Name: evaluating vascular hyperpermeability-inducing agents in the skin with the miles assay
Uploaded: 2018-06-19T13:30:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay at JoVE.com

Vi takker Laura Denti, Valentina Senatore og ansatte på biologiske ressurser enheten i UCL Institute of Ophthalmology for hjelp med musen husbandry og Camille Charoy for kundestøtte. Dette arbeidet ble støttet av Medical Research Council stipend (MR/N011511/1) C. Ruhrberg og en British Heart Foundation PhD studentship til JT issørpe (FS/13/59/30649).

Alle dyr arbeid ble utført etter UK Home Office og institusjonelle retningslinjer for Animal Welfare og etiske gjennomgang kroppen (AWERB).
1. musen forberedelse
Merk: Utføre eksperimenter på voksen mus i minst 8 uker gammel, opp til 6 måneders alder. For å vise tekniske reproduserbarhet og konsekvent timing for hvert trinn i denne prosedyren mellom forskjellige dyr, kan du bruke minimum 2 og maksimalt 6 mus for hver eksperimentelle økt. For å evaluere effekten av en mutasjon på en permeabilitet-inducing substans i genmodifiserte mus, benytt 2 mutant mus og 2 littermate kontroller per eksperimenter.
<ol><li>24 timer før stimulerende vaskulær hyperpermeability, bedøve mus ved hjelp av en passende innånding bedøvende som isoflurane. Bruk 3% isoflurane for anestesi induksjon før rettende refleks er tapt og musen svarer ikke på eksterne stimuli. Bruke 1,5% isoflurane for anestesi vedlikehold (sikre at musen har konstant åndedretts priser). Under narkose, nøye barbere både flanken av hver musen med en elektrisk barbermaskin, unngå skader på huden. Merk: Anestesi brukes til å unngå stress til dyret og å minimere bevegelse under barbering, som kan medføre skade huden.</li>
	<li>Tilbake barbert musen til buret sitt hjem. For mannlige mus, plassere hver mann i en individuell bur etter anestesi utvinning å forhindre kamper, og derfor skade huden. For kvinnelige mus, returnere dem i en gruppe til deres hjem bur. Merk: Hvis en kamp atferd er observert blant mannlige mus i buret, før prosedyren, skille dem i individuelle bur for 3 dager før forsøket å tillate hud skader å helbrede.</li>
	<li>Overvåke musene før de gjenvinne bevissthet (vanligvis innen noen få sekunder) og flytte rundt buret (vanligvis innen 1 min).</li>
</ol>2. intravenøs injeksjon av Evans blå farge
<ol><li>I en laminær strømning skap, Forbered separat sterilt løsninger histamin hemmer pyrilamine maleate (4 µg/µL i 0,9% saltvann) og Evans blå farge (1% w/v i 0,9% saltvann). Sterilisere av løsningene passerer filtere 22 µm.</li>
	<li>Bruk en steril 1 mL sprøyte med en 30 G nål for å injisere intraperitoneally hver musen med 10 µL pyrilamine maleate løsning/gram kroppsvekt (figur 1A). Utføre injeksjon, først scruff musen og deretter vippe den slik at hodet er rettet mot bakken og magen går oppover. Sette inn i lavere kvadrantene av magen fra midtlinjen å unngå å treffe blæren. Merk: Vekten av mus mellom 8 uker og 6 måneders alder vanligvis varierer mellom 15 og 30 g. Pyrilamine maleate vil hemme frigjøring av endogene histamin, som ellers ville fremme vaskulær lekkasje uavhengig agent skal testes.</li>
	<li>Plass musen i et 37 ° C varme kammer for 10 min å fremme vasodilatasjon. Alternativt bruke en egnet varmelampe fokusert på halen for å fremme vasodilatasjon hvis bruk av en varmelampe tillates av lokal etiske retningslinjer.</li>
	<li>Flytte en musen samtidig til en mus restrainer og gni halen med 70% etanol å rengjøre injeksjonsstedet området og fremme vasodilatasjon.</li>
	<li>Bruk en steril 1 mL sprøyte med en 30G nål administrere 100 µL Evans blått fargestoff intravenøst gjennom halen åre (figur 1B). Umiddelbart bruke press på injeksjonsstedet ved holder halen mellom en finger og tommel å hindre blødning. Merk: Visualisering av halen venen kan forbedres ved å dirigere lamplight til injeksjonsstedet området. Ytterligere detaljer på utfører intravenøs injeksjoner i musen halen venen kan finnes i en publisert protokollen18.</li>
	<li>Tillate fargestoff å sirkulere i 30 min.</li>
</ol>3. stimuler vaskulær Hyperpermeability
<ol><li>Med sterilt løsninger i en laminær strømning CAB fortynne permeabilitet-inducing agent av interesse for en konsentrasjon som lar siste dosen leveres i et volum på 20 µL. Merk: I eksemplet eksperimentet vist i figur 1-figur 2, VEGFA til å stimulere vaskulær hyperpermeability i en konsentrasjon av 2,5 ng/µL i PBS, gir en total dose av 50 ng og PBS brukes som et kjøretøy kontroll.</li>
	<li>Legg permeabilitet-inducing agent av interesse og kjøretøy kontroll i 2 separate sterilt 300 µL sprøyter med en 31 G nål. Laste inn tilstrekkelig løsning å injisere hver musen med 20 µL av løsningen i tre eksemplarer (dvs. forberede 60 µL av agent og kjøretøy per musen, pluss ekstra volum for å ta hensyn til nålens død volum).</li>
	<li>Bedøve første musen å bli testet med isoflurane (3% for anestesi induksjon før rettende refleks er tapt og musen svarer ikke på eksterne stimuli og 1,5% for anestesi vedlikehold, sørge for at musen har konstant åndedretts priser).</li>
	<li>Intradermally injisere 20 µL av permeabilitet-fremme agent i flanken av musen (figur 1 c). Kontroller at nålen er i en vinkel på 15° til huden. Sjekk for dannelsen av en hevet boble i huden som indikerer en vellykket injeksjon. Gjenta intradermal injeksjon på 2 flere nettsteder, en minst 1 cm fra hverandre.</li>
	<li>Slå for å avdekke 2 flanken og gjenta tre eksemplarer injeksjoner med kontroll kjøretøy løsningen. Registrere på papir plasseringen av hver injeksjonsstedet å lette deres identifikasjon for påfølgende samling av hud prøver. Merk: Håndtere musen huden med forsiktighet på dette stadiet; for eksempel unngå å klemme fin huden når du utfører intradermal injeksjoner.</li>
	<li>Returnere injisert musen til buret sitt hjem og overvåke musen før den gjenoppretter bevissthet (vanligvis innen noen få sekunder) og flytter rundt buret.</li>
	<li>Mens den første mus gjenoppretter, umiddelbart Gjenta trinn 3.3 og 3,5 med andre musa, og så videre (opptil 6 mus maksimalt per økt). Registrere tid hver musen ble injisert for å justere tiden vil fortsette til neste trinn.</li>
</ol>4. kvantifisering av akkumulert Evans blå i Dermis
<ol><li>Innhente hver musen av cervical forvridning 20 min etter at den har mottatt intradermal injeksjoner, observere samme rekkefølge hvor musene ble injisert. Merk: Varigheten av vaskulær lekkasje kan variere permeabilitet-inducing agent brukt, og derfor tiden mellom intradermal injeksjon og culling må optimalisere.</li>
	<li>Sted hver Hentet musen på baksiden og pin føttene på en kork-bord pakket med en ren vev (figur 1 d).</li>
	<li>Bruke sløv saks, lage en loddrett snitt ca 3-4 cm fra nedre del av magen til brystet av død mus. Med tang og skalpell, erte bort huden fra begge flankene å avsløre innsiden av dermis og nettsteder av Evans blå opphopning (figur 1E). PIN ned løs huden og fjerne fett fra regionene rundt lekkasje området med en skalpell. Hvis nødvendig, ta et representativt bilde å demonstrere omfanget av Evans blå lekkasje inn i huden.</li>
	<li>Bruke tang og skalpell, avgiftsdirektoratet huden områder består av lekkasje Evans blå farge for hvert område injisert med permeabilitet-inducing agent eller kjøretøy. Merk: Pass på at avgiftsdirektoratet tilsvarende store områder av huden for å sikre at på den påfølgende trinnet 4,7, en tilsvarende del av det formamide volumet vil være adsorbert av hver hud prøve, slik at den utpakkede fargestoffet fortynnes i en lignende mengde gjenværende formamide . Injeksjon kartet registrert i trinn 3.5 vil hjelpe definerer området til kreditert.</li>
	<li>Plasser hvert utvalg i en 1,5 mL tube og merket det tilsvarende, gjør at hvert utvalg hviler på bunnen av røret. Lagre prøver på - 20 ° C til fremme bruk. Hvis behandling umiddelbart, følger du trinnene nedenfor.</li>
	<li>Tørr hud prøver over natten ved å åpne rør i en ovn eller av en oppvarming blokk på 55 ° C.</li>
	<li>Til ekstrakt Evans blå farge, legge til 250 µL av deionisert formamide eksemplene i avtrekksvifte, nær rørene. Kontroller at huden prøvene er alle dekket av formamide og ruge over natten i en ovn eller en oppvarming blokk på 55 ° C.</li>
	<li>Sentrifuge prøver en Borstemmaskin sentrifuge med maksimal hastighet (> 10 000 x g) i 40 minutter.</li>
	<li>Avtrekksvifte, overføre 100 µL fargestoff inneholder nedbryting av fra hver prøve inn i en egen brønn av en gjennomsiktig, flat bunn 96-brønns plate (figur 2A).</li>
	<li>Mål peak Evans blå absorbans ved 620 nm med en referanse lesning av 740 nm på et spektrofotometer. Merk: 620 nm er toppen av Evans blå absorbansen, mens 740 nm ikke absorberes av Evans blå og fungerer som en referanse bølgelengde.</li>
	<li>Gjennomsnittlig absorbansen målingene av tre eksemplarer injeksjoner av samme agent eller kjøretøy for hver musen å ta hensyn til tekniske variasjon (figur 2B).</li>
	<li>Beregne kaste forskjellen opplesning permeabilitet-inducing agent versus kjøretøy kontroll (figur 2C).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nagy, J. A., Benjamin, L., Zeng, H. Y., Dvorak, A. M., Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability,+vascular+hyperpermeability+and+angiogenesis.">Vascular permeability, vascular hyperpermeability and angiogenesis.</a> Angiogenesis. 11, 109-119 (2008).</li><li>Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+blood-brain+barrier.">Development of the blood-brain barrier.</a> Cell and Tissue Research. 314, 119-129 (2003).</li><li>Ruhrberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+and+shaping+the+vascular+tree:+multiple+roles+for+VEGF.">Growing and shaping the vascular tree: multiple roles for VEGF.</a> Bioessays. 25, 1052-1060 (2003).</li><li>Risau, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Endothelium.">Differentiation of Endothelium.</a> FASEB Journal. 9, 926-933 (1995).</li><li>Strbian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier+is+continuously+open+for+several+weeks+following+transient+focal+cerebral+ischemia.">The blood-brain barrier is continuously open for several weeks following transient focal cerebral ischemia.</a> Neuroscience. 153, 175-181 (2008).</li><li>Weis, S. M., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiological+consequences+of+VEGF-induced+vascular+permeability.">Pathophysiological consequences of VEGF-induced vascular permeability.</a> Nature. 437, 497-504 (2005).</li><li>Campochiaro, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+of+retinal+and+choroidal+vascular+diseases.">Molecular pathogenesis of retinal and choroidal vascular diseases.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 49, 67-81 (2015).</li><li>Aman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+Treatment+of+Edema+and+Endothelial+Barrier+Dysfunction+with+Imatinib.">Effective Treatment of Edema and Endothelial Barrier Dysfunction with Imatinib.</a> Circulation. , 126 (2012).</li><li>Claesson-Welsh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability-the+essentials.">Vascular permeability-the essentials.</a> Upsala J Med Sci. 120, 135-143 (2015).</li><li>Schulte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+the+VE-cadherin-catenin+complex+blocks+leukocyte+extravasation+and+vascular+permeability.">Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability.</a> Embo Journal. 30, 4157-4170 (2011).</li><li>Heinolainen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR3+Modulates+Vascular+Permeability+by+Controlling+VEGF/VEGFR2+Signaling.">VEGFR3 Modulates Vascular Permeability by Controlling VEGF/VEGFR2 Signaling.</a> Circulation Research. 120, (2017).</li><li>Eliceiri, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+requirement+for+Src+kinases+during+VEGF-induced+angiogenesis+and+vascular+permeability.">Selective requirement for Src kinases during VEGF-induced angiogenesis and vascular permeability.</a> Molecular Cell. 4, 915-924 (1999).</li><li>Sun, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR2+induces+c-Src+signaling+and+vascular+permeability+in+vivo+via+the+adaptor+protein+TSAd.">VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd.</a> Journal of Experimental Medicine. 209, 1363-1377 (2012).</li><li>Fantin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF165-induced+vascular+permeability+requires+NRP1+for+ABL-mediated+SRC+family+kinase+activation.">VEGF165-induced vascular permeability requires NRP1 for ABL-mediated SRC family kinase activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 214, 1049-1064 (2017).</li><li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR2+pY949+signalling+regulates+adherens+junction+integrity+and+metastatic+spread.">VEGFR2 pY949 signalling regulates adherens junction integrity and metastatic spread.</a> Nat Commun. 7, (2016).</li><li>Senger, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cells+secrete+a+vascular+permeability+factor+that+promotes+accumulation+of+ascites+fluid.">Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid.</a> Science. 219, 983-985 (1983).</li><li>Miles, A. A., Miles, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Reactions+to+Histamine,+Histamine-Liberator+and+Leukotaxine+in+the+Skin+of+Guinea-Pigs.">Vascular Reactions to Histamine, Histamine-Liberator and Leukotaxine in the Skin of Guinea-Pigs.</a> J Physiol-London. 118, 228-257 (1952).</li><li>Radu, M., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+Assay+to+Test+Blood+Vessel+Permeability.">An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability.</a> Jove-J Vis Exp. , e50062 (2013).</li><li>Roth, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-1+mediates+vascular+permeability+independently+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptor-2+activation.">Neuropilin-1 mediates vascular permeability independently of vascular endothelial growth factor receptor-2 activation.</a> Sci Signal. 9, (2016).</li><li>Acevedo, L. M., Barillas, S., Weis, S. M., Gothert, J. R., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+3A+suppresses+VEGF-mediated+angiogenesis+yet+acts+as+a+vascular+permeability+factor.">Semaphorin 3A suppresses VEGF-mediated angiogenesis yet acts as a vascular permeability factor.</a> Blood. 111, 2674-2680 (2008).</li><li>Teesalu, T., Sugahara, K. N., Kotamraju, V. R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-end+rule+peptides+mediate+neuropilin-1-dependent+cell,+vascular,+and+tissue+penetration.">C-end rule peptides mediate neuropilin-1-dependent cell, vascular, and tissue penetration.</a> P Natl Acad Sci USA. 106, 16157-16162 (2009).</li><li>Ho, V. C., Duan, L. J., Cronin, C., Liang, B. T., Fong, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Receptor-2+Abundance+Contributes+to+Increased+Angiogenesis+in+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Receptor-1-Deficient+Mice.">Elevated Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Abundance Contributes to Increased Angiogenesis in Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1-Deficient Mice.</a> Circulation. 126, (2012).</li><li>Chislock, E. M., Pendergast, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abl+Family+Kinases+Regulate+Endothelial+Barrier+Function+In+Vitro+and+in+Mice.">Abl Family Kinases Regulate Endothelial Barrier Function In Vitro and in Mice.</a> PLoS ONE. 8, e85231 (2013).</li><li>Busch, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+ketamine+on+hypoxic+pulmonary+vasoconstriction+in+the+isolated+perfused+lungs+of+endotoxaemic+mice.">Effects of ketamine on hypoxic pulmonary vasoconstriction in the isolated perfused lungs of endotoxaemic mice.</a> Eur J Anaesth. 27, 61-66 (2010).</li><li>Sinclair, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+physiological+effects+of+alpha2-agonists+related+to+the+clinical+use+of+medetomidine+in+small+animal+practice.">A review of the physiological effects of alpha2-agonists related to the clinical use of medetomidine in small animal practice.</a> Can Vet J. 44, 885-897 (2003).</li></ol>

Forfatterne har ingen motstridende interesser å erklære.

Siden første beskrivelsen i 195217har Miles analysen gitt forskerne en relativt rask, enkel og pålitelig metode for å studere molekylære mekanismer for vaskulær hyperpermeability. For eksempel er Miles analysen brukt til å teste evne og/eller styrken på forskjellige agenter å indusere hyperpermeability19,20,21 , eller for å teste effekten av hyperpermeability blokkerer agenter8 ,22,23. Eksempel har agenter som induserer vaskulær permeabilitet blitt testet i genmodifiserte mus og deres littermate kontroller å bestemme kravene til spesifikke reseptorer og signal transducing proteiner for ligand-indusert hyperpermeability svar10,11,12,13,14,15,20,23. Flere modifiserte versjoner av Miles analysen har siden blitt brukt, for eksempel med hensyn til tracer brukes. Dermed har Evans blå blitt erstattet i noen studier med fluorescens-merket dextrans av forskjellige størrelser eller mikrosfærer11,13.
Den største fordelen med Miles analysen over andre analyser for å undersøke vaskulær hyperpermeability mekanismer er at det er relativt enkelt å utføre og krever ikke dyrt utstyr. Som en i vivo teknikk, denne analysen modeller vaskulær lekkasje i sammenheng med intakt blodkar, i motsetning til måle lekkasje gjennom søk i vitro som trans vel flux analyser eller trans endothelial motstand ( TEER) analyser, som fokuserer kun på endothelial monolayer. Alternativ i vivo -analyser av vaskulær hyperpermeability avvike fra Miles analysen beskrevet her ved å bruke en annen levering rute for den hyperpermeability-inducing eller ved å analysere vaskulær lekkasje på ulike steder, for eksempel av systemisk levering av en agent via hale venen etterfulgt av vaskulær lekkasje eksamen i lungene eller spor11,13,15. En begrensning av Miles analysen er at intradermal injeksjon av visse agenter kan i prinsippet også påvirke blodtrykket og flyt i tillegg til endotelial barriere avbrudd og derfor påvirke vaskulær permeabilitet også indirekte. Likevel denne analysen har nylig blitt vist å måle vaskulær permeabilitet av VEGF-A uavhengig av effekter på systemisk blodtrykk15. En annen begrensning Miles analysen er at vaskulær senger i ulike vev kan reagere forskjellig på permeabilitet-fremme agenter og resultatene som oppnås med en Miles analysen i huden kan derfor ikke representant, for eksempel av hva som skjer i den lunge eller hjernen.
Dyrets alder og vekt kan påvirke lekkasje i Miles analysen. For å minimere effekten av disse variablene, forskere bør bruke littermates eller tilsvarende størrelse og alderen mus som kontroller. Når vurdere musen mutanter for en bestemte genet av interesse, skal mus genereres gjennom en heterozygote mot heterozygote avl strategi og wildtype littermates som kontroller. Videre er det tilrådelig å bruke raskt reversibel gass anestesi, som isoflurane, å unngå vasokonstriksjon, som har blitt beskrevet for noen bedøvende narkotika administreres via parenteral injeksjoner24,25. Injeksjon av Evans blått fargestoff i musen lateral hale venen er et viktig skritt i denne protokollen og kan sterkt påvirke kvaliteten eksperiment og dataene. Dermed forskere må være kompetent utfører hale blodåre injeksjoner og vil trolig må tidligere erfaring eller praksis før begynnelsen Miles analysen eksperimentere. Forskerne kan også bruke andre intravenøs ruter for å levere Evans blå, for eksempel retro-orbital innsetting hvis de har erfaring med den. Intradermal injeksjon av permeabilitet-fremme løsninger kan forårsake agent-uavhengig skade huden. Derfor bør intradermal injeksjoner bør ikke overstige 20 µl i volum, alltid være utført i nærvær av den histamin inhibitor og normalisert til kjøretøy kontroll injeksjoner.
Miles analysen er brukt av mange forskere for å evaluere komponentene i den VEGF-A signalveien, for eksempel fordi VEGF-A-indusert vaskulær permeabilitet forårsaker ascites i kreft pasienter16 og visjon-svekke ødem i flere neovascular øye sykdom7. Derfor har vi og andre brukt Miles analysen sammenligne VEGF-A indusert vaskulær lekkasje i mus som har blitt genmodifisert for å mangler bestemte komponenter i den VEGF-A signalnettverk gjennomgripende12,13,14, 15 , 20 , 23. vår siste studien bruker denne tilnærmingen viste at den viktigste patologisk VEGF-A isoformen, VEGF165, signaler gjennom et kompleks av VEGFR2 og NRP1, der NRP1 cytoplasmatiske domenet fremmer ABL kinase-mediert aktivering av SRC familie kinaser å fremkalle et hyperpermeability svar14. VEGFA også fremmer blodkar vekst og kan derfor brukes terapeutisk å gjenopprette blodsirkulasjonen iskemiske vev hvis hyperpermeability virksomheten kan bli hemmet spesielt. Forskning Klargjørende den molekylære mekanismen som styrer VEGF-A svar av vaskulær endotelceller mot vaskulær hyperpermeability kan derfor identifisere veier som kan manipuleres til selektivt for å hemme patologisk VEGF-A indusert ødem i sykdommer som kreft eller iskemiske øyesykdom. Miles analysen vil utvilsomt være en nyttig metode for å underbygge disse og mange andre typer funksjonelle studier for å belyse molekylær regulatorer og effektor av vaskulær hyperpermeability.

Hovedfunksjonen til det kardiovaskulære systemet er å muliggjøre overføring av gasser, næringsstoffer og avfallsprodukter mellom sirkulasjon og vev i alle organer. Blodkar har organ-spesifikke nivåer av basale permeabilitet å tillate slike utvekslinger1. For eksempel er blodkar i nyre svært permeable, mens blod-hjernebarrieren danner en tett, svært ugjennomtrengelig grensesnitt2,3,4. Endotelceller som danner den indre foring av blodårer gir en fysisk barriere mellom sirkulasjon og underliggende vev og regulere vaskulær permeabilitet i et organ-spesifikk måte. Men føre visse stimuli en delvis oversikt over endothelial barrieren for å øke den flytende bloduttredelse fra sirkulasjonen i interstitium over den basale nivåer1. Slike hyperpermeability er observert, for eksempel på områder av vev traumer, i betennelse, i svulster, under sepsis, i øyne med neovascular sykdom eller i hjernen og hjertet, når vev iskemi oppstår pga et slag eller hjerteinfarkt, henholdsvis 5 , 6 , 7 , 8. Når kronisk opphøyet, hyperpermeability fører til ødem, som igjen fører til skade på vev, som tap av syn i øye sykdom9. Dermed er modellering vaskulær hyperpermeability svaret ønskelig for å forstå mekanismene som øker endothelial permeabilitet og teste effekten av midler som for å hindre dette.
Miles analysen er en veletablert, brukte og relativt enkel teknikk som måler vaskulær lekkasje i vivo som et surrogat mål av vaskulær hyperpermeability. Selv om det ikke tar hensyn til sammensatte faktorer som kan øke vascular lekkasje uavhengig endothelial barriere regulering, som blodtrykk eller blodstrøm, Miles analysen er generelt antatt en pålitelig metode å evaluere den permeabilitet-modulerende aktiviteten av stoffer og identifisere signalnettverk meglere som fremmer deres virksomhet. Følgelig Miles analysen har blitt integrert i flere studier har identifisert meglere av vaskulær hyperpermeability og deres mekanismer handling10,11,12,13, 14,15, som vaskulær endotelial vekstfaktor VEGF-en som ble opprinnelig identifisert som vaskulær permeabilitet faktor VPF16.
Opprinnelig utviklet av Miles og Miles for å studere vaskulær permeabilitet i marsvin17, ble deres analysen deretter tilpasset å bruke mus, som er nå modell organismen ønsker å belyse molekylære mekanismer av vaskulær permeabilitet regulering på grunn av deres utsøkte egnethet til genetisk manipulasjon. Kort, Evans blått fargestoff er intravenøst injisert i voksen mus og tillatt å sirkulere i 30 minutter (figur 1). Permeabilitet-inducing agenter versus kjøretøy kontroll er deretter intradermally injisert i flere områder på motstridende flanken av musen å indusere vaskulær lekkasje (figur 1). Følgelig albumin-bundet Evans blå farge extravasates og akkumuleres i dermis (figur 1). Etter Human culling musen, Evans blå er Hentet fra dermis og nivået av vaskulær lekkasje beregnes som et forhold mellom test å bilen-stoffinduserte optisk tetthet (figur 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="972">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:320px;">Pyrilamine maleate salt</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">P5514-5G</td>
			<td style="width:167px;">Resuspend in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Deionised Formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4117</td>
			<td>Use in fume cupboard</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microlance Needles 30g x 0.5&#34;</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sterile Plastipak 1ml Luer</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:320px;">Sterile MicroFine syriinges 0.3 ml - 8 mm - 30G&#160;</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>324826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Evans blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse restrainer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heat chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hair clippers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isoflurane</td>
			<td>Merial</td>
			<td>ap/drugs/220/96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Scalpal&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Blunt scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heatblock</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cork board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Benchtop refrigerated centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor 165</td>
			<td>Reliatech</td>
			<td>M30-004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating vascular hyperpermeability-inducing agents in the skin with the miles assay

Hovedfunksjonen til vaskulære endotelet i virveldyr organismer er å fungere som en barriere mellom blod og hvert vev av kroppen, der permeabilitet av endotelet blod celler, plasma makromolekyler og vann kan tilpasses i henhold til fysiologiske behov. I visse sykdommer, er cytokiner og vekst faktorer utgitt som mål endothelial barrieren for å øke transiently vaskulær permeabilitet; men kan deres langvarig tilstedeværelse føre til kronisk vaskulær hyperpermeability og dermed vev-skadelige ødem. Miles analysen er en i vivo teknikk som tillater forskere å studere vaskulær hyperpermeability gjennom proxy måling av vaskulær lekkasje. Her gir vi en detaljert protokoll om hvordan du utfører denne fremgangsmåten i musen, som er den mest brukte modell organismen pattedyrceller fysiologi og patologi. Prosedyren innebærer intravenøs injeksjon av Evans blått fargestoff til etiketten sirkulerende albumin etterfulgt av flere intradermal injeksjoner av permeabilitet-inducing agenter og kjøretøy kontrolløsninger i motstridende flanken av musen. Evans blått fargestoff lekkasjer derfor gradvis inn i dermis, hvor det akkumuleres og kan hentes for kvantifisering som lekkasje av permeabilitet-inducing agent i forhold til bilen. Miles analysen kan utføres i vill type eller genetisk endret musen modeller og kan kombineres med narkotika-administrasjonen for å studere molekylære mekanismer som regulerer vaskulær permeabilitet og identifisere agenter/mål kan indusere eller blokkerer hyperpermeability.

Vi brukte Miles analysen for å vurdere muligheten av VEGF-A for å indusere vaskulær lekkasje i forhold til kjøretøy kontroll (PBS) i wildtype C57/Bl6 mus. Her viser vi en representant eksperiment wildtype mus stimulert med intradermal injeksjon av 20 µL løsning som inneholder 50 ng VEGF-a PBS eller kjøretøy PBS bare. En klar økning i Evans blått fargestoff lekkasje i huden prøver injisert med VEGF-en forhold til PBS var tydelig i situ (figur 1E) og etter utvinning av fargestoff i formamide (figur 2A). Kvantifisering av flere eksperimenter illustrerer at 50 ng VEGF-a betydelig induserer mer Evans blå lekkasje enn PBS alene (figur 2B), med en gjennomsnittlig 3-fold økning i vaskulær lekkasje sammenlignet kjøretøy (figur 2C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig1.jpg"> Figur 1: induksjon av vaskulær lekkasje i Miles analysen. Skjematisk fremstilling (topp panel) og tilsvarende bilder (bunnen panel) av de sekvensielle trinnene når du utfører Miles analysen i musen. (A) Pyrilamine maleate injiseres intraperitoneally for å hindre utslipp av endogene histamine 10 til 30 minutter før (B) intravenøs injeksjon av 100 µl 1% Evans blå i halen vene museklikk. (C) 30 min senere, vascular lekkasje er indusert av intradermal injeksjon av agent (50 ng av VEGF-A; grønne sirkler) versus kjøretøy kontroll (PBS, hvite sirkler). (D, E) For å få tilgang nettstedene til Evans blå akkumulering, musen er hentet 20 minutter etter intradermal injeksjoner og huden av både flankene dissekert og låste ned. IP: intraperitoneal; IV: intravenøs; ID: intradermal; skalere barer, 1 cm. <a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig2.jpg"> Figur 2: kvantifisering av vaskulær lekkasje i Miles analysen. (A) Evans blått fargestoff trekkes i formamide fra hud prøver innhentet fra hver intradermal injeksjon i figur 1 og lastet inn i en 96-brønns plate for absorbansen ved avlesning med et spektrofotometer. (B, C) Grafisk fremstilling av absorbansen målingene fra flere eksperimenter ved å plotte enten (B) normalisert absorbansen verdier (optisk tetthet, OD) av begge permeabilitet-inducing agent (VEGF-A; mørke grønne sirkler) og kjøretøy (PBS, grå sirkler), eller (C) fold endre i OD for agent versus kjøretøy (feilfelt: SEM). Absorbansen målingene av tre eksemplarer PBS og VEGF-A eksempler vist i (A) er gjennomsnitt og vist i (B, C) som hvite eller grønne sirkler, henholdsvis. <a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay at JoVE.com

Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

Her presenterer vi en protokoll for å måle vaskulær lekkasje av intradermal administrasjon av permeabilitet fremme agenter i murine huden. Denne teknikken kan brukes til å fastslå muligheten til molekyler å fremme eller hemme vaskulær lekkasje eller studere molekylære mekanismer som regulerer vaskulær permeabilitet.

Evaluere vaskulær Hyperpermeability-inducing agenter i huden med Miles analysen

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby ...

Research

JoVE Journal

Biology

Construction and Implantation of a Microinfusion System for Sustained Delivery of Neuroactive Agents.

Sustained delivery of neuroactive agents is widely used in neuroscience, but poses many technical challenges. It is necessary to deliver the agent with ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differensiering av nyfødte mus Skin Avledet stamceller inn Germ-lignende celler<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Isolering av Murine Coronary vaskulære glatte muskelceller

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

Vurdering av vaskulær tone respons ved hjelp av isolerte Chrezbryzheechno arterier med fokus på modulering av inflammasjon fettvev

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic ...

Deep Vascular Imaging in the Eye with Flow-Enhanced Ultrasound

Dyp vaskulær avbildning i øyet med strømningsforbedret ultralyd

The retina within the eye is one of the most energy-demanding tissues in the body and thus requires high rates of oxygen delivery from a rich blood ...

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

Bildemolekylær vedheft i cellerulling ved adhesjonsfotavtrykkanalyse

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Påføring av passiv hodebevegelse for å generere definerte akselerasjoner ved gnagernes hoder

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Isolering av hjerte- og vaskulære glatte muskelceller fra voksen, juvenil, larve og embryonal sebrafisk for elektrofysiologiske studier

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...