Name: evaluating vascular hyperpermeability-inducing agents in the skin with the miles assay
Uploaded: 2018-06-19T13:30:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay at JoVE.com

אנו מודים לורה Denti, ולנטינה Senatore וצוות של יחידת משאבי הביולוגי UCL מכון עיניים בשביל לעזור עם העכבר גידול, קמיל Charoy לקבלת תמיכה טכנית. עבודה זו נתמכה על ידי מענק המועצה למחקר רפואי (מר/N011511/1) ג רורברג, של studentship הבריטי PhD קרן לב כדי ג'יי טי חצוף (FS/13 59 30649).

כל העבודה בעלי חיים בוצע בעקבות המשרד הביתי בבריטניה, המוסדיים הנחיות צער, גוף ביקורת אתית (AWERB).
1. עכבר הכנה
הערה: לבצע ניסויים על עכברים בוגרים לפחות 8 שבועות של גיל, עד כדי בגיל 6 חודשים. כדי להדגים הפארמצבטית טכני והעיתוי עקבית עבור כל שלב של הליך זה בין בעלי חיים שונים, להשתמש מינימום של 2 מקסימלית של עכברים 6 עבור כל מושב ניסיוני. כדי להעריך את ההשפעה של מוטציה בחומר בתדר חדירות בעכברים מהונדסים, באופן אידיאלי, השתמש עכברים מוטנטים 2 ופקדים littermate 2 לכל ניסויים.
<ol><li>24 שעןת לפני hyperpermeability וסקולרית מגרה, עזים ומתנגד עכברים באמצעות נשימה מתאים הרדמה כגון איזופלוריין. השתמש איזופלוריין 3% עבור אינדוקציה הרדמה עד שקמה בעצמה אחרי שמפילים את רפלקס אובד, העכבר אינו מגיב לגירויים חיצוניים. השתמש איזופלוריין 1.5% לתחזוקה הרדמה (לוודא העכבר יש שיעורי נשימה קבועה). תחת הרדמה, בזהירות לגלח משני האגפים של העכבר בכל גילוח חשמלית, הימנעות פציעות על העור. הערה: הרדמה משמשת כדי למנוע מתח לחיה וכדי לצמצם תנועה בזמן הגילוח, אשר עלול לגרום נזק לעור.</li>
	<li>להחזיר את העכבר מגולח בכלוב בבית. עבור עכברים זכרים, למקם כל זכר לכלוב בודדים לאחר הרדמה השחזור כדי למנוע הלחימה ו, לכן, להזיק לעור. עבור עכברים הנשי, להחזיר אותם בקבוצה לכלוב שלהם הביתה. הערה: אם הלחימה התנהגות נצפית בקרב גברים עכברים בכלוב, לפני ההליך, הפרד אותן לתוך כלובים נפרדים 3 ימים לפני הניסוי כדי לאפשר פוטנציאל נזק לעור להחלים.</li>
	<li>לפקח על העכברים עד לשחזר את התודעה (בדרך כלל תוך כמה שניות) להזיז את הכלוב (בדרך כלל בתוך 1 דקות).</li>
</ol>2. תוך ורידיות אוונס כחול צבע
<ol><li>בזרימה שכבתית cabinet, להכין פתרונות סטרילי נפרד של maleate pyrilamine מעכב את היסטמין (4 µg/µL ב- saline 0.9%) ואת צבע כחול אוונס (1% w/v ב- saline 0.9%). לחטא על-ידי העברת את הפתרונות דרך מסנן 22 מיקרומטר.</li>
	<li>השתמש מזרק 1 מ"ל סטרילי עם מחט 30 G intraperitoneally להחדיר את העכבר כל 10 µL pyrilamine maleate פתרון/גרם של משקל הגוף (איור 1 א'). כדי לבצע את עורפה הראשון, זריקה, העכבר ולאחר מכן להטות את זה כך הראש מופנה כלפי הקרקע ולא הבטן מופנית כלפי מעלה. להזריק ברבעים התחתון של הבטן מן האמצע כדי להימנע מפגיעה שלפוחית השתן. הערה: המשקל של עכברים בין 8 שבועות בגיל 6 חודשים בדרך כלל נע בין 15 ו-30 g. Pyrilamine maleate לעכב השחרור של היסטמין אנדוגני, אשר תקדם אחרת בריחת הדם בנפרד הסוכן להיבדק.</li>
	<li>הצב את העכבר בתוך תא חום 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לקדם vasodilation. לחלופין, השתמש מנורת חימום מתאים ממוקד על הזנב לקדם vasodilation אם השימוש של מנורת חימום מותרת על פי ההנחיות אתית מקומיים.</li>
	<li>להעביר עכבר אחד בכל פעם restrainer העכבר ומרח את הזנב עם 70% אתנול לנקות את אזור ההזרקה, לקדם vasodilation.</li>
	<li>להשתמש מזרק 1 מ"ל סטרילי עם מחט 30G לניהול 100 µL צבע כחול אוונס לווריד דרך הווריד של הזנב (איור 1B). להחיל מיד לחץ על ההזרקה על-ידי החזקת את הזנב בין האצבע והאגודל כדי למנוע דימום. הערה: ויזואליזציה של הווריד של הזנב יכול להשתפר על ידי הפניית המנורה באזור ההזרקה. ניתן למצוא פרטים נוספים על ביצוע הזרקת עירוי לווריד זנב העכבר פרוטוקול שפורסמו18.</li>
	<li>אפשר לצבוע לזרום למשך 30 דקות.</li>
</ol>3. להמריץ את מחזור הדם Hyperpermeability
<ol><li>באמצעות פתרונות סטרילי זרימה שכבתית cabinet, לדלל את הסוכן בתדר חדירות לעניין ריכוז המאפשר את המנה הסופית תגיע אליך בעוד נפח של 20 µL. הערה: במהלך הניסוי בדוגמה המוצגת באיור 1-איור 2, ש-VEGFA משמשת לעירור hyperpermeability כלי דם-ריכוז של 2.5 ng/µL ב- PBS, מניב מנה סך של 50 ng, ו PBS משמש פקד הרכב.</li>
	<li>לטעון את הסוכן בתדר חדירות של עניין הפקד הרכב לתוך 2 נפרדים סטרילי 300 µL מזרקים עם מחט 31 G. לטעון מספקת פתרון להחדיר את העכבר כל 20 µL של הפתרון שהפקידים (כלומר להכין µL 60 של הסוכן, הרכב לכל עכבר, בנוסף אחסון נוסף עבור נפח מת של המחט).</li>
	<li>עזים ומתנגד העכבר הראשון להבדק עם איזופלוריין (3% עבור אינדוקציה הרדמה עד בטעותו רפלקס אובד, העכבר אינו מגיב לגירויים חיצוניים, ו 1.5% עבור תחזוקה הרדמה, מוודא כי העכבר יש שיעורי נשימה קבועה).</li>
	<li>Intradermally להזריק µL 20 של הסוכן קידום חדירות לתוך האגף של העכבר (איור 1C). ודא כי המחט בזווית של 15 מעלות על העור. בדוק היווצרות בועה מוגבהת בתוך העור אשר מציינת זריקה מוצלחת. חזור על הזריקה intradermal באתרים נוספים 2, לפחות 1 ס מ אחד מהשני.</li>
	<li>הפעל את העכבר כדי לחשוף את האגף השני וחזור זריקות triplicate עם הפתרון הרכב שליטה. לרשום על נייר את המיקום של כל אתר הזרקת כדי להקל על הזיהוי שלהם לאוסף עוקבות של דגימות עור. הערה: להתמודד עם העור העכבר בזהירות בשלב זה; לדוגמה, למנוע התכווצות העור בעת ביצוע intradermal זריקות.</li>
	<li>לחזור על העכבר מוזרק בכלוב הביתה ונטר את העכבר עד שהיא משחזרת את התודעה (בדרך כלל תוך כמה שניות) נע סביב הכלוב.</li>
	<li>בעוד העכבר הראשון מתאושש, מיד חזור על שלבים 3.3 ו- 3.5 עם העכבר השני, וכן הלאה (עד 6 עכברים מקסימאלית בכל הפעלה). שמור תיעוד של הזמן שבכל עכבר הוזרק כדי להתאים את הזמן שבו צריך להמשיך לשלב הבא.</li>
</ol>4. כימות של אוונס שהצטברו כחול בתוך הדרמיס
<ol><li>ללקט כל עכבר על-ידי נקע בצוואר הרחם 20 דקות אחרי זה קיבל את הזריקות intradermal, התבוננות באותו סדר בו הוזרקו העכברים. הערה: משך הזמן של בריחת הדם עשוי להשתנות על פי הסוכן חדירות בתדר המשמש, וצריך, לכן, הזמן בין הזרקת intradermal ליקוט אופטימיזציה.</li>
	<li>המקום לכל ליקטו העכבר על הגב ועל pin רגליה על-פני לוח השעם עטוף עם טישו נקי (איור 1D).</li>
	<li>שימוש במספריים קהים, עושים חתך אנכי של 3-4 ס מ בבטן התחתונה עד החזה של העכבר מת. עם מלקחיים, אזמל, להקניט משם את העור מפני משני האגפים כדי לחשוף את הצד הפנימי של הדרמיס ואתרים של הצטברות אוונס כחול (איור 1E). הצמד מטה והעור ולהסיר שומן מאזורים סביב האתר זליגת עם אזמל. אם נדרש, לצלם תמונה ייצוגית כדי להדגים את סדר הגודל של אוונס כחול דליפה לתוך העור.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים, אזמל, אזורי העור בלו הכוללת את הצבע הכחול אוונס דלף עבור כל אתר מוזרק עם הסוכן בתדר חדירות או רכב. הערה: לטפל כדי לסלק אזורים בגודל דומה של העור כדי לוודא כי ב- 4.7 עוקבות שלב, חלק דומה של אמצעי האחסון formamide להיות adsorbed על ידי כל מדגם העור, מתן אפשרות לצבוע שחולצו אלקליניים באמצעי אחסון דומה של formamide הנותרים . המפה הזרקת רשמת בשלב 3.5 נעזור להגדיר את האזור כדי להוציא.</li>
	<li>מקם כל מדגם לתוך צינור 1.5 mL ולאחר סיווגנו את זה בהתאם, מוודא שכל דוגמית מונח על החלק התחתון של הצינור. אחסן את הדגימות ב- 20 ° C עד שימוש נוסף. אם עיבוד מיד, בצע את השלבים שלהלן.</li>
	<li>הדגימות עור יבש לילה על ידי הנחת צינורות פתוח בתנור או לתוך הבאר של בלוק חימום-55 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>כדי לחלץ את צבען כחול אוונס, להוסיף 250 µL של formamide יונים הדגימות בשכונה fume, סגור את הצינורות. ודא כי הדגימות העור כולם מכוסים על-ידי formamide דגירה בין לילה תנור או בלוק חימום-55 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>צנטריפוגה דגימות ומפרידה benchtop במהירות מירבית (> g 10,000 x) למשך 40 דקות.</li>
	<li>בשכונה fume, להעביר µL 100 של תגובת שיקוע המכילות לצבוע כל מדגם לבאר נפרדים של צלחת 96-ובכן התחתון שטוח, שקוף (איור 2 א).</li>
	<li>מדד שיא ספיגת אוונס כחול-620 nm עם קריאת הפניה 740 nm ב ספקטרופוטומטרים. הערה: 620 ננומטר הוא ספיגת שיא של אוונס כחול, בעוד 740 ננומטר לא נספג על ידי אוונס כחול ומשמש אסמכתא אורך גל.</li>
	<li>ממוצע קריאות ספיגת של זריקות triplicate של אותו סוכן או רכב עבור כל עכבר לקחת בחשבון השתנות טכני (איור 2B).</li>
	<li>חישוב ההפרש קיפול של קריאות מהסוכן בתדר חדירות לעומת בקרת הרכב (איור 2C).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nagy, J. A., Benjamin, L., Zeng, H. Y., Dvorak, A. M., Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability,+vascular+hyperpermeability+and+angiogenesis.">Vascular permeability, vascular hyperpermeability and angiogenesis.</a> Angiogenesis. 11, 109-119 (2008).</li><li>Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+blood-brain+barrier.">Development of the blood-brain barrier.</a> Cell and Tissue Research. 314, 119-129 (2003).</li><li>Ruhrberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+and+shaping+the+vascular+tree:+multiple+roles+for+VEGF.">Growing and shaping the vascular tree: multiple roles for VEGF.</a> Bioessays. 25, 1052-1060 (2003).</li><li>Risau, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Endothelium.">Differentiation of Endothelium.</a> FASEB Journal. 9, 926-933 (1995).</li><li>Strbian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier+is+continuously+open+for+several+weeks+following+transient+focal+cerebral+ischemia.">The blood-brain barrier is continuously open for several weeks following transient focal cerebral ischemia.</a> Neuroscience. 153, 175-181 (2008).</li><li>Weis, S. M., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiological+consequences+of+VEGF-induced+vascular+permeability.">Pathophysiological consequences of VEGF-induced vascular permeability.</a> Nature. 437, 497-504 (2005).</li><li>Campochiaro, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+of+retinal+and+choroidal+vascular+diseases.">Molecular pathogenesis of retinal and choroidal vascular diseases.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 49, 67-81 (2015).</li><li>Aman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+Treatment+of+Edema+and+Endothelial+Barrier+Dysfunction+with+Imatinib.">Effective Treatment of Edema and Endothelial Barrier Dysfunction with Imatinib.</a> Circulation. , 126 (2012).</li><li>Claesson-Welsh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability-the+essentials.">Vascular permeability-the essentials.</a> Upsala J Med Sci. 120, 135-143 (2015).</li><li>Schulte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+the+VE-cadherin-catenin+complex+blocks+leukocyte+extravasation+and+vascular+permeability.">Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability.</a> Embo Journal. 30, 4157-4170 (2011).</li><li>Heinolainen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR3+Modulates+Vascular+Permeability+by+Controlling+VEGF/VEGFR2+Signaling.">VEGFR3 Modulates Vascular Permeability by Controlling VEGF/VEGFR2 Signaling.</a> Circulation Research. 120, (2017).</li><li>Eliceiri, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+requirement+for+Src+kinases+during+VEGF-induced+angiogenesis+and+vascular+permeability.">Selective requirement for Src kinases during VEGF-induced angiogenesis and vascular permeability.</a> Molecular Cell. 4, 915-924 (1999).</li><li>Sun, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR2+induces+c-Src+signaling+and+vascular+permeability+in+vivo+via+the+adaptor+protein+TSAd.">VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd.</a> Journal of Experimental Medicine. 209, 1363-1377 (2012).</li><li>Fantin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF165-induced+vascular+permeability+requires+NRP1+for+ABL-mediated+SRC+family+kinase+activation.">VEGF165-induced vascular permeability requires NRP1 for ABL-mediated SRC family kinase activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 214, 1049-1064 (2017).</li><li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR2+pY949+signalling+regulates+adherens+junction+integrity+and+metastatic+spread.">VEGFR2 pY949 signalling regulates adherens junction integrity and metastatic spread.</a> Nat Commun. 7, (2016).</li><li>Senger, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cells+secrete+a+vascular+permeability+factor+that+promotes+accumulation+of+ascites+fluid.">Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid.</a> Science. 219, 983-985 (1983).</li><li>Miles, A. A., Miles, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Reactions+to+Histamine,+Histamine-Liberator+and+Leukotaxine+in+the+Skin+of+Guinea-Pigs.">Vascular Reactions to Histamine, Histamine-Liberator and Leukotaxine in the Skin of Guinea-Pigs.</a> J Physiol-London. 118, 228-257 (1952).</li><li>Radu, M., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+Assay+to+Test+Blood+Vessel+Permeability.">An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability.</a> Jove-J Vis Exp. , e50062 (2013).</li><li>Roth, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-1+mediates+vascular+permeability+independently+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptor-2+activation.">Neuropilin-1 mediates vascular permeability independently of vascular endothelial growth factor receptor-2 activation.</a> Sci Signal. 9, (2016).</li><li>Acevedo, L. M., Barillas, S., Weis, S. M., Gothert, J. R., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+3A+suppresses+VEGF-mediated+angiogenesis+yet+acts+as+a+vascular+permeability+factor.">Semaphorin 3A suppresses VEGF-mediated angiogenesis yet acts as a vascular permeability factor.</a> Blood. 111, 2674-2680 (2008).</li><li>Teesalu, T., Sugahara, K. N., Kotamraju, V. R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-end+rule+peptides+mediate+neuropilin-1-dependent+cell,+vascular,+and+tissue+penetration.">C-end rule peptides mediate neuropilin-1-dependent cell, vascular, and tissue penetration.</a> P Natl Acad Sci USA. 106, 16157-16162 (2009).</li><li>Ho, V. C., Duan, L. J., Cronin, C., Liang, B. T., Fong, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Receptor-2+Abundance+Contributes+to+Increased+Angiogenesis+in+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Receptor-1-Deficient+Mice.">Elevated Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Abundance Contributes to Increased Angiogenesis in Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1-Deficient Mice.</a> Circulation. 126, (2012).</li><li>Chislock, E. M., Pendergast, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abl+Family+Kinases+Regulate+Endothelial+Barrier+Function+In+Vitro+and+in+Mice.">Abl Family Kinases Regulate Endothelial Barrier Function In Vitro and in Mice.</a> PLoS ONE. 8, e85231 (2013).</li><li>Busch, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+ketamine+on+hypoxic+pulmonary+vasoconstriction+in+the+isolated+perfused+lungs+of+endotoxaemic+mice.">Effects of ketamine on hypoxic pulmonary vasoconstriction in the isolated perfused lungs of endotoxaemic mice.</a> Eur J Anaesth. 27, 61-66 (2010).</li><li>Sinclair, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+physiological+effects+of+alpha2-agonists+related+to+the+clinical+use+of+medetomidine+in+small+animal+practice.">A review of the physiological effects of alpha2-agonists related to the clinical use of medetomidine in small animal practice.</a> Can Vet J. 44, 885-897 (2003).</li></ol>

המחברים יש אין אינטרסים סותרים להכריז.

מאז התיאור הראשון שלו בשנת 195217, וזמינותו Miles סיפקה חוקרים עם שיטה מהירה יחסית, פשוט ואמין לימוד המנגנון המולקולרי של hyperpermeability כלי הדם. לדוגמה, וזמינותו Miles שימש כדי לבחון את יכולת ו/או העוצמה של סוכנים שונים כדי לגרום hyperpermeability19,20,21 או כדי לבדוק את היעילות של hyperpermeability חוסמת סוכנים8 ,22,23. כדוגמה נוספת, סוכנים זירוז חדירות כלי דם נבדקו עכברים מהונדסים ובפקדים littermate שלהם כדי לקבוע את הדרישות של קולטנים ספציפיים ושידור transducing חלבונים המיועדים hyperpermeability הנוצרות על-ידי ליגנד תגובות10,11,12,13,14,15,20,23. מספר גרסאות אחרות של וזמינותו Miles מאז שימשו, לדוגמה ביחס רכיב המעקב בשימוש. לפיכך, כחול אוונס הוחלפה במחקרים מסוימים עם התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית dextrans בגדלים שונים או microspheres11,13.
היתרון העיקרי של וזמינותו Miles על מבחני אחרים על חקירת מנגנוני hyperpermeability כלי דם הוא כי זה יחסית קל לביצוע, אינה דורשת ציוד יקר. יתרה מזאת, כמו ויוו טכניקה, הדימום כלי הדם הזה מודלים assay בהקשר של כלי דם ללא פגע, בניגוד מדידה זליגת דרך במבחנה מבחני כגון טרנס ובכן השטף מבחני או טרנס אנדותל ההתנגדות החשמלית ( מבחני TEER), אשר מתמקדים, אך ורק, טפט אנדותל. מבחני חלופי ויוו של כלי הדם hyperpermeability עשוי להיות שונה וזמינותו Miles המתוארים כאן על-ידי ניצול נתיב אספקה שונים עבור הסוכן בתדר hyperpermeability או על ידי ניתוח כלי דם זליגת באתרים שונים, עבור דוגמה על ידי משלוח מערכתית של סוכן דרך הווריד של הזנב ואחריו בחינת בריחת הדם לריאות או את קנה הנשימה11,13,15. מגבלה אחת של וזמינותו Miles הוא הזרקה intradermal של סוכן מסוים מאי, עקרונית, גם להשפיע על לחץ הדם והזרימה בנוסף להפרעה המכשול אנדותל, לכן, להשפיע על חדירות כלי דם גם בעקיפין. בכל זאת, זה וזמינותו לאחרונה הוכח כדי למדוד את חדירות נימי הדם הנגרם על ידי VEGF-A ללא תלות תופעות לחץ דם סיסטמי15. מגבלה נוספת של Miles וזמינותו היא כי מיטות נימי הדם ברקמות שונות עלול להגיב בצורה שונה ל סוכנים קידום פרמאביליות, והתוצאות שתתקבלנה עם assay Miles העור, לפיכך, אינה בהכרח נציג, לדוגמה, מה מתרחש הריאות או המוח.
גיל ומשקל של בעל החיים עשויים להשפיע לדליפת שנצפתה Miles וזמינותו. כדי למזער את ההשפעה של משתנים אלה, חוקרים צריכים להשתמש הארנבונים מאותה או באופן דומה בגודל, בגילאי עכברים כפקדים. בעת הערכת מוטציות העכבר עבור גן מסוים של עניין, עכברים צריך להיווצר באמצעות משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים לעומת רבייה משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים אסטרטגיה, wildtype הארנבונים מאותה להשתמש כפקדים. יתר על כן, מומלץ להשתמש במהירות הפיך גז הרדמה, כגון איזופלוריין, כדי להימנע vasoconstriction, אשר תואר על איזשהו סם הרדמה מנוהל באמצעות זריקות parenteral24,25. ההזרקה של אוונס כחול לצבוע המזרק לרוחב זנב העכבר הוא שלב קריטי של פרוטוקול זה, יכולים להשפיע במידה רבה על איכות הניסוי והנתונים. לכן, חוקרים חייב להיות כשיר לבצע זריקות וריד הזנב ולהתנסות יהיה סביר צריך ניסיון קודם או תרגול לפני תחילת הקילומטרים וזמינותו. לחלופין, חוקרים יכולים להשתמש נתיבים אחרים תוך ורידי לספק אוונס כחול, כגון זריקה רטרו-מסלולית אם הם מנוסים עם זה. הזרקת intradermal של חדירות-קידום פתרונות יכולים לגרום נזק שאינו תלוי-סוכן על העור. לכן, זריקות intradermal לא יעלה על 20 µl בכרך, צריך תמיד להיות במעמד המדכא היסטמין, מנורמל כדי זריקות שליטה ברכב.
וזמינותו Miles שימש על ידי חוקרים רבים כדי להעריך את הרכיבים של VEGF-A מסלול איתות, לדוגמה, מאחר VEGF-A-induced חדירות כלי הדם גורמת מיימת ב סרטן המטופלים16 והראייה ופוגע בצקת neovascular מספר מחלת עיניים7. לכן, אנחנו ואחרים השתמשו וזמינותו Miles להשוות VEGF-A המושרה זליגת כלי הדם בעכברים ששונו גנטית חוסר רכיבים ספציפיים של VEGF-A איתות מדורגת12,13,14, 15 , 20 , 23. שלנו במחקר עדכני באמצעות גישה זו חשף כי הראשי פתולוגיים VEGF-A isoform, VEGF165, אותות באמצעות קומפלקס של VEGFR2 ו- NRP1, שבה התחום cytoplasmic NRP1 מקדם ABL בתיווך קינאז ההפעלה של kinases משפחה SRC כדי לעורר תגובה hyperpermeability14. VEGFA גם מעודד צמיחת כלי דם, יכול, לפיכך, לשמש רפואית כדי להחזיר את זרימת הדם לרקמות איסכמי אם פעילותה hyperpermeability יכול להיות מעוכבים באופן ספציפי. מחקר שחקרתי את המנגנון המולקולרי אשר מתווה את התגובות של VEGF תאי אנדותל כלי הדם לכיוון hyperpermeability כלי דם לכן, אולי, לזהות מסלולים זה ניתן לטפל באופן סלקטיבי כדי לעכב בצקת פתולוגית VEGF-A המושרה מחלות, כמו סרטן או מחלת עיניים איסכמי. וזמינותו Miles ללא ספק ימשיך להיות שיטה שימושית כדי לחזק אלה וכן סוגים רבים אחרים של מחקרים פונקציונלי התירי ווסתי מולקולרית ו effectors של hyperpermeability כלי הדם.

התפקיד העיקרי של מערכת הלב וכלי הדם היא לאפשר את המעבר של גזים, חומרים מזינים, הפסולת זרימת הדם ורקמות כל האיברים. כלי הדם יש איבר ספציפי רמות של חדירות הבזליים להתיר כזה חילופי1. למשל, כלי הדם בכליות הן מאוד חדיר, בעוד מחסום הדם מוח צורות ממשק חזק, בלתי חדיר מאוד2,3,4. תאי אנדותל בצורת הציפוי הפנימי של כלי הדם לספק מחסום פיזי בין זרימת הדם ורקמות הבסיסית, לווסת את חדירות נימי הדם באופן ספציפי איברים. עם זאת, גירויים מסוימים לגרום התמוטטות חלקי המכשול אנדותל להגדיל את extravasation נוזלים מן זרימת הדם לתוך interstitium מעל רמות הבסיס1. Hyperpermeability כזו נצפית, לדוגמה, באתרים של רקמות הטראומה, דלקת, גידולים, במהלך אלח דם, בעיניים עם neovascular המחלה או את המוח ואת הלב, כאשר רקמות איסכמיה מתרחשת עקב שבץ מוחי או אוטם שריר הלב, בהתאמה 5 , 6 , 7 , 8. כאשר גבוהות באופן כרוני, hyperpermeability מוביל בצקת, אשר בתורו גורם נזק לרקמות, כגון איבוד הראייה בעין מחלות9. לפיכך, מידול התגובה hyperpermeability כלי דם רצוי להבנת המנגנונים המגבירים חדירות אנדותל, כדי לבדוק את היעילות של סוכנים שנועדו לעכב את זה.
וזמינותו Miles היא טכניקה ומבוססת, נפוץ ופשוט יחסית המודד בריחת הדם ויוו כמידה הפונדקאית של hyperpermeability כלי הדם. אף-על-פי זה לא לוקח בחשבון גורמים אשר עשוי להגדיל את זליגת כלי הדם ללא תלות תקנה המכשול אנדותל, כגון לחץ דם או זרימת הדם, הרכבה וזמינותו Miles נחשב בדרך כלל כדי לספק שיטה אמינה כדי להעריך פעילות להתכוונן חדירות של חומרים ולזהות המתווכים איתות לקדם את פעילותם. בהתאם לכך, וזמינותו Miles כבר חלק בלתי נפרד מחקרים רבים אשר זיהו מתווכים של כלי הדם hyperpermeability ומנגנונים שלהם של פעולה10,11,12,13, 14,15, כגון צמיחה אנדותל כלי הדם VEGF-A זה במקור זוהה כגורם חדירות כלי דם VPF16.
פותח במקור על ידי קילומטרים על גבי קילומטרים ללמוד חדירות כלי דם שרקנים17, וזמינותו שלהם לאחר מכן הותאמה שימוש בעכברים, אשר כעת אורגניזם מודל של בחירה כדי להבהיר את המנגנונים המולקולריים של חדירות כלי דם תקנה עקב להתאמתם מעולה לבצע מניפולציות גנטיות. בקצרה, צבע כחול אוונס לווריד מוזרק עכברים בוגרים, מותר להסתובב במשך 30 דקות (איור 1). חדירות בתדר סוכנים לעומת בקרת הרכב לאחר מכן מוזרקים intradermally באתרים מרובים על התנגדותו האגפים של העכבר כדי לגרום לדליפת כלי הדם (איור 1). כתוצאה מכך, אלבומין מכורך אוונס כחול צבע extravasates, מצטבר בדרמיס (איור 1). לאחר בצורה הומאנית ליקוט העכבר אוונס הכחול מופק הדרמיס, הרמה של דליפת דם מחושב כיחס של מבחן חומר - על הרכב-induced צפיפות אופטית (איור 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="972">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:320px;">Pyrilamine maleate salt</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">P5514-5G</td>
			<td style="width:167px;">Resuspend in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Deionised Formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4117</td>
			<td>Use in fume cupboard</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microlance Needles 30g x 0.5&#34;</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sterile Plastipak 1ml Luer</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:320px;">Sterile MicroFine syriinges 0.3 ml - 8 mm - 30G&#160;</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>324826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Evans blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse restrainer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heat chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hair clippers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isoflurane</td>
			<td>Merial</td>
			<td>ap/drugs/220/96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Scalpal&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Blunt scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heatblock</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cork board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Benchtop refrigerated centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor 165</td>
			<td>Reliatech</td>
			<td>M30-004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating vascular hyperpermeability-inducing agents in the skin with the miles assay

התפקיד העיקרי של אנדותל כלי הדם אורגניזמים חוליות היא להוות חיץ בין הדם לבין כל רקמה בגוף, לפיה החדירות של אנדותל תאי דם, פלסמה מקרומולקולות של המים ניתן להתאים לפי צורך פיזיולוגי. במחלות מסוימות, ציטוקינים ו פקטורי גדילה משתחררים שכוונו המכשול אנדותל transiently להגדיל חדירות כלי דם; עם זאת, נוכחותם ממושך עלול לגרום hyperpermeability כלי דם כרוני ובצקת ובכך מזיקות-רקמות. וזמינותו Miles היא טכניקה ויוו המאפשר לחוקרים ללמוד hyperpermeability כלי דם דרך המדד proxy של זליגת כלי הדם. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט על איך לבצע הליך זה העכבר, המהווה אורגניזם מודל הנפוצה ביותר ללמוד בתרבית של פיזיולוגיה פתולוגיה. ההליך כרוך את תוך ורידיות צבען כחול אוונס לתייג את אלבומין במחזור ואחריו מספר זריקות intradermal של סוכנים בתדר חדירות ופתרונות בקרת רכב לתוך מנוגדות האגפים של העכבר. כתוצאה מכך, צבע כחול אוונס דליפות בהדרגה לתוך הדרמיס, איפה זה מצטבר, ניתן לחילוץ על כימות כמו זליגת המושרה על ידי הסוכן בתדר חדירות ביחס הרכב. וזמינותו Miles ניתן לבצע גם פראי סוג או גנטית שונה עכבר מודלים, יכול להיות משולב עם והתרופות האמריקני ללמוד המנגנונים המולקולריים לווסת את חדירות כלי הדם, לזהות סוכנים/מטרות מסוגל גרימת או חסימת hyperpermeability.

השתמשנו וזמינותו Miles כדי להעריך את היכולת של VEGF-A כדי לגרום דליפת דם ביחס בקרת הרכב (PBS) בעכברים C57/Bl6 wildtype. . הנה, אנחנו מראים ניסוי נציג שימוש בעכברים wildtype מגורה עם הזרקת intradermal בפתרון 20 µL המכיל 50 ng של VEGF-A PBS או הרכב הציבורי בלבד. עלייה ברורה אוונס זליגת צבע כחול בדגימות העור הזריקו VEGF-A בהשוואה ל- PBS היה לכאורה בחיי עיר (איור 1E) ואחרי החילוץ של לצבוע ב- formamide (איור 2 א). כימות של ניסויים מרובים ממחישה את זה 50 ng של VEGF-A גורם באופן משמעותי יותר אוונס זליגת כחול מאשר PBS לבד (איור 2B), עם ממוצע מקופלים ל- 3 לודיג זליגת וסקולרית לעומת הרכב (איור 2C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig1.jpg"> איור 1: אינדוקציה של זליגת וסקולרית וזמינותו Miles. ייצוג סכמטי (לוחות העליון) ותמונות המתאים (לוחות התחתון) של השלבים רציפים בעת ביצוע וזמינותו Miles העכבר. (א) Pyrilamine maleate מוזרק intraperitoneally כדי למנוע השחרור של היסטמין אנדוגני 10-30 דקות לפני (B) ורידיות 100 µl % 1 אוונס כחול לזנב הווריד של העכבר. (ג) 30 דקות מאוחר יותר, כלי הדם זליגת הנגרמת על ידי הזרקת intradermal של הסוכן (50 ng של VEGF-A; ירוק עיגולים) לעומת בקרת הרכב (PBS; עיגולים לבנים). (D, E) כדי לגשת לאתרים של הצטברות אוונס כחול, העכבר שנקצרו 20 דקות לאחר הזריקות intradermal, העור של משני האגפים גזור, ריתקה. i.p.: בקרום הבטן; עירוי: תוך ורידי; תעודת זהות: intradermal; גודל ברים, 1 ס מ. <a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig2.jpg"> איור 2: כימות של זליגת וסקולרית וזמינותו Miles. צבע כחול מחולצים formamide של דגימות עור המתקבל כל זריקה intradermal באיור 1, נטען לתוך צלחת 96-ובכן עבור ספיגת קורא עם ספקטרופוטומטרים אוונס (A). (ב, ג) ייצוג גרפי של המקראות ספיגת של ניסויים מרובים על-ידי התוויית גם ערכים (ב') ספיגת מנורמל (צפיפות אופטית, יתר) של שני בתדר חדירות סוכן (VEGF-A; כהה ירוק עיגולים), רכב (PBS; אפור עיגולים), או (ג) לקפל את שינוי OD עבור הסוכן לעומת הרכב (קווי שגיאה: SEM). קריאות ספיגת של triplicate PBS ודוגמאות של VEGF המוצגים באותיות (A) בממוצע, שמוצג (B, C) כעיגולים לבן או ירוק, בהתאמה. <a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay at JoVE.com

Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

כאן, אנו מציגים פרוטוקול למדוד לדליפת דם הנגרם על ידי המינהל intradermal מהסוכנים קידום חדירות לתוך העור מאתר. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לקבוע את היכולת של מולקולות מקדמים או מעכבים זליגת וסקולרית או לחקור את המנגנונים המולקולריים המסדירים חדירות כלי דם.

הערכת סוכנים בתדר Hyperpermeability כלי דם בעור עם וזמינותו Miles

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby ...

Research

JoVE Journal

Biology

Construction and Implantation of a Microinfusion System for Sustained Delivery of Neuroactive Agents.

הבינוי השרשה של מערכת Microinfusion לאספקה ​​מתמשכת של סוכני Neuroactive.

Sustained delivery of neuroactive agents is widely used in neuroscience, but poses many technical challenges. It is necessary to deliver the agent with ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

Assay Clonogenic: תאים חסיד

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount עבור ניתוח immunohistochemical vasculature לימב עובריים עור: מערכת מודל לחקר המורפוגנזה מסעף דם בעובר

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

התמיינות של תאי העור של עכבר יילוד נגזר גזע לתאים דמוי נבט<em&gt; במבחנה</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

בידוד של תאי שריר חלק Murine כלילית דם

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

הערכה של תגובתיות וסקולרית באמצעות העורקים המבודדים הבודדים באמצעות התמקדות באפנון על ידי פריסקולרית של הרקמות

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic ...

Deep Vascular Imaging in the Eye with Flow-Enhanced Ultrasound

הדמיה וסקולרית עמוקה בעין עם אולטרסאונד משופר בזרימה

The retina within the eye is one of the most energy-demanding tissues in the body and thus requires high rates of oxygen delivery from a rich blood ...

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

הדמיה הידבקות מולקולרית בתא מתגלגל על ידי הידבקות טביעת רגל אסאי

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

יישום של תנועת ראש פסיבית ליצירת תאוצות מוגדרות בראשי מכרסמים

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

בידוד תאי שריר חלק לבביים וכלי דם מדגי זברה בוגרים, צעירים, זחליים ועובריים למחקרים אלקטרופיזיולוגיים

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...