk. <a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay at JoVE.com

Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

Hier presenteren we een protocol voor het meten van de vasculaire lekkage geïnduceerd door intradermale toediening van permeabiliteit bevordering van agenten in de lymfkliertest huid. Deze techniek kan worden gebruikt om de mogelijkheid van moleculen te bevorderen of belemmeren van vasculaire lekkage of te bestuderen van de moleculaire mechanismen die vasculaire permeabiliteit regelen bepalen.

Beoordelende vasculaire Hyperpermeability-inducerende stoffen in de huid met de Miles-test

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby ...

Research

JoVE Journal

Biology

Construction and Implantation of a Microinfusion System for Sustained Delivery of Neuroactive Agents.

Bouw en Implantatie van een Microinfusion systeem voor duurzame levering van neuroactive Agents.

Sustained delivery of neuroactive agents is widely used in neuroscience, but poses many technical challenges. It is necessary to deliver the agent with ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

Monogene Assay: hechtende cellen

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount Immunohistochemische Analyse voor Embryonale Limb Skin vaatstelsel: een modelsysteem voor Vasculaire Vertakkingen Morphogenesis in Embryo Study

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiatie van pasgeboren muis Skin afgeleide stamcellen in Germ-achtige cellen<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Isolatie van muizen coronaire vasculaire gladde spiercellen

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

Beoordeling van de vasculaire Toon responsiviteit met behulp van geïsoleerde mesenterica slagaders met een focus op modulatie door Perivasculaire vetweefsel

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic ...

Deep Vascular Imaging in the Eye with Flow-Enhanced Ultrasound

Diepe vasculaire beeldvorming in het oog met flow-enhanced echografie

The retina within the eye is one of the most energy-demanding tissues in the body and thus requires high rates of oxygen delivery from a rich blood ...

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

Beeldvorming van moleculaire adhesie in celrollen door adhesievoetafdruktest

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Toepassing van passieve hoofdbeweging om gedefinieerde versnellingen te genereren bij de hoofden van knaagdieren

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Isolatie van cardiale en vasculaire gladde spiercellen van volwassen, juveniele, larvale en embryonale zebravissen voor elektrofysiologische studies

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...