Name: evaluating vascular hyperpermeability-inducing agents in the skin with the miles assay
Uploaded: 2018-06-19T13:30:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay at JoVE.com

Vi tackar Laura Denti, Valentina Senatore och personalen i den biologiska resurser enheten på den UCL Institute of Ophthalmology för hjälp med musen djurhållning och Camille Charoy för teknisk support. Detta arbete stöds av medicinska forskningsrådet bidrag (herr/N011511/1) till C. Ruhrberg och brittiska hjärtat Foundation doktorand att J.T. Brash (FS/13/59/30649).

Alla djur arbetet utfördes efter UK Home Office och institutionella djurskydd och etisk granskning kroppen (AWERB) riktlinjer.
1. mus förberedelse
Obs: Utföra experiment på vuxna möss minst 8 veckors ålder, upp till 6 månaders ålder. För att demonstrera tekniska reproducerbarhet och konsekvent timing för varje steg i detta förfarande mellan olika djur, Använd minst 2 och högst 6 möss för varje experimentella session. För att utvärdera effekten av en mutation på en permeabilitet-inducerande substansen i genetiskt modifierade möss, helst Använd 2 muterade möss och 2 littermate kontroller per experiment.
<ol><li>24 h före stimulerande vaskulär hyperpermeability, söva möss med en lämplig inandning narkos såsom isofluran. Använda 3% isofluran för anestesi induktion tills den rätande reflexen är förlorat och musen är okänslig för yttre stimuli. Använda 1,5% isofluran för anestesi underhåll (se till att musen har konstant andningsfrekvens). Under anestesi, raka försiktigt båda sidorna av varje mus med en elektrisk rakapparat, att undvika skador på huden. Obs: Anestesi används inte orsakar stress för djuret och att minimera rörelse under rakning, vilket kan resultera i skada av huden.</li>
	<li>Återgå rakade musen till dess buren. För manliga möss, placera varje hane i en enskild bur efter anestesi återhämtning att förhindra kämpar och, därför, skada huden. Honmöss, returnera dem i en grupp till deras hem bur. Obs: Om en kämpande beteende observeras bland manliga möss i buren, innan förfarandet, dela upp dem i enskilda burar i 3 dagar innan experimentet att låta huden skador att läka.</li>
	<li>Övervaka möss tills de återfå medvetandet (vanligtvis inom några sekunder) och flytta runt buren (vanligtvis inom 1 min).</li>
</ol>2. intravenös injektion av Evans blå färg
<ol><li>I ett laminärt flöde skåp, förbereda separata sterila lösningar av histamin hämmare pyrilamine timololmaleat (4 µg/µL i 0,9% saltlösning) och Evans blå färgämne (1% w/v i 0,9% koksaltlösning). Sterilisera genom att passera lösningarna genom ett 22 µm filter.</li>
	<li>Använd en steril 1 mL spruta med 30 G nål injiceras intraperitonealt varje mus med 10 µL pyrilamine timololmaleat lösning/gram kroppsvikt (figur 1A). Att utföra den första, kragen för injektion, musen och sedan luta den så att huvudet är riktat mot marken och buken är riktad uppåt. Injicera i lägre kvadranterna i buken från mittlinjen att undvika att slå blåsan. Obs: Vikten på möss mellan 8 veckor och 6 månaders ålder vanligtvis varierar mellan 15 och 30 g. Pyrilamine timololmaleat kommer att hämma frisättningen av kroppseget histamin, vilket annars skulle främja vaskulär läckage oberoende av agenten att testas.</li>
	<li>Placera musen i 37 ° C värme avdelning för 10 min att främja vasodilatation. Alternativt använda en lämplig värmelampa som fokuserade på svansen för att främja vasodilatation om användningen av en värmelampa tillåts av de lokala etiska riktlinjerna.</li>
	<li>Flytta en mus i taget till en mus fasthållning och gnugga svansen med 70% etanol att rengöra injektionsstället och ytterligare främja vasodilatation.</li>
	<li>Använd en steril 1 mL spruta med 30G nål för att administrera 100 µL Evans blå färgämnet intravenöst genom svansen venen (figur 1B). Applicera omedelbart tryck mot injektionsstället genom att hålla svansen mellan fingret och tummen att förhindra blödning. Obs: Visualisering av svans ven kan förbättras genom att rikta lamplight till injektionsstället. Närmare på utför intravenösa injektioner i mus svans ven kan hittas i en publicerade protokoll18.</li>
	<li>Låt färgen att cirkulera i 30 min.</li>
</ol>3. stimulera vaskulär Hyperpermeability
<ol><li>Med sterila lösningar i ett laminärt flöde skåp, späd permeabilitet-inducerande agenten av intresse för en koncentration som gör att den sista dosen ska levereras i en volym av 20 µL. Obs: I exempel experimentet visas i figur 1-figur 2, VEGFA används för att stimulera vaskulär hyperpermeability med en koncentration på 2,5 ng/µL i PBS, vilket ger en total dos på 50 ng och PBS används som en kontroll av fordon.</li>
	<li>Läsa in permeabilitet-inducerande agenten intresse och för fordonskontroll i 2 separata sterila 300 µL sprutor med 31 G nål. Ladda tillräcklig lösning att injicera varje mus med 20 µL av lösningen i tre exemplar (dvs. förbereda 60 µL av agent och fordon per mus, plus ytterligare volym för nålens död volym).</li>
	<li>Söva den första musen ska testas med isofluran (3% för anestesi induktion tills rätande reflex är förlorat och musen inte svarar på yttre stimuli, och 1,5% för anestesi underhåll, att se till att musen har konstant andningsfrekvens).</li>
	<li>Intradermalt injicera 20 µL av permeabilitet-främja agent i flanken av musen (figur 1 c). Se till att nålen med en vinkel på 15° mot huden. Kontrollera för bildandet av en upphöjd bubbla i huden vilket tyder på en lyckad injektion. Upprepa intrakutana injektionen vid 2 ytterligare platser, en minst 1 cm mellanrum.</li>
	<li>Starta musen för att exponera den 2nd flanken och upprepa tre exemplar injektioner med kontroll fordonet lösningen. Spela in på papper positionen för varje injektionsställe att underlätta deras identifiering för efterföljande provtagning för huden. Obs: Hantera musen huden med försiktighet i detta skede. till exempel undvika att nypa huden när du utför intradermala injektioner.</li>
	<li>Återgå injicerade musen till dess buren och övervaka musen tills det återvinner medvetande (vanligtvis inom några sekunder) och flyttar runt buren.</li>
	<li>Medan den första musen återvinner, omedelbart Upprepa steg 3.3 och 3.5 med andra musen, och så vidare (upp till 6 möss maximally per session). Föra ett register över tiden varje mus injicerades för att justera den tid som du vill fortsätta till efterföljande steg.</li>
</ol>4. kvantifiering av ackumulerade Evans Blue i Dermis
<ol><li>Slakta varje mus av cervikal dislokation 20 min efter att det fått intradermala injektioner, observerar samma ordning där möss injicerades. Observera: Varaktigheten av vaskulär läckage kan variera beroende på permeabilitet-inducerande medel som används, och, därför, tiden mellan intradermal injektion och avlivning kan behöva optimera.</li>
	<li>Plats varje gallrats musen på dess rygg och klämmer fast fötterna på en kork ombord lindade med en ren trasa (figur 1 d).</li>
	<li>Med trubbig sax, göra ett vertikalt snitt på ca 3-4 cm från nedre delen av buken upp till bröstet av döda musen. Med pincett och en skalpell, retas bort huden från båda flanker att avslöja den inre sidan av dermis och platser av Evans blå ackumulering (figur 1E). PIN ner den lösa huden och ta bort fett från regionerna runt läckage platsen med en skalpell. Om så krävs, ta en representativ bild att Visa omfattningen av Evans blå läckage in i huden.</li>
	<li>Använda pincett och en skalpell, punktskatter hud regioner bestående av läckt Evans blå färgen för varje plats injiceras med permeabilitet-inducerande agent eller fordon. Obs: var noga med för att punktskatt likaså stora regioner i huden för att kontrollera att en liknande del av formamid volymen på de efterföljande steg 4,7, kommer adsorberas av varje hudprov, så att den extraherade färgen spädas i en liknande volym av återstående formamid . Kartans injektion som registrerades i steg 3.5 hjälper definiera området att vara censurerade.</li>
	<li>Placera varje prov i en 1,5 mL tub och märkt det med detta, att se till att varje prov vilar på botten av röret. Lagra proverna vid - 20 ° C tills vidare användning. Om bearbetning omedelbart, följer du stegen nedan.</li>
	<li>Torka huden proverna över natten genom att placera öppna tubrör i ugn eller i brunnen av en värmeblocket vid 55 ° C.</li>
	<li>Att extrahera Evans blå färg, tillsätt 250 µL avjoniserat formamid i proverna i ett dragskåp, nära rören. Kontrollera huden proven omfattas alla av formamid och inkubera över natten i en ugn eller en värmeblocket vid 55 ° C.</li>
	<li>Centrifugera proverna i en bänkmonterade Centrifugera vid maximal hastighet (> 10 000 x g) för 40 min.</li>
	<li>I ett dragskåp, överföra 100 µL av färgämne-innehållande supernatanten från varje prov i en separat brunn av en transparent, platt bottenplattan med 96 brunnar (figur 2A).</li>
	<li>Mäta peak Evans blå absorbansen vid 620 nm med en referens läsning av 740 nm på en spektrofotometer. Obs: 620 nm är peak av Evans blå absorbansen, medan 740 nm absorberas inte av Evans blue och fungerar som en referens våglängd.</li>
	<li>Genomsnittlig absorbans avläsningarna av tre exemplar injektioner av samma agent eller fordon för varje mus att ta hänsyn till tekniska variationer (figur 2B).</li>
	<li>Beräkna skillnaden vik av avläsningar från permeabilitet-inducerande agent kontra fordonskontroll (figur 2 c).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nagy, J. A., Benjamin, L., Zeng, H. Y., Dvorak, A. M., Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability,+vascular+hyperpermeability+and+angiogenesis.">Vascular permeability, vascular hyperpermeability and angiogenesis.</a> Angiogenesis. 11, 109-119 (2008).</li><li>Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+blood-brain+barrier.">Development of the blood-brain barrier.</a> Cell and Tissue Research. 314, 119-129 (2003).</li><li>Ruhrberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+and+shaping+the+vascular+tree:+multiple+roles+for+VEGF.">Growing and shaping the vascular tree: multiple roles for VEGF.</a> Bioessays. 25, 1052-1060 (2003).</li><li>Risau, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Endothelium.">Differentiation of Endothelium.</a> FASEB Journal. 9, 926-933 (1995).</li><li>Strbian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier+is+continuously+open+for+several+weeks+following+transient+focal+cerebral+ischemia.">The blood-brain barrier is continuously open for several weeks following transient focal cerebral ischemia.</a> Neuroscience. 153, 175-181 (2008).</li><li>Weis, S. M., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiological+consequences+of+VEGF-induced+vascular+permeability.">Pathophysiological consequences of VEGF-induced vascular permeability.</a> Nature. 437, 497-504 (2005).</li><li>Campochiaro, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+of+retinal+and+choroidal+vascular+diseases.">Molecular pathogenesis of retinal and choroidal vascular diseases.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 49, 67-81 (2015).</li><li>Aman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+Treatment+of+Edema+and+Endothelial+Barrier+Dysfunction+with+Imatinib.">Effective Treatment of Edema and Endothelial Barrier Dysfunction with Imatinib.</a> Circulation. , 126 (2012).</li><li>Claesson-Welsh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability-the+essentials.">Vascular permeability-the essentials.</a> Upsala J Med Sci. 120, 135-143 (2015).</li><li>Schulte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+the+VE-cadherin-catenin+complex+blocks+leukocyte+extravasation+and+vascular+permeability.">Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability.</a> Embo Journal. 30, 4157-4170 (2011).</li><li>Heinolainen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR3+Modulates+Vascular+Permeability+by+Controlling+VEGF/VEGFR2+Signaling.">VEGFR3 Modulates Vascular Permeability by Controlling VEGF/VEGFR2 Signaling.</a> Circulation Research. 120, (2017).</li><li>Eliceiri, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+requirement+for+Src+kinases+during+VEGF-induced+angiogenesis+and+vascular+permeability.">Selective requirement for Src kinases during VEGF-induced angiogenesis and vascular permeability.</a> Molecular Cell. 4, 915-924 (1999).</li><li>Sun, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR2+induces+c-Src+signaling+and+vascular+permeability+in+vivo+via+the+adaptor+protein+TSAd.">VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd.</a> Journal of Experimental Medicine. 209, 1363-1377 (2012).</li><li>Fantin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF165-induced+vascular+permeability+requires+NRP1+for+ABL-mediated+SRC+family+kinase+activation.">VEGF165-induced vascular permeability requires NRP1 for ABL-mediated SRC family kinase activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 214, 1049-1064 (2017).</li><li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR2+pY949+signalling+regulates+adherens+junction+integrity+and+metastatic+spread.">VEGFR2 pY949 signalling regulates adherens junction integrity and metastatic spread.</a> Nat Commun. 7, (2016).</li><li>Senger, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cells+secrete+a+vascular+permeability+factor+that+promotes+accumulation+of+ascites+fluid.">Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid.</a> Science. 219, 983-985 (1983).</li><li>Miles, A. A., Miles, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Reactions+to+Histamine,+Histamine-Liberator+and+Leukotaxine+in+the+Skin+of+Guinea-Pigs.">Vascular Reactions to Histamine, Histamine-Liberator and Leukotaxine in the Skin of Guinea-Pigs.</a> J Physiol-London. 118, 228-257 (1952).</li><li>Radu, M., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+Assay+to+Test+Blood+Vessel+Permeability.">An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability.</a> Jove-J Vis Exp. , e50062 (2013).</li><li>Roth, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-1+mediates+vascular+permeability+independently+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptor-2+activation.">Neuropilin-1 mediates vascular permeability independently of vascular endothelial growth factor receptor-2 activation.</a> Sci Signal. 9, (2016).</li><li>Acevedo, L. M., Barillas, S., Weis, S. M., Gothert, J. R., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+3A+suppresses+VEGF-mediated+angiogenesis+yet+acts+as+a+vascular+permeability+factor.">Semaphorin 3A suppresses VEGF-mediated angiogenesis yet acts as a vascular permeability factor.</a> Blood. 111, 2674-2680 (2008).</li><li>Teesalu, T., Sugahara, K. N., Kotamraju, V. R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-end+rule+peptides+mediate+neuropilin-1-dependent+cell,+vascular,+and+tissue+penetration.">C-end rule peptides mediate neuropilin-1-dependent cell, vascular, and tissue penetration.</a> P Natl Acad Sci USA. 106, 16157-16162 (2009).</li><li>Ho, V. C., Duan, L. J., Cronin, C., Liang, B. T., Fong, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Receptor-2+Abundance+Contributes+to+Increased+Angiogenesis+in+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Receptor-1-Deficient+Mice.">Elevated Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Abundance Contributes to Increased Angiogenesis in Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1-Deficient Mice.</a> Circulation. 126, (2012).</li><li>Chislock, E. M., Pendergast, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abl+Family+Kinases+Regulate+Endothelial+Barrier+Function+In+Vitro+and+in+Mice.">Abl Family Kinases Regulate Endothelial Barrier Function In Vitro and in Mice.</a> PLoS ONE. 8, e85231 (2013).</li><li>Busch, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+ketamine+on+hypoxic+pulmonary+vasoconstriction+in+the+isolated+perfused+lungs+of+endotoxaemic+mice.">Effects of ketamine on hypoxic pulmonary vasoconstriction in the isolated perfused lungs of endotoxaemic mice.</a> Eur J Anaesth. 27, 61-66 (2010).</li><li>Sinclair, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+physiological+effects+of+alpha2-agonists+related+to+the+clinical+use+of+medetomidine+in+small+animal+practice.">A review of the physiological effects of alpha2-agonists related to the clinical use of medetomidine in small animal practice.</a> Can Vet J. 44, 885-897 (2003).</li></ol>

Författarna har inga motstridiga intressen att deklarera.

Sedan dess första beskrivning i 195217, har Miles analysen försett forskare med en relativt snabb, enkel och tillförlitlig metod för att studera molekylära mekanismer för vaskulära hyperpermeability. Till exempel har Miles analysen använts för att testa den förmåga och/eller styrkan hos olika agenter att inducera hyperpermeability19,20,21 eller att testa effekten av hyperpermeability blockerande medel8 ,22,23. Ett annat exempel har agenter som inducerar vaskulär permeabilitet testats i genetiskt modifierade möss och deras littermate kontroller för att fastställa kraven för specifika receptorer och signal transducing proteiner för ligand-inducerad hyperpermeability svar10,11,12,13,14,15,20,23. Flera modifierade versioner av Miles analysen har sedan dess använts, till exempel med avseende på de tracer som används. Således, Evans Blue har ersatts i vissa studier med fluorescens-märkt dextrans av olika storlekar eller mikrosfärer11,13.
Den största fördelen med Miles analysen över andra analyser för att utreda vaskulär hyperpermeability mekanismer är att det är jämförelsevis lätt att utföra och kräver ingen dyr utrustning. Dessutom som en in-vivo teknik, denna analys modeller vaskulär läckage i samband med intakta blodkärl, i motsats till att mäta läckage genom testmetoder in vitro- som trans väl flux analyser eller trans endothelial elektriskt motstånd ( TEER) analyser, som enbart inriktas på den endothelial enskiktslager. De alternativa in-vivo -analyserna av vaskulära hyperpermeability kan skilja sig från Miles analysen beskrivs här genom att utnyttja en annan leverans rutt för hyperpermeability-inducerande agent eller genom att analysera vaskulär läckage på olika platser, för exempel genom systemisk leverans av en agent via svans venen följt av vaskulär läckage undersökning i lungorna eller i luftstrupen11,13,15. En begränsning av Miles analysen är att den intrakutan injektionen av vissa agenter kan, i princip också påverka blodtryck och flödet förutom endotel barriär störningar och, därför, påverka vaskulär permeabilitet också indirekt. Denna analys har dock nyligen visat att mäta vaskulär permeabilitet induceras av VEGF-A oberoende av effekter på systemiska blodtrycket15. En annan begränsning i Miles analysen är att kärlbäddar i olika vävnader kan reagera annorlunda till permeabilitet-främja agenter och resultat som erhållits med en Miles analysen i huden, därför inte kanske representant, till exempel av vad som sker i den lungorna eller hjärnan.
Djurets ålder och vikt kan påverka läckage observeras i Miles-analysen. För att minimera effekten av dessa variabler, forskare bör använda kullsyskon eller likaså storlek och åldern möss som kontroller. Vid bedömningen av mus mutanter för en särskild gen av intresse, ska möss genereras genom en heterozygot kontra heterozygot avel strategi och vildtyp littermates används som kontroller. Dessutom är det tillrådligt att använda snabbt reversibel gas bedövningsmedel, såsom isofluran, att undvika vasokonstriktion, som har beskrivits för vissa anestetiska läkemedel administreras via parenteral injektioner24,25. Injektion av Evans blå färgämnet i mus laterala svans ven är ett viktigt steg i detta protokoll och kan kraftigt påverka kvaliteten på de experiment och data. Således, forskare måste vara behöriga i utför svans ven injektioner och kommer sannolikt att behöver tidigare erfarenhet eller praxis före början Miles assay experiment. Alternativt kunde forskarna använda andra intravenösa vägar för att leverera Evans blå, såsom retro-orbital injektion om de är erfarna med det. Intrakutan injektion av permeabilitet-främja lösningar kan orsaka agent-oberoende skador på huden. Därför bör intradermala injektioner bör inte överstiga 20 µl i volym, alltid utföras i närvaro av den histamin-hämmaren och normaliserade till fordon kontroll injektioner.
Miles analysen har använts av många forskare för att utvärdera komponenter av den VEGF-A signalvägen, exempelvis eftersom VEGF-A-inducerad vaskulär permeabilitet orsakar ascites cancer patienter16 och vision-försämra ödem i flera neovaskulär öga sjukdom7. Således har vi och andra använt Miles analysen för att jämföra VEGF-A inducerad vaskulär läckage hos möss som har modifierats genetiskt för att saknar vissa komponenter av VEGF-A signalering kaskad12,13,14, 15 , 20 , 23. vår senaste studie använder denna metod visade att den huvudsakliga patologiska VEGF-A isoformen, VEGF165, signalerar genom en komplex av VEGFR2 och NRP1, där NRP1 cytoplasmiska domänen främjar ABL Kinas-medierad aktivering av SRC kinaser att framkalla en hyperpermeability svar14. VEGFA också främjar blodkärlstillväxt och skulle därför kunna användas terapeutiskt att återställa blodflödet till ischemisk vävnad om verksamheten hyperpermeability kunde hämmas specifikt. Forskning klarlägga de molekylära mekanismer som styr VEGF-A svar av vaskulära endotelceller mot vaskulär hyperpermeability kan därför identifiera vägar som selektivt kan manipuleras för att hämma patologiska VEGF-A inducerade ödem sjukdomar, som cancer eller ischemisk ögonsjukdom. Miles analysen kommer utan tvekan att fortsätta att vara en bra metod att underbygga dessa och många andra typer av funktionella studier för att klarlägga molekylära regulatorer och effektorer av vaskulära hyperpermeability.

Hjärt-kärlsystemet primära funktion är att möjliggöra överföring av gaser, näringsämnen och avfallsprodukter mellan omsättning och vävnader i alla organ. Blodkärlen har organ-specifika nivåer av basala genomsläpplighet för att medge sådana utbyten1. Exempelvis är blodkärl i njuren mycket genomsläpplig, medan blod-hjärnbarriären bildar en tät, mycket ogenomträngliga gränssnitt2,3,4. De endothelial celler som bildar den inre beklädnaden av blodkärl ger en fysisk barriär mellan omsättning och underliggande vävnader och reglerar vaskulär permeabilitet i ett organ-specifika sätt. Dock orsaka vissa stimuli en partiell uppdelning av endotel barriären att öka den flytande extravaseringen från cirkulationen till interstitium ovanför basala nivåer1. Sådana hyperpermeability observeras, till exempel på platser av vävnad trauma, inflammation, tumörer, sepsis, i ögonen med neovaskulär sjukdom eller i hjärnan och hjärtat, när vävnadsischemi uppstår på grund av en stroke eller hjärtinfarkt, respektive 5 , 6 , 7 , 8. När kroniskt förhöjda, hyperpermeability leder till ödem, som i sin tur orsakar vävnadsskada, såsom synförlust i öga sjukdom9. Således, modellering vaskulär hyperpermeability svaret är önskvärt för att förstå de mekanismer som ökar endotel permeabilitet och att testa effekten av läkemedel avsedda att hämma detta.
Miles analysen är en väletablerad, vanliga och relativt enkel teknik som mäter vaskulär läckage i vivo som ett surrogat mätning av vaskulära hyperpermeability. Även om det inte tar hänsyn till kompoundering faktorer som kan öka vaskulär läckage oberoende av endotel barriär förordning, såsom högt blodtryck eller blodflödet, Miles analysen allmänt tros ge en tillförlitlig metod för att utvärdera den permeabilitet modulerande aktivitet av ämnen och identifiera signalering medlarna som främjar deras aktivitet. Följaktligen, Miles analysen har integrerad till talrika studier har identifierat mediatorer av vaskulära hyperpermeability och deras verkningsmekanismer åtgärd10,11,12,13, 14,15, såsom den vaskulära endotel tillväxtfaktorn VEGF-A som identifierades ursprungligen som vaskulär permeabilitet faktorn VPF16.
Ursprungligen utvecklades av Miles och Miles för att studera vaskulär permeabilitet i marsvin17, anpassades deras analys därefter med möss, som är nu modell organismen av val att klarlägga molekylära mekanismer av vaskulär permeabilitet förordning på grund av sina utsökta lämplighet att genmanipulation. Kort, Evans blå färgen intravenöst injiceras i vuxna möss och får cirkulera i 30 minuter (figur 1). Permeabilitet-inducerande medel kontra kontroll av fordon sedan injiceras intrakutant på flera platser på motsatta sidorna av musen för att inducera vaskulär läckage (figur 1). Följaktligen, albumin-bundna Evans blått färgämne extravasates och ackumuleras i dermis (figur 1). Efter humant utslaktning musen, Evans blue utvinns från dermis och nivån av vaskulär läckage beräknas som förhållandet mellan test ämnet - att fordon-inducerad optisk densitet (figur 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="972">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:320px;">Pyrilamine maleate salt</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">P5514-5G</td>
			<td style="width:167px;">Resuspend in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Deionised Formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4117</td>
			<td>Use in fume cupboard</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microlance Needles 30g x 0.5&#34;</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sterile Plastipak 1ml Luer</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:320px;">Sterile MicroFine syriinges 0.3 ml - 8 mm - 30G&#160;</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>324826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Evans blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse restrainer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heat chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hair clippers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isoflurane</td>
			<td>Merial</td>
			<td>ap/drugs/220/96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Scalpal&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Blunt scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heatblock</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cork board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Benchtop refrigerated centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor 165</td>
			<td>Reliatech</td>
			<td>M30-004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating vascular hyperpermeability-inducing agents in the skin with the miles assay

Den vaskulära endotelet i ryggradsdjur organismer primära funktion är att fungera som en barriär mellan blodet och varje vävnad i kroppen, whereby permeabiliteten i endotelet till blodkroppar, plasma makromolekyler och vatten kan anpassas enligt fysiologiska behov. Vid vissa sjukdomar släpps cytokiner och tillväxtfaktorer som riktar endotel barriären för att tillfälligt öka vaskulär permeabilitet; deras långvarig närvaro kan dock orsaka kronisk vaskulär hyperpermeability och därmed vävnad-skadande ödem. Miles analysen är en in-vivo -teknik som tillåter forskare att studera vaskulär hyperpermeability genom proxy mätning av vaskulär läckage. Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll om hur du utför proceduren i musen, vilket är den mest använda modellen organismen att studera däggdjur fysiologi och patologi. Förfarandet innebär intravenös injektion av Evans blå färgämnet att märka den cirkulerande albumin följt av flera intradermala injektioner av permeabilitet-inducerande medel och fordon kontrollösningar i motsatta sidorna av musen. Därför läcker Evans blå färg gradvis in i dermis, där det ackumuleras och kan utvinnas för kvantifiering som läckage som induceras av permeabilitet-inducerande agenten i förhållande till fordonet. Miles analysen kan utföras i vildtyp eller genetiskt modifierade musmodeller och kan kombineras med Läkemedelsverket att studera molekylära mekanismer som reglerar vaskulär permeabilitet och identifiera agenter/mål kan inducera eller blockering hyperpermeability.

Vi använde Miles analysen för att bedöma VEGF-A förmåga att inducera vaskulär läckage i förhållande till kontroll av fordon (PBS) i vildtyp C57/Bl6 möss. Här visar vi ett representativt experiment med vildtyp möss stimuleras med intrakutan injektion av 20 µL lösning innehållande 50 ng av VEGF-A i PBS eller fordonet PBS endast. En tydlig ökning av Evans blått färgämne läckage i huden prover injiceras med VEGF-A jämfört med PBS var uppenbar i situ (figur 1E) och efter utvinning av färgämnet i formamid (figur 2A). Kvantifiering av flera experiment visar att 50 ng av VEGF-A inducerar betydligt mer Evans blå läckage än PBS ensam (figur 2B), med i genomsnitt 3-faldig ökning av vaskulär läckage jämfört med vehikel (figur 2 c).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig1.jpg"> Figur 1: induktion av vaskulär läckage i Miles analysen. Schematisk representation (översta paneler) och motsvarande bilder (bottenpaneler) av de sekventiella steg när du utför Miles analysen i musen. (A) Pyrilamine timololmaleat injiceras intraperitonealt för att förhindra utsläpp av kroppseget histamin 10 till 30 minuter före (B) intravenös injektion av 100 µl 1% Evans blue in svansen ven av musen. (C), 30 min senare, vaskulär läckage framkallas genom intrakutan injektion av agenten (50 ng av VEGF-A; gröna cirklar) kontra fordonskontroll (PBS; vita cirklar). (D, E) För att komma åt platser av Evans blå ackumulering, musen är utgallrade 20 minuter efter de intrakutana injektionerna och huden på båda flankerna dissekeras och nålas ner. i.p.: intraperitoneal; i.v.: intravenös; i.d.: intradermala; skala barer, 1 cm. <a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig1large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig2.jpg"> Figur 2: kvantifiering av vaskulär läckage i Miles analysen. (A) Evans blått färgämne utvinns i formamid från huden prover erhålls från varje intradermal injektion i figur 1 och läses in en plattan med 96 brunnar för absorbansen med en spektrofotometer. (B, C) Grafisk representation av absorbansen avläsningarna från flera experiment genom att plotta antingen (B), normaliserade absorbansen värden (optisk densitet, OD) av båda permeabilitet-inducerande agent (VEGF-A; mörk gröna cirklar) och fordonets (PBS; grå cirklar), eller (C) luckan ändra i OD för agent kontra fordon (felstaplar: SEM). Absorbansen avläsningarna av tre exemplar PBS och VEGF-A prover visat (A) är i genomsnitt och visas i (B, C) som vita eller gröna cirklar, respektive. <a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay at JoVE.com

Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

Här presenterar vi ett protokoll för att mäta vaskulär läckage framkallas genom intradermal administrering av permeabilitet främja agenter i murina huden. Denna teknik kan användas för att bestämma molekyler förmåga att främja eller hämma vaskulär läckage eller studera molekylära mekanismer som reglerar vaskulär permeabilitet.

Utvärderande vaskulär Hyperpermeability-inducerande medel i huden med Miles-analys

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby ...

Research

JoVE Journal

Biology

Construction and Implantation of a Microinfusion System for Sustained Delivery of Neuroactive Agents.

Konstruktion och Implantation av en mikroinfusion System för en hållbar Leverans av neuroactive Agents.

Sustained delivery of neuroactive agents is widely used in neuroscience, but poses many technical challenges. It is necessary to deliver the agent with ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

Klonogena analysen: Vidhäftande Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Hela montering Immunhistokemisk Analys för Embryonala Limb Skin kärlsystemet: ett modellsystem för studier Vascular Avgrening morfogenes i Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiering av nyfödda mus härledda hudens stamceller i Germ-liknande celler<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Isolering av murin Coronary vaskulära glatta muskelceller

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

Bedömning av vaskulär tonen respons med isolerade mesenteric artärer med fokus på modulering av perivaskulär adipose vävnader

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic ...

Deep Vascular Imaging in the Eye with Flow-Enhanced Ultrasound

Djup kärlavbildning i ögat med flödesförbättrat ultraljud

The retina within the eye is one of the most energy-demanding tissues in the body and thus requires high rates of oxygen delivery from a rich blood ...

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

Imaging Molekylär vidhäftning i cellrullning av vidhäftning fotavtryck analys

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Tillämpning av passiv huvudrörelse för att generera definierade accelerationer vid gnagarnas huvuden

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Isolering av hjärt- och vaskulära glattmuskelceller från vuxna, juvenila, larviga och embryonala zebrafiskar för elektrofysiologiska studier

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...