Name: evaluating vascular hyperpermeability-inducing agents in the skin with the miles assay
Uploaded: 2018-06-19T13:30:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay at JoVE.com

Мы благодарим Лаура Denti, Валентины семья Senatore и сотрудники отдела биологических ресурсов в UCL Института офтальмологии для помочь с мыши животноводства и Камилла Charoy для технической поддержки. Эта работа была поддержана грантом Совета медицинских исследований (MR/N011511/1) C. Ruhrberg и Британский фонд PhD сердце студенчества в ДжТ дерзкий (FS/13/59/30649).

Все животные работа была проведена после UK Home Office и институциональных руководящих принципов животных и этические обзор тела (AWERB).
1. мышь подготовка
Примечание: Выполните эксперименты на взрослых мышей, по крайней мере в 8 недель возраста, до 6 месяцев. Для того чтобы продемонстрировать технической воспроизводимости и последовательной синхронизации для каждого шага этой процедуры между различными животными, используйте минимум 2 и максимум 6 мышей для каждой экспериментальной сессии. Для оценки эффекта мутации на проницаемость заставить вещество в генетически измененных мышей, в идеале, используйте 2 мутантных мышей и 2 помёте управления за эксперименты.
<ol><li>за 24 часа до стимулирования сосудистой hyperpermeability, анестезировать мышей с использованием подходящего ингаляционного анестетика например изофлюрановая. Используйте 3% изофлюрановая для индукции анестезии, до тех пор, пока восстанавливающих рефлекс теряется, и мышь не реагирует на внешние раздражители. Использование изофлюрановая 1,5% для поддержания анестезии (убедитесь, что мышь имеет постоянные респираторные ставки). Под наркозом тщательно побриться оба фланки каждой мыши с электрической бритвы, избегая повреждений на коже. Примечание: Анестезия используется во избежание вызывает стресс для животного и свести к минимуму движение во время бритья, который может привести к повреждению кожи.</li>
	<li>Вернуть его домой клетку бритая мыши. Для самцов мышей, место каждый мужчина в индивидуальной клетке после анестезии восстановления для предотвращения боевых действий и, таким образом, повреждения кожи. Для самок мышей вернуть их в группе их дома клетке. Примечание: Если боевых поведение наблюдается у мышей-самцов в клетке, перед процедурой, разделите их на отдельные клетки за 3 дня до эксперимента, чтобы позволить потенциального повреждения кожи для того излечить.</li>
	<li>Монитор мыши до тех пор, пока они восстановить сознание (обычно в течение нескольких секунд) и двигаться вокруг клетки (обычно в течение 1 мин).</li>
</ol>2. внутривенные инъекции Эванс синий краситель
<ol><li>В поток Ламинарный шкаф Подготовьте отдельные стерильные растворы малеата pyrilamine ингибитора гистамина (4 мкг/мкл в 0,9% физиологического раствора) и Эванс синий краситель (1% w/v в 0,9% физиологического раствора). Стерилизуйте, передавая решения через фильтр 22 мкм.</li>
	<li>Используйте стерильные 1 мл шприц с иглой 30 G придать внутрибрюшинно каждая мышь с 10 мкл pyrilamine малеата раствор/грамм веса тела (рис. 1A). Для выполнения инъекций, во-первых, загривок мыши и затем наклонить ее, так что голова направлена на земле и живот направлена вверх. Внедрить в нижних квадрантах живота от срединной линии, чтобы избежать поражения мочевого пузыря. Примечание: Вес мышей от 8 недель и 6 месяцев возраст обычно колеблется между 15 и 30 г Pyrilamine малеата помешает выпуска эндогенного гистамина, которая в противном случае будет способствовать сосудистые утечки независимо от агента для проверки.</li>
	<li>Поместите курсор мыши в камере тепла 37 ° C 10 мин для содействия вазодилатации. В качестве альтернативы используйте подходящий тепла лампы сосредоточена на хвост для продвижения вазодилатация если разрешает использование тепла лампы местные этические принципы.</li>
	<li>Переместить одну мышь одновременно мыши фиксатор и втирать хвост с 70% этанола для очистки области инъекции и далее содействовать вазодилатации.</li>
	<li>Использовать 1 мл стерильного шприца с иглой 30G для администрирования 100 мкл Эванс синий краситель внутривенно через Вену хвост (рис. 1B). Немедленно примените давление в месте инъекции, удерживая хвост между палец и большой палец, чтобы предотвратить кровотечение. Примечание: Визуализация хвост вены может быть улучшена путем направления Ламплайт к области инъекции. Более подробная информация о выполнении внутривенной инъекции в Вену хвост мыши можно найти в опубликованном протокол18.</li>
	<li>Разрешить краситель распространить на 30 мин.</li>
</ol>3. стимулировать сосудистой Hyperpermeability
<ol><li>С помощью стерильных растворов в поток Ламинарный шкаф, разбавляют проницаемость заставить агент интерес к концентрации, которая позволяет окончательный дозу, чтобы быть доставлены в объеме 20 мкл. Примечание: В эксперименте пример, показанный на рис. 1-рис. 2, VEGFA используется для стимулирования сосудистой hyperpermeability в концентрации 2,5 нг/мкл в PBS, уступая общая доза 50 нг, и PBS используется как элемент управления транспортного средства.</li>
	<li>Загрузите агент проницаемость побуждение интереса и управления транспортным средством в 2 отдельные стерильные шприцы 300 мкл с иглой 31 G. Загрузить достаточным решение придать каждой мыши с 20 мкл раствора в трех экземплярах (т.е. Подготовка 60 мкл агента и автомобиль мыши, плюс дополнительный объем для учета мертвого объема иглы).</li>
	<li>Анестезировать первые мыши, чтобы быть протестированы с изофлюрановая (3% для индукции анестезии до тех пор, пока выпрямляющий рефлекс теряется, и мышь не реагирует на внешние раздражители и 1,5% для поддержания анестезии, убедившись, что мышь имеет постоянные респираторные ставки).</li>
	<li>Intradermally inject 20 мкл проницаемость содействие агента в бочку мыши (рис. 1 c). Убедитесь, что иглу под углом 15° к коже. Проверка для формирования поднял пузырь внутри кожи, который указывает на Успешный инъекции. Повторите внутрикожные инъекции на 2 дополнительных сайтов, не менее 1 см друг от друга.</li>
	<li>Включите мышь, чтобы разоблачить 2 фланка и повторить тройные инъекции с решением управления транспортного средства. Запись на бумаге положение каждой инъекции для облегчения их идентификации для последующего сбора образцов кожи. Примечание: Ручка мыши кожи с осторожностью на данном этапе; например Избегайте, щипал кожу при выполнении внутрикожные инъекции.</li>
	<li>Вернуть его домой клетку вводят мыши и контролировать мыши до тех пор, пока он восстанавливает сознание (обычно в течение нескольких секунд) и движется вокруг клетки.</li>
	<li>Хотя первая мышь восстанавливает, сразу повторите шаги 3.3 и 3.5 мышью второй, и так далее (до 6 мышей максимально за сеанс). Вести учет времени, которое каждый мыши вводили скорректировать время, когда приступить к последующим шагом.</li>
</ol>4. Количественная оценка накопленных Эванс синий внутри дермы
<ol><li>Отбирать каждой мыши, вывих шейного 20 мин, после того, как она получила внутрикожные инъекции, наблюдения за тот же порядок, в котором вводили мышам. Примечание: Продолжительность сосудистые утечки могут варьироваться в зависимости от проницаемости заставить агент используется, и, следовательно, время между внутрикожные инъекции и забой может потребоваться оптимизация.</li>
	<li>Место каждого взятые мышь на его спину и ноги на доске Корк завернутый с чистой ткани (рис. 1 d) PIN-код.</li>
	<li>С помощью тупыми ножницами, сделайте вертикальный разрез приблизительно 3-4 см от нижней части живота до груди мертвых мыши. С щипцами и скальпеля дразнить от кожи с обоих флангов раскрыть с внутренней стороны дермы и сайты Эванс синий накопления (Рисунок 1E). Придавить дряблая кожа и удалить жир из регионов вокруг места утечки с помощью скальпеля. При необходимости, принять представителя фото чтобы продемонстрировать масштабы утечки Эванс синий в кожу.</li>
	<li>С помощью щипцов и скальпеля, акцизных кожи регионов, состоящий из утечка Эванс синий краситель для каждого сайта вводится с проницаемость заставить агент или транспортного средства. Примечание: Будьте осторожны, чтобы акцизных аналогичных размеров регионов кожи, чтобы убедиться, что на последующий шаг 4.7, аналогичные часть объема формамид будет поглощаться, каждый образец кожи, позволяя извлеченные краска быть разведен в аналогичного объема оставшихся формамид . Инъекции карты, записанный на шаге 3.5 поможет определить области, чтобы быть вырезан.</li>
	<li>Место каждого образца в 1,5 мл трубку и помечены соответственно, убедившись, что каждый образец лежит в нижней части трубки. Храните образцы на уровне - 20 ° C до дальнейшего использования. Если обработка немедленно, выполните следующие действия.</li>
	<li>Сухой кожи образцов в одночасье, поместив открытые трубы в духовке или в колодец Отопление блока при 55 ° C.</li>
	<li>Чтобы извлечь Эванс синий краситель, 250 мкл дейонизированной формамид образцов в Зонта, закрыть трубы. Убедитесь, образцы кожи покрываются формамида и инкубировать на ночь в духовке или Отопление блока при 55 ° C.</li>
	<li>Центрифугуйте образцы в настольная центрифуга на максимальной скорости (> 10 000 x g) 40 мин.</li>
	<li>В Зонта передачи 100 мкл краситель содержащих супернатант от каждого образца в отдельную скважину прозрачный, плоская 96-луночных днище (рисунок 2A).</li>
	<li>Мера пик поглощения Эванс синий в 620 нм с чтением ссылка 740 нм на спектрофотометре. Примечание: 620 Нм достигается пик Эванс синий поглощения, хотя 740 нм не поглощается Эванс синий и действует как ссылка волны.</li>
	<li>Средняя чтениях поглощения тройные инъекции же агент или транспортного средства для каждой мыши для учета технических изменчивости (рис. 2B).</li>
	<li>Вычислите разницу раза чтений от проницаемости заставить агент против управления транспортного средства (рис. 2 c).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nagy, J. A., Benjamin, L., Zeng, H. Y., Dvorak, A. M., Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability,+vascular+hyperpermeability+and+angiogenesis.">Vascular permeability, vascular hyperpermeability and angiogenesis.</a> Angiogenesis. 11, 109-119 (2008).</li><li>Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+blood-brain+barrier.">Development of the blood-brain barrier.</a> Cell and Tissue Research. 314, 119-129 (2003).</li><li>Ruhrberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+and+shaping+the+vascular+tree:+multiple+roles+for+VEGF.">Growing and shaping the vascular tree: multiple roles for VEGF.</a> Bioessays. 25, 1052-1060 (2003).</li><li>Risau, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Endothelium.">Differentiation of Endothelium.</a> FASEB Journal. 9, 926-933 (1995).</li><li>Strbian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier+is+continuously+open+for+several+weeks+following+transient+focal+cerebral+ischemia.">The blood-brain barrier is continuously open for several weeks following transient focal cerebral ischemia.</a> Neuroscience. 153, 175-181 (2008).</li><li>Weis, S. M., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiological+consequences+of+VEGF-induced+vascular+permeability.">Pathophysiological consequences of VEGF-induced vascular permeability.</a> Nature. 437, 497-504 (2005).</li><li>Campochiaro, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+of+retinal+and+choroidal+vascular+diseases.">Molecular pathogenesis of retinal and choroidal vascular diseases.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 49, 67-81 (2015).</li><li>Aman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+Treatment+of+Edema+and+Endothelial+Barrier+Dysfunction+with+Imatinib.">Effective Treatment of Edema and Endothelial Barrier Dysfunction with Imatinib.</a> Circulation. , 126 (2012).</li><li>Claesson-Welsh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability-the+essentials.">Vascular permeability-the essentials.</a> Upsala J Med Sci. 120, 135-143 (2015).</li><li>Schulte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+the+VE-cadherin-catenin+complex+blocks+leukocyte+extravasation+and+vascular+permeability.">Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability.</a> Embo Journal. 30, 4157-4170 (2011).</li><li>Heinolainen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR3+Modulates+Vascular+Permeability+by+Controlling+VEGF/VEGFR2+Signaling.">VEGFR3 Modulates Vascular Permeability by Controlling VEGF/VEGFR2 Signaling.</a> Circulation Research. 120, (2017).</li><li>Eliceiri, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+requirement+for+Src+kinases+during+VEGF-induced+angiogenesis+and+vascular+permeability.">Selective requirement for Src kinases during VEGF-induced angiogenesis and vascular permeability.</a> Molecular Cell. 4, 915-924 (1999).</li><li>Sun, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR2+induces+c-Src+signaling+and+vascular+permeability+in+vivo+via+the+adaptor+protein+TSAd.">VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd.</a> Journal of Experimental Medicine. 209, 1363-1377 (2012).</li><li>Fantin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF165-induced+vascular+permeability+requires+NRP1+for+ABL-mediated+SRC+family+kinase+activation.">VEGF165-induced vascular permeability requires NRP1 for ABL-mediated SRC family kinase activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 214, 1049-1064 (2017).</li><li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR2+pY949+signalling+regulates+adherens+junction+integrity+and+metastatic+spread.">VEGFR2 pY949 signalling regulates adherens junction integrity and metastatic spread.</a> Nat Commun. 7, (2016).</li><li>Senger, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cells+secrete+a+vascular+permeability+factor+that+promotes+accumulation+of+ascites+fluid.">Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid.</a> Science. 219, 983-985 (1983).</li><li>Miles, A. A., Miles, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Reactions+to+Histamine,+Histamine-Liberator+and+Leukotaxine+in+the+Skin+of+Guinea-Pigs.">Vascular Reactions to Histamine, Histamine-Liberator and Leukotaxine in the Skin of Guinea-Pigs.</a> J Physiol-London. 118, 228-257 (1952).</li><li>Radu, M., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+Assay+to+Test+Blood+Vessel+Permeability.">An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability.</a> Jove-J Vis Exp. , e50062 (2013).</li><li>Roth, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-1+mediates+vascular+permeability+independently+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptor-2+activation.">Neuropilin-1 mediates vascular permeability independently of vascular endothelial growth factor receptor-2 activation.</a> Sci Signal. 9, (2016).</li><li>Acevedo, L. M., Barillas, S., Weis, S. M., Gothert, J. R., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+3A+suppresses+VEGF-mediated+angiogenesis+yet+acts+as+a+vascular+permeability+factor.">Semaphorin 3A suppresses VEGF-mediated angiogenesis yet acts as a vascular permeability factor.</a> Blood. 111, 2674-2680 (2008).</li><li>Teesalu, T., Sugahara, K. N., Kotamraju, V. R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-end+rule+peptides+mediate+neuropilin-1-dependent+cell,+vascular,+and+tissue+penetration.">C-end rule peptides mediate neuropilin-1-dependent cell, vascular, and tissue penetration.</a> P Natl Acad Sci USA. 106, 16157-16162 (2009).</li><li>Ho, V. C., Duan, L. J., Cronin, C., Liang, B. T., Fong, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Receptor-2+Abundance+Contributes+to+Increased+Angiogenesis+in+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Receptor-1-Deficient+Mice.">Elevated Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Abundance Contributes to Increased Angiogenesis in Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1-Deficient Mice.</a> Circulation. 126, (2012).</li><li>Chislock, E. M., Pendergast, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abl+Family+Kinases+Regulate+Endothelial+Barrier+Function+In+Vitro+and+in+Mice.">Abl Family Kinases Regulate Endothelial Barrier Function In Vitro and in Mice.</a> PLoS ONE. 8, e85231 (2013).</li><li>Busch, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+ketamine+on+hypoxic+pulmonary+vasoconstriction+in+the+isolated+perfused+lungs+of+endotoxaemic+mice.">Effects of ketamine on hypoxic pulmonary vasoconstriction in the isolated perfused lungs of endotoxaemic mice.</a> Eur J Anaesth. 27, 61-66 (2010).</li><li>Sinclair, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+physiological+effects+of+alpha2-agonists+related+to+the+clinical+use+of+medetomidine+in+small+animal+practice.">A review of the physiological effects of alpha2-agonists related to the clinical use of medetomidine in small animal practice.</a> Can Vet J. 44, 885-897 (2003).</li></ol>

Авторы имеют не конфликтующие интересы объявить.

Начиная с его первого описания в 1952 году17миль пробирного предоставил исследователей относительно быстрый, простой и надежный метод для изучения молекулярных механизмов сосудистой hyperpermeability. К примеру пробирного км был использован для тестирования способности и/или потенции различных агентов побудить hyperpermeability19,,2021 или проверить эффективность блокирующих агентов hyperpermeability8 ,22,23. В качестве другого примера агенты, которые индуцируют сосудистой проницаемости были протестированы в генетически измененных мышей и их помёте контроля для определения требования специфических рецепторов и сигнал преобразователя белков для лиганд индуцированной hyperpermeability ответы10,11,12,13,14,15,,2023. Несколько модифицированные версии пробирного км с тех пор были использованы, например в отношении трассировщик используется. Таким образом синий Эванс был заменен в некоторых исследованиях с флуоресцировани обозначенного декстраны разных размеров или микросферы11,13.
Основным преимуществом км пробирного над другими анализов для изучения сосудистой hyperpermeability механизмов является что он сравнительно легко выполнить и не требует дорогого оборудования. Кроме того, как в естественных условиях технику, пробирного модели сосудистые утечки в контексте нетронутыми кровеносных сосудов, в отличие от измерения утечки через в vitro assays такие как транс хорошо анализов потока или транс эндотелиальной электрического сопротивления ( ТЕЕР) анализов, которые сосредоточены, исключительно, на эндотелиальных монослоя. Альтернативные в vivo анализов сосудистой hyperpermeability может отличаться от пробирного км, описанных здесь, используя другой поставки маршрут для hyperpermeability заставить агент или анализируя сосудистые утечки на разных сайтах, для Пример системного доставки агента через Вену хвост, следуют сосудистые утечки экзамен в легкие и трахею11,,1315. Одно ограничение анализа км является что внутрикожного введения некоторых агентов может в принципе, также влияют на артериальное давление и потока в дополнение к нарушению эндотелиальный барьер и, таким образом, также косвенно влиять сосудистой проницаемости. Тем не менее, этот assay недавно было показано для измерения проницаемости сосудов, вызванный VEGF-A независимо от воздействия на15системного артериального давления. Другое ограничение анализа км является, что сосудистые кровати в разных тканях могут реагировать по-разному проницаемость содействие агентов и результаты, полученные с Пробирной миль в коже таким образом, не могут представителя, например, того, что происходит в легких и мозга.
Возраст и вес животного может повлиять утечки, наблюдается в assay км. Чтобы свести к минимуму эффект этих переменных, исследователи должны использовать однопометники или аналогичным образом размера и возрасте мышей как элементы управления. При оценке мутантов мыши для определенного гена интереса, мышей должны создаваться через гетерозиготных против гетерозиготных разведения стратегии и wildtype однопометники, используемых как элементы управления. Кроме того желательно использовать анестетики быстро обратимых газа, таких как изофлюрановая, чтобы избежать вазоконстрикция, который был описан для некоторых обезболивающий препарат через парентеральной инъекции24,25. Инъекции Эванс синий краситель в Вену боковых хвост мыши является важным шагом в этом протоколе и значительно влияют на качество данных и эксперимент. Таким образом исследователи должны быть компетентными в выполнении инъекции Вену хвост и будет скорее всего нужно предварительного опыта и практики до начала анализа мили эксперимент. Кроме того исследователи можно использовать другие внутривенного маршруты доставить Эванс синий, как ретро орбиталь инъекций, если они знакомы с ним. Внутрикожные инъекции проницаемость поощрение решения могут вызвать агента независимые повреждения кожи. Таким образом подкожные инъекции не должен превышать 20 мкл в томе следует всегда осуществляться в присутствии ингибитора гистамина и нормализации транспортного средства управления инъекции.
Assay км был использован многими исследователями для оценки компонентов сигнальный путь VEGF-А, к примеру, потому что VEGF-A-индуцированной проницаемости сосудов вызывает асцит в раковых больных16 и видение уменьшается отек в нескольких неоваскулярной болезни глаз7. Таким образом мы и другие использовали пробирного км для сравнения VEGF-A индуцированных сосудистые утечки в мышей, которые были генетически изменены отсутствия конкретных компонентов VEGF-А сигнальный Каскад12,13,14, 15 , 20 , 23. нашего недавнего исследования, используя этот подход показал, что основные патологические изоформы VEGF-A, VEGF165, сигналы через комплекс VEGFR2 и NRP1, в котором NRP1 цитоплазматических доменов способствует ABL киназы опосредованной активации SRC семьи киназ чтобы вызвать hyperpermeability ответ14. VEGFA также способствует росту кровеносных сосудов и таким образом, можно терапевтически восстановления кровотока к ишемии тканей, если свою hyperpermeability деятельность может быть специально тормозится. Исследования, изучение молекулярного механизма, который Бычков VEGF-A ответы сосудистый эндотелиальных клеток к сосудистой hyperpermeability может таким образом, определить пути, которые могут управляться избирательно подавляют патологических VEGF-A индуцированной отек заболеваний таких как рак или ишемической болезни глаз. Assay км несомненно будет продолжать быть полезным методом для подкрепления этих и многих других видов функциональных исследований для выяснения молекулярно регуляторы и эффекторы сосудистой hyperpermeability.

Основная функция сердечно-сосудистой системы является возможность передачи газов, питательных веществ и отходов между циркуляции и тканей во всех органах. Кровеносные сосуды имеют органоспецифическая уровень базальной проницаемости разрешить такие обмены1. К примеру кровеносные сосуды в почках высокой проницаемостью, в то время как гематоэнцефалический барьер образует плотный, высоко непроницаемый интерфейс2,3,4. Эндотелиальные клетки, которые формируют внутренней оболочки сосудов обеспечивают физический барьер между циркуляции и подлежащих тканей и регулировать сосудистой проницаемости органоспецифическая образом. Однако определенные стимулы вызывают частичное разбивка эндотелиальный барьер для увеличения жидкости кровоподтек из обращения в интерстиции выше Базальные уровни1. Такие hyperpermeability наблюдается, например, на участках ткани травмы, воспаления, в опухоли, во время сепсиса, в глазах с неоваскулярной болезни или в мозг и сердце, когда ишемии тканей происходит из-за инсульта или инфаркта миокарда, соответственно 5 , 6 , 7 , 8. когда хронически повышенным, hyperpermeability приводит к отек, который в свою очередь вызывает повреждение тканей, таких как потеря зрения глаз болезни9. Таким образом моделирование ответ сосудистой hyperpermeability желательно, для понимания механизмов, которые повышают проницаемость эндотелия и проверить эффективность агентов, предназначенных для подавления этого.
Assay км является устоявшейся, часто используемые и относительно простой метод, который меры сосудистые утечки в естественных условиях в качестве суррогата измерения сосудистой hyperpermeability. Даже несмотря на то, что это не принимать во внимание, усугубляющие факторы, которые могут увеличить сосудистые утечки независимо от регулирования эндотелиальный барьер, например артериального давления или поток крови, пробирного км считается, что обеспечивают надежный метод для оценки проницаемость модулирует активность веществ и определения сигналов посредников, которые способствуют их деятельности. Соответственно, пробирного км был неотъемлемой частью многочисленные исследования, которые выявили посредников сосудистой hyperpermeability и их механизмы действий10,11,12,13, 14,15, таких как Сосудистый эндотелиальный фактор роста VEGF-A, первоначально была определена в качестве коэффициента проницаемости сосудов VPF16.
Первоначально разработанный мили и мили для изучения сосудистой проницаемости в морских свинок17, их пробирного была впоследствии адаптирована к с помощью мышей, которые в настоящее время модель организма выбора для выяснения молекулярных механизмов сосудистой проницаемости правила из-за их изысканный пригодности для генетических манипуляций. Вкратце Эванс синий краситель внутривенно вводят в взрослых мышей и позволило распространить на 30 минут (рис. 1). Проницаемость-возбудителей против управления транспортного средства затем intradermally вводят в нескольких сайтов на противоположных склонах мыши, чтобы побудить сосудистые утечки (рис. 1). Следовательно альбумин прыгните Эванс синий краситель extravasates и накапливается в дерму (рис. 1). После гуманно забой мыши, Эванс синий извлекается из дермы и уровень сосудистые утечки рассчитывается как отношение теста вещество - для транспортных средств индуцированной оптической плотности (рис. 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="972">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:320px;">Pyrilamine maleate salt</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">P5514-5G</td>
			<td style="width:167px;">Resuspend in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Deionised Formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4117</td>
			<td>Use in fume cupboard</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microlance Needles 30g x 0.5&#34;</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sterile Plastipak 1ml Luer</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:320px;">Sterile MicroFine syriinges 0.3 ml - 8 mm - 30G&#160;</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>324826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Evans blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse restrainer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heat chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hair clippers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isoflurane</td>
			<td>Merial</td>
			<td>ap/drugs/220/96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Scalpal&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Blunt scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heatblock</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cork board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Benchtop refrigerated centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor 165</td>
			<td>Reliatech</td>
			<td>M30-004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating vascular hyperpermeability-inducing agents in the skin with the miles assay

Основная функция эндотелия в позвоночных организмов является служить барьер между кровью и каждой ткани тела, whereby проницаемость эндотелия клетки крови, плазмы макромолекул и вода могут быть адаптированы согласно физиологические потребности. В некоторых заболеваний факторов роста и цитокинов выпускаются ориентированные эндотелиальный барьер временно увеличить проницаемость сосудов; Однако их длительное присутствие может привести к хронической сосудистой hyperpermeability и таким образом повреждение тканей отек. Assay км является техника в естественных условиях , которая позволяет исследователям изучить сосудистой hyperpermeability через прокси измерения сосудистые утечки. Здесь мы предоставляем подробный протокол о том, как выполнить эту процедуру в мышь, которая является наиболее широко используется модель организма для изучения млекопитающих физиологии и патологии. Процедура включает в себя внутривенным введением Эванс синий краситель для обозначения циркулирующего альбумина, последовали несколько внутрикожные инъекции проницаемости возбудителей и решения управления транспортного средства на противоположных склонах мыши. Следовательно Эванс синий краситель постепенно просачивается в дерме, где он накапливается и могут быть извлечены для количественной оценки как утечки, вызванных проницаемость заставить агент относительно транспортного средства. Миль может быть выполнена в дикого типа или генетически изменения мыши модели и могут быть объединены с лекарствами для изучения молекулярных механизмов, которые регулируют проницаемость сосудов и определить агенты/цели способны заставить или блокирование hyperpermeability.

Мы использовали пробирного км для оценки способности VEGF-A побудить сосудистые утечки относительно транспортного средства управления (PBS) у мышей C57/Bl6 wildtype. Здесь, мы покажем представитель эксперимент с использованием wildtype мышей стимулируется с внутрикожного введения 20 мкл раствора, содержащего 50 нг VEGF-a в PBS или автомобиль PBS только. Четкое увеличение Эванс синий краситель течи в образцах кожи, вводят с VEGF-A по сравнению с PBS было очевидным в situ (Рисунок 1E) и после извлечения красителя в формамид (рис. 2A). Количественная оценка нескольких экспериментов показывают, что 50 нг VEGF-a значительно стимулирует более Эванс, синий утечки чем PBS только (рис. 2B), в среднем 3 раза увеличить в сосудистые утечки, по сравнению с транспортного средства (рис. 2 c).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig1.jpg"> Рисунок 1: индукция сосудистые утечки в assay км. Схематическое представление (верхней панели) и соответствующие изображения (нижней панели) последовательных шагов при выполнении анализа миль в мыши. (A) Pyrilamine малеата вводили внутрибрюшинно для предотвращения высвобождения эндогенного гистамина 10 до 30 минут до (B) внутривенным введением 100 мкл 1% Эванс синий в хвост вен мыши. (C) 30 минут спустя, сосудистые утечки индуцируется внутрикожные инъекции агента (50 нг VEGF-a; зеленые круги) против контроля транспортных средств (PBS; белые круги). (D, E) Для доступа к сайтам Эванс синий накопления, мышь выбраковки 20 минут после внутрикожные инъекции и кожи обоих флангов расчлененные и возлагали. и.п.: внутрибрюшинного; и.в.: внутривенно; и.д.: внутрикожные; масштаб баров, 1 cm. <a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig1large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig2.jpg"> Рисунок 2: количественная оценка сосудистые утечки в assay км. (A) Эванс, синяя краска добывается в формамид от кожных проб полученные от каждого внутрикожные инъекции на рисунке 1 и загружаются в 96-луночных пластина для поглощения, чтение с спектрофотометром. (B, C) Графическое представление поглощения чтений из нескольких экспериментов путем построения либо (B) нормализованных поглощения значения (оптической плотности, OD) как заставить проницаемость агента (VEGF-A; темно зеленые круги) и автомобиля (PBS; серый кругах), или (C) раз изменения в ОД для агента по сравнению с транспортного средства (планки погрешностей: SEM). Поглощение показания трех экземплярах PBS и VEGF-A образцы показано на (A) в среднем и показано в (B, C) как белые и зеленые круги, соответственно. <a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay at JoVE.com

Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

Здесь мы представляем протокол для измерения сосудистые утечки, вызванных внутрикожные администрации проницаемости содействие агентов в мышиных кожу. Этот метод может использоваться для определения способности молекул содействовать или препятствовать сосудистые утечки или изучать молекулярные механизмы, которые регулируют проницаемость сосудов.

Оценке сосудистых Hyperpermeability-возбудителей в коже с Assay км

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby ...

Research

JoVE Journal

Biology

Construction and Implantation of a Microinfusion System for Sustained Delivery of Neuroactive Agents.

Строительство и Имплантация Microinfusion системы для устойчивой доставки агентов Neuroactive.

Sustained delivery of neuroactive agents is widely used in neuroscience, but poses many technical challenges. It is necessary to deliver the agent with ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

Клоногенных Пробирной: прилипшие клетки

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Всего монтажа иммуногистохимического анализа для Эмбриональные сосудистой кожи конечностей: модельная система для исследования сосудистой Ветвление Морфогенез в зародыше

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Дифференциация новорожденных кожи мышей стволовые клетки в зародышевые-подобных клеток<em&gt; В пробирке</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Выделение мышиной коронарных сосудов клетках гладкой мускулатуры

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

Оценка сосудистого тонуса реагирования с использованием изолированных Мезебарных артерий с акцентом на модуляции Периваскулярных жировых тканей

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic ...

Deep Vascular Imaging in the Eye with Flow-Enhanced Ultrasound

Глубокая сосудистая визуализация в глазу с помощью ультразвука с усилением потока

The retina within the eye is one of the most energy-demanding tissues in the body and thus requires high rates of oxygen delivery from a rich blood ...

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

Визуализация молекулярной адгезии в клеточной прокатке с помощью анализа адгезионного следа

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Применение пассивного движения головы для генерации определенных ускорений на головах грызунов

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Выделение сердечных и сосудистых гладкомышечных клеток из взрослых, ювенильных, личиночных и эмбриональных рыбок данио для электрофизиологических исследований

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...