Name: evaluating vascular hyperpermeability-inducing agents in the skin with the miles assay
Uploaded: 2018-06-19T13:30:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay at JoVE.com

Laura Denti teşekkür ediyoruz, fare yetiştiriciliği ve Camille Charoy ile Valentina Senatore ve personel için Oftalmoloji UCL Enstitüsü biyolojik kaynakları birimi teknik destek için yardım et. Bu eser C. Ruhrberg ve bir İngiliz kalp Vakfı doktora öğrencilik J.T. küstah (FS/13/59/30649) için bir tıbbi araştırma Konseyi grant (Bay/N011511/1) tarafından desteklenmiştir.

Tüm hayvan iş İngiltere'de ev ofis ve kurumsal hayvan refahı ve etik İnceleme vücut (AWERB) yönergeleri izleyerek dışarı taşındı.
1. fare hazırlık
Not: en az 8 hafta-in yaş, yetişkin fareler üzerinde deneyler kadar yaş 6 ay için gerçekleştirin. Teknik tekrarlanabilirlik ve bu yordamın her adımında farklı hayvanlar arasında tutarlı zamanlamasını göstermek için deneysel her oturum için 2 en az ve en fazla 6 fare kullanın. Bir mutasyon genetik olarak değiştirilmiş farelerde geçirgenliği indükleyici madde üzerinde etkisini değerlendirmek için ideal olarak, 2 mutant fare ve deneyler başına 2 littermate kontrol kullanın.
<ol><li>24 saat önce uyarıcı vasküler hyperpermeability, anestezi uygun inhalasyon isoflurane gibi anestezik kullanarak fare. %3 isoflurane kadar iyileştiren refleks kayıp ve fare dış uyaranlara yanıt vermeyen anestezi indüksiyon için kullanın. % 1.5 isoflurane anestezi bakım için kullanın (fareyi sabit solunum oranları olduğundan emin olun). Anestezi altında dikkatli bir şekilde cilde yaralanmaları önleme bir elektrikli tıraş makinesi ile her iki yanları her fare tıraş ederim. Not: Anestezi için hayvan stres neden önlemek için ve cilt zarar görmesine neden tıraş sırasında hareket en aza indirmek için kullanılır.</li>
	<li>Traş fare için ev onun kafes dönmek. Erkek fareler için her erkek bireysel bir kafesin içine yerleştirin sonra anestezi kurtarma önlemek için mücadele ve bu nedenle, cilde zarar. Dişi fareler için onları ev onların kafes gruptaki döndürür. Not: mücadele bir davranış içinde belgili tanımlık kafes, Erkek fareler arasında gözlem yapılırsa yordamı önce bunları bireysel kafesler potansiyel Deri Hasari iyileşmek izin vermek için deneme önce 3 gün ayırın.</li>
	<li>(Genellikle birkaç saniye içinde) bilinç kurtarabilirsiniz ve kafes (genellikle içinde 1 dk) hareket kadar fareler izlemek.</li>
</ol>2. damar içi enjeksiyon Evans mavi boya
<ol><li>Bir laminar akış kabine içinde ayrı steril çözümleri histamin inhibitörü pyrilamine maleat (4 µg/µL % 0,9 serum içinde) ve Evans mavi boya (% %1 0,9 serum içinde w/v) hazırlayın. Çözümler 22 µm filtreden geçirilerek sterilize.</li>
	<li>Steril 1 mL şırınga 30 G iğne ile intraperitoneally her fare 10 µL pyrilamine maleat çözüm/gram ile vücut ağırlığı (Şekil 1A) enjekte etmek için kullanın. Enjeksiyon, ilk, scruff fare gerçekleştirmek ve sonra böylece kafa yere doğru yönlendirilir ve karın yukarı doğru yönlendirilir tilt için. Mesane isabet önlemek için orta hat uzak karın alt çeyrek dairelerin içinde enjekte. Not: Fare 8 hafta ve yaş 6 ay arasında ağırlığı genellikle aksi takdirde aracı test edilmesi için bağımsız olarak vasküler sızıntı tanıtmak endojen histamin serbest aralıkları arasında 15 ve 30 g. Pyrilamine maleat yapılmasını engeller.</li>
	<li>Vazodilatasyon tanıtmak 10 dk 37 ° C ısı odasında fareyi getirin. Alternatif olarak, eğer a ısı lamba kullanımı yerel etik kurallara izin verilir vazodilatasyon tanıtmak için kuyruk üzerinde odaklanmış bir uygun ısı lamba kullanın.</li>
	<li>Bir fare tek bir fare restrainer geçmek ve kuyruk enjeksiyon alanı temizleyin ve daha fazla vazodilatasyon desteklemek için % 70 etanol ile ovalayın.</li>
	<li>Steril 1 mL şırınga 30 G iğne ile 100 µL yönetmek için kullandığınız Evans mavi boya kuyruk ven (Şekil 1B) intravenöz aracılığıyla. Hemen basınç enjeksiyon siteye bir parmak ve başparmak kanama önlemek için arasında kuyruk tutarak Uygula. Not: Lamba ışığında enjeksiyon alana yönlendirerek görselleştirme kuyruk damarın geliştirilebilir. Yayımlanmış Protokolü18' fare kuyruğu ven içine İntravenöz enjeksiyon yapılması hakkında daha fazla ayrıntı bulunabilir.</li>
	<li>Boya için 30 dk dolaşmaya izin.</li>
</ol>3. damar Hyperpermeability teşvik
<ol><li>Steril çözümleri laminar akış kabine kullanarak, hacmi 20 µL teslim edilecek son doz sağlar bir konsantrasyon ilgi geçirgenliği indükleyici Ajan oranında seyreltin. Not: resim 1' -Şekil 2, VEGFA 2.5 ng/µL PBS içinde bir konsantrasyon, vasküler hyperpermeability uyarmak için kullanılır gösterilen örnek deneyinde toplam doz 50 ng ve PBS verimli bir araç denetimi kullanılır.</li>
	<li>Faiz ve araç denetimi geçirgenliği indükleyici Aracısı 31 G iğne ile 2 ayrı steril 300 µL şırınga yükleyin. Yük her fare nüsha çözümde 20 µL ile enjekte etmek için yeterli çözüm (yani hazır olun Ajan ve araç fare artı ek birim iğne ölü cilt için hesap için 60 µL).</li>
	<li>Birinci fare isoflurane (refleks keşfetmiş kaybolur ve fare dış uyaranlara yanıt vermeyen kadar anestezi indüksiyon için % 3 ve anestezi bakım, fareyi sabit solunum oranları olduğunu emin olmak için % 1.5) ile test edilecek anestezi.</li>
	<li>İntradermally 20 µL geçirgenliği teşvik aracının fare (Şekil 1 c) kanat enjekte. İğneyi cilde 15 ° açılı olduğundan emin olun. Başarılı bir enjeksiyon gösterir cilt içinde yükseltilmiş bir kabarcık oluşumu için kontrol edin. En az 1 cm arayla 2 ek sitelerdeki intradermal enjeksiyon yineleyin.</li>
	<li>Fare 2 kanat ortaya çıkarmak ve kontrol araç çözümü ile onaylatılacak enjeksiyonları tekrar açmak. Kağıt üzerinde kendi kimlik sonraki deri örnekleri topluluğu için kolaylaştırmak için her enjeksiyon yeri konumunu kaydeder. Not: Bu aşamada fare cilt dikkatle ele; Örneğin, cilt intradermal enjeksiyon işlemi sırasında pinching kaçının.</li>
	<li>Enjekte fare için ev onun kafes dönmek ve bilinç (genellikle birkaç saniye içinde) kurtarır ve kafes taşır kadar fareyi izlemek.</li>
	<li>Birinci fare kurtarır iken hemen 3.3 ikinci fare ile 3.5 ve benzeri (en fazla 6 fareler sonuna kadar oturum başına) aygıtlarından. Her fare bir sonraki adıma geçin için zaman ayarlamak için enjekte zaman bir kaydını tutmak.</li>
</ol>4. miktar birikmiş Evans mavi dermisin içinde
<ol><li>Hangi farelere enjekte edildi aynı sırada gözlemleyerek intradermal enjeksiyon aldıktan sonra her fare servikal çıkık 20 dk itlaf. Not: Vasküler sızıntı süresi kullanılan geçirgenliği indükleyici Ajan göre değişebilir ve bu nedenle, zaman intradermal enjeksiyon ve yüzey kaldırma arasında en iyi duruma getirme gerekebilir.</li>
	<li>Her yer fare üstünde onun sırt ve ayakta mantar pano üzerine temiz bir doku (Şekil 1 d) ile sarılmış PIN itlaf.</li>
	<li>Künt makas kullanırken, yaklaşık 3-4 cm alt karın üzerinden bir dikey kesi ölü fare göğüs kadar olun. Forseps ve neşter ile uzak dermis iç tarafında ve siteleri Evans mavi birikimi (Şekil 1E) ortaya çıkarmak için her iki yanları deriden tease. Gevşek cilt pin ve bölgelerden bir neşter ile kaçak site çevresinde yağ çıkarmak. Gerekirse, deri içine Evans mavi sızıntı büyüklüğünü göstermek için temsil edici bir fotoğraf çekmek.</li>
	<li>Bir neşter ve forseps kullanarak, özel tüketim cilt bölgeleri sızdırılmış Evans mavi boya her site için oluşan geçirgenliği indükleyici Ajan veya araç ile enjekte. Not: benzer şekilde ölçekli sonraki adım 4.7 formamide biriminin benzer bir bölümünü kalan formamide benzer bir birim içinde seyreltilmiş ayıklanan boya izin her deri örneği tarafından adsorbe, emin olmak için deri bölgelerinde tüketim için özen . 3.5. adımda kaydedilen enjeksiyon harita alanı eksize tanımlamak yardımcı olur.</li>
	<li>Her örnek bir 1,5 mL tüp içine yerleştirin ve buna göre etiketli, her örnek emin tüpün dibinde duruyor. Örnekleri, - 20 ° C kadar kullanmaya devam etmenize saklayın. Hemen işleme varsa, aşağıdaki adımları izleyin.</li>
	<li>Kuru deri örnekleri gecede açık tüpler bir fırın veya 55 ° C'de Isıtma bloğunun içine yerleştirerek</li>
	<li>Evans mavi boya ayıklamak için bir duman hood örneklerinde deiyonize suyla formamide 250 µL eklemek, tüpler kapatın. Deri örnekleri tüm formamide tarafından karşılanmaktadır ve gecede bir fırın veya Isıtma blok 55 ° C'de kuluçkaya emin olun</li>
	<li>Santrifüj kapasitesi maksimum hızda benchtop santrifüj örnekleri (> 10.000 x g) 40 dk için.</li>
	<li>Bir duman başlık, boya içeren süpernatant ile 100 µL her örnekten bir şeffaf, düz alt 96-şey plaka (Şekil 2A) ayrı bir kuyunun içine aktarın.</li>
	<li>Ölçü tepe Evans mavi absorbans 620 nm bir başvuru okuma ile 740 nm bir spektrofotometre üzerinde. Not: 620 nm olduğunu Evans zirve mavi absorbans, 740 iken nm Evans mavi tarafından tarafından emilir değildir ve başvuru dalga boyu davranır.</li>
	<li>Aynı ajan veya her fare için araç teknik değişkenliği (Şekil 2B) hesabınıza onaylatılacak enjeksiyonlari absorbans okuma ortalama.</li>
	<li>Araç kontrol (Şekil 2C) karşı geçirgenliği indükleyici aracısından okumalar kat sayısı hesaplama.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nagy, J. A., Benjamin, L., Zeng, H. Y., Dvorak, A. M., Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability,+vascular+hyperpermeability+and+angiogenesis.">Vascular permeability, vascular hyperpermeability and angiogenesis.</a> Angiogenesis. 11, 109-119 (2008).</li><li>Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+blood-brain+barrier.">Development of the blood-brain barrier.</a> Cell and Tissue Research. 314, 119-129 (2003).</li><li>Ruhrberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+and+shaping+the+vascular+tree:+multiple+roles+for+VEGF.">Growing and shaping the vascular tree: multiple roles for VEGF.</a> Bioessays. 25, 1052-1060 (2003).</li><li>Risau, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Endothelium.">Differentiation of Endothelium.</a> FASEB Journal. 9, 926-933 (1995).</li><li>Strbian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier+is+continuously+open+for+several+weeks+following+transient+focal+cerebral+ischemia.">The blood-brain barrier is continuously open for several weeks following transient focal cerebral ischemia.</a> Neuroscience. 153, 175-181 (2008).</li><li>Weis, S. M., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiological+consequences+of+VEGF-induced+vascular+permeability.">Pathophysiological consequences of VEGF-induced vascular permeability.</a> Nature. 437, 497-504 (2005).</li><li>Campochiaro, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+of+retinal+and+choroidal+vascular+diseases.">Molecular pathogenesis of retinal and choroidal vascular diseases.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 49, 67-81 (2015).</li><li>Aman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+Treatment+of+Edema+and+Endothelial+Barrier+Dysfunction+with+Imatinib.">Effective Treatment of Edema and Endothelial Barrier Dysfunction with Imatinib.</a> Circulation. , 126 (2012).</li><li>Claesson-Welsh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability-the+essentials.">Vascular permeability-the essentials.</a> Upsala J Med Sci. 120, 135-143 (2015).</li><li>Schulte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+the+VE-cadherin-catenin+complex+blocks+leukocyte+extravasation+and+vascular+permeability.">Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability.</a> Embo Journal. 30, 4157-4170 (2011).</li><li>Heinolainen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR3+Modulates+Vascular+Permeability+by+Controlling+VEGF/VEGFR2+Signaling.">VEGFR3 Modulates Vascular Permeability by Controlling VEGF/VEGFR2 Signaling.</a> Circulation Research. 120, (2017).</li><li>Eliceiri, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+requirement+for+Src+kinases+during+VEGF-induced+angiogenesis+and+vascular+permeability.">Selective requirement for Src kinases during VEGF-induced angiogenesis and vascular permeability.</a> Molecular Cell. 4, 915-924 (1999).</li><li>Sun, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR2+induces+c-Src+signaling+and+vascular+permeability+in+vivo+via+the+adaptor+protein+TSAd.">VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd.</a> Journal of Experimental Medicine. 209, 1363-1377 (2012).</li><li>Fantin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF165-induced+vascular+permeability+requires+NRP1+for+ABL-mediated+SRC+family+kinase+activation.">VEGF165-induced vascular permeability requires NRP1 for ABL-mediated SRC family kinase activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 214, 1049-1064 (2017).</li><li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGFR2+pY949+signalling+regulates+adherens+junction+integrity+and+metastatic+spread.">VEGFR2 pY949 signalling regulates adherens junction integrity and metastatic spread.</a> Nat Commun. 7, (2016).</li><li>Senger, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cells+secrete+a+vascular+permeability+factor+that+promotes+accumulation+of+ascites+fluid.">Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid.</a> Science. 219, 983-985 (1983).</li><li>Miles, A. A., Miles, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Reactions+to+Histamine,+Histamine-Liberator+and+Leukotaxine+in+the+Skin+of+Guinea-Pigs.">Vascular Reactions to Histamine, Histamine-Liberator and Leukotaxine in the Skin of Guinea-Pigs.</a> J Physiol-London. 118, 228-257 (1952).</li><li>Radu, M., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+Assay+to+Test+Blood+Vessel+Permeability.">An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability.</a> Jove-J Vis Exp. , e50062 (2013).</li><li>Roth, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropilin-1+mediates+vascular+permeability+independently+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptor-2+activation.">Neuropilin-1 mediates vascular permeability independently of vascular endothelial growth factor receptor-2 activation.</a> Sci Signal. 9, (2016).</li><li>Acevedo, L. M., Barillas, S., Weis, S. M., Gothert, J. R., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin+3A+suppresses+VEGF-mediated+angiogenesis+yet+acts+as+a+vascular+permeability+factor.">Semaphorin 3A suppresses VEGF-mediated angiogenesis yet acts as a vascular permeability factor.</a> Blood. 111, 2674-2680 (2008).</li><li>Teesalu, T., Sugahara, K. N., Kotamraju, V. R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-end+rule+peptides+mediate+neuropilin-1-dependent+cell,+vascular,+and+tissue+penetration.">C-end rule peptides mediate neuropilin-1-dependent cell, vascular, and tissue penetration.</a> P Natl Acad Sci USA. 106, 16157-16162 (2009).</li><li>Ho, V. C., Duan, L. J., Cronin, C., Liang, B. T., Fong, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Receptor-2+Abundance+Contributes+to+Increased+Angiogenesis+in+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Receptor-1-Deficient+Mice.">Elevated Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Abundance Contributes to Increased Angiogenesis in Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1-Deficient Mice.</a> Circulation. 126, (2012).</li><li>Chislock, E. M., Pendergast, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abl+Family+Kinases+Regulate+Endothelial+Barrier+Function+In+Vitro+and+in+Mice.">Abl Family Kinases Regulate Endothelial Barrier Function In Vitro and in Mice.</a> PLoS ONE. 8, e85231 (2013).</li><li>Busch, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+ketamine+on+hypoxic+pulmonary+vasoconstriction+in+the+isolated+perfused+lungs+of+endotoxaemic+mice.">Effects of ketamine on hypoxic pulmonary vasoconstriction in the isolated perfused lungs of endotoxaemic mice.</a> Eur J Anaesth. 27, 61-66 (2010).</li><li>Sinclair, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+physiological+effects+of+alpha2-agonists+related+to+the+clinical+use+of+medetomidine+in+small+animal+practice.">A review of the physiological effects of alpha2-agonists related to the clinical use of medetomidine in small animal practice.</a> Can Vet J. 44, 885-897 (2003).</li></ol>

Yazarlar bildirmek için çakışan hiçbir ilgi alanlarına sahip.

195217ilk açıklamasını beri mil tahlil araştırmacılar ile vasküler hyperpermeability moleküler mekanizmaları eğitim için nispeten hızlı, basit ve güvenilir bir yöntem sağlamıştır. Örneğin, mil tahlil yeteneği ve/veya farklı ajanlar potens hyperpermeability19,20,21 ikna etmek için veya hyperpermeability engelleme ajanlar8 etkinliğini test etmek için test etmek için kullanılan ,22,23. Başka bir örnek olarak, vasküler geçirgenliği neden ajanları genetik fareler ve onların littermate denetimleri belirli reseptörleri ve sinyal proteinleri ligand kaynaklı hyperpermeability transducing gereksinimlerini belirlemek için test edilmiştir Yanıt-e doğru10,11,12,13,14,15,20,23. Değiştirilmiş sürümlerini birkaç mil tahlil beri örneğin kullanılan izleme ile ilgili olarak kullanılmaktadır. Böylece, Evans mavi floresans etiketli dextrans farklı boyutlarda veya mikroküreler11,13ile bazı çalışmalarda değiştirdi.
Vasküler hyperpermeability mekanizmaları araştıran için diğer deneyleri ana avantajı mil testin bu gerçekleştirmek nispeten kolay ve pahalı ekipman gerektirmez olmasıdır. Akı deneyleri veya trans endotel elektrik direnci (Trans iyi gibi olarak sızıntı ile ölçme için karşı vitro Ayrıca, bu tahlil modelleri vasküler sızıntı olduğu gibi kan damarlarının bağlamda bir vivo içinde Teknik olarak deneyi Sadece, endotel monolayer üzerinde odaklanmak aylarının) deneyleri. Vasküler hyperpermeability alternatif vivo deneyleri farklı teslim yolu hyperpermeability-inducing Aracısı kullanan veya farklı sitelerdeki vasküler sızıntı için analiz burada açıklanan mil tahlil farklı olabilir bir ajan vasküler sızıntı sınavı-akciğerler ve nefes borusu11,13,15ardından kuyruk ven yoluyla sistemik teslim tarafından örneği. Belirli intradermal enjeksiyon ilke olarak, kan basıncı ve akışı yanı sıra endotel bariyer bozulma da etkiler ve bu nedenle, vasküler geçirgenliği de dolaylı etkisi olduğunu, mil testin bir kısıtlamadır. Yine de, bu tahlil son zamanlarda vasküler geçirgenliği tarafından indüklenen ölçmek için gösterilmiştir VEGF-A bağımsız olarak sistemik kan basıncı15üzerindeki etkileri. Başka bir mil testin farklı dokularda damar yataklar için farklı ajanlar geçirgenliği teşvik ve deride bir mil tahlil ile elde edilen sonuçlar bu nedenle, olabilir temsilcisi, örneğin, ne oluşur yanıt verebilir kısıtlamadır akciğer veya beyin.
Hayvanın yaşı ve kilosu mil assay olarak gözlenen sızıntı etkileyebilir. Bu değişkenler etkisini en aza indirmek için araştırmacılar littermates kullanmalısınız veya benzer şekilde boy ve fare denetimleri olarak yaşlı. Fare mutantlar için belirli bir gen ilgi değerlendirirken, fareler Heterozigoz Heterozigoz üreme stratejisi ve wildtype kaldırmak littermates denetimleri kullanılan karşı aracılığıyla oluşturulan. Ayrıca, hızlı bir şekilde ters çevrilebilir gaz anestezikler, isoflurane gibi parenteral enjeksiyonları24,25yönetilen bir anestezik ilaç için açıklanan vazokonstriksiyona önlemek için kullanılması önerilir. Evans mavi boya fare yan kuyruk ven içine enjeksiyon bu protokolü kritik bir adımdır ve deney ve veri kalitesini büyük ölçüde etkileyebilir. Bu nedenle, araştırmacılar kuyruk ven enjeksiyonları gerçekleştirmek için yetkili olması gerekir ve olacak büyük olasılıkla var deneme önce deneyimi veya uygulama mil tahlil başlamadan. Alternatif olarak, araştırmacılar intravenöz diğer yolları Evans mavi ile deneyimli olmaları durumunda retro-orbital enjeksiyon gibi sunmak için kullanabilirsiniz. Geçirgenliği teşvik intradermal enjeksiyon çözümleri cilt Ajan bağımsız zarar neden olabilir. Bu nedenle, intradermal enjeksiyon hacmi 20 µl geçmemelidir, her zaman olmalı histamin inhibitörü huzurunda yapılan ve araç kontrol enjeksiyonu için normalleştirilmiş.
Vasküler geçirgenliği VEGF A bağlı kanser hastaları16 ve vizyon kararlar almanı ödemi birkaç neovasküler asit nedeniyle mil tahlil pek çok araştırmacı tarafından VEGF-bir sinyal yolu, örneğin, bileşenleri değerlendirmek için kullanılmıştır göz hastalığı7. Bu nedenle, biz ve diğerleri mil tahlil VEGF-A indüklenen vasküler sızıntı VEGF-bir sinyal art arda sıralı12,13,14, , belirli bileşenlerini eksikliği için genetik olarak değiştirilmiş farelerde karşılaştırmak için kullanılan 15 , 20 , 23. bu yaklaşımı kullanarak bizim yeni çalışma ana patolojik VEGF-A izoformu, VEGF165, VEGFR2 ve NRP1, NRP1 sitoplazmik etki alanı SRC aile kinaz ABL kinaz-aracılı aktivasyonu teşvik bir kompleks sinyalleri ortaya bir hyperpermeability yanıt14uyandırmak için. VEGFA de kan damarı büyümesini destekler ve bu nedenle, tedavi amaçlı hyperpermeability faaliyetlerini özel olarak inhibe iskemik dokulara kan akışını geri için kullanılan olabilir. Araştırma VEGF-A yanıt karşı damar hyperpermeability damar endotel hücreleri, ederek, moleküler mekanizması elucidating bu nedenle, seçmeli olarak patolojik VEGF-A bağlı ödem etkisizleştirmek için manipüle edilebilir yollar tanımlayabilir hastalıklar, kanser veya iskemik göz hastalığı gibi. Mil tahlil şüphesiz bunlar ve diğer birçok türde moleküler düzenleyiciler ve vasküler hyperpermeability effectors aydınlatmak için fonksiyonel çalışmaları desteklemek için yararlı bir yöntem olmaya devam edecektir.

Kardiyovasküler sistem birincil dolaşım ve dokularda tüm organları arasında gaz, besin ve atık ürünlerin transferini sağlamak amacıyla işlevidir. Kan damarlarının bazal geçirgenliği böyle değişimleri1izin vermek için organ özgü seviyeleri var. Örneğin, sıkı, son derece delinmez arabirimi2,3,4kan beyin bariyerini oluşturur iken kan damarları böbrek aşırı geçirgen. Kan damarlarının iç astar formu endotel hücreleri dolaşım ve temel alınan dokular arasında fiziksel bir engeli sağlamak ve vasküler geçirgenliği bir organ özgü şekilde düzenler. Ancak, belirli uyaranlara endotel bariyer üstündeki bazal düzeyleri1interstitium dolaşıma gelen sıvı ekstravazasyonu artırmak için kısmi bir arıza neden. Doku iskemi bir kontur veya miyokard infarktüsü, nedeniyle sırasıyla ortaya çıktığında böyle hyperpermeability, örneğin, doku travması, iltihap, tümör, siteleri, sepsis, neovasküler hastalığı olan veya beyin ve kalp, gözler sırasında görülmektedir 5 , 6 , 7 , 8. ne zaman kronik olarak yüksek, hyperpermeability ödem, sırayla göz hastalığı9görme kaybı gibi doku hasarına neden olan yol açar. Böylece, vasküler hyperpermeability yanıt modelleme endotel geçirgenlik artışı mekanizmaları anlamak için ve bu etkisizleştirmek için tasarlanmış ajanların etkinliğini test etmek için arzu edilir.
Mil tahlil vasküler sızıntı vivo içinde vasküler hyperpermeability vekil ölçüsü ölçer köklü, yaygın olarak kullanılan ve nispeten basit bir tekniktir. Bağımsız olarak endotel bariyer yönetmelik, kan basıncı veya kan akımı, gibi vasküler sızıntı artıran faktörler bileşik dikkate almaz olsa bile mil tahlil değerlendirmek için güvenilir bir yöntem sağlamak için genel olarak düşünülmektedir geçirgenliği oransal etkinlik maddelerin ve faaliyetlerini teşvik sinyal arabulucu tanımlamak. Buna göre mil tahlil vasküler hyperpermeability arabulucu ve mekanizmaları eylem10,11,12,13, belirledik çok sayıda çalışma ayrılmaz oldu 14,15, gibi vasküler endotelyal büyüme faktörü VEGF-A Bu aslında vasküler geçirgenliği faktör VPF16olarak belirlendi.
Aslında mil ve mil eskiden şiling şimdi pigs17vasküler geçirgenliği çalışmaya tarafından geliştirilen, onların tahlil daha sonra vasküler geçirgenliği moleküler mekanizmaları aydınlatmak için seçtiğiniz model organizma şimdi olan fare kullanarak için uyarlanmıştır Yönetmelik genetik manipülasyon için mükemmel uygunluk nedeniyle. Kısaca, Evans mavi boya intravenöz yetişkin fareler enjekte ve 30 dakikadır (Şekil 1) dolaşmaya izin. Araç kontrol karşı geçirgenliği indükleyici ajanlar sonra intradermally karşıt yanları vasküler sızıntı (Şekil 1) teşvik için fare üzerinde birçok sitede enjekte edilir. Sonuç olarak, albümin bağlı Evans mavi boya extravasates ve dermiste (Şekil 1) birikir. İnsanca fare yüzey kaldırma sonra Evans mavi dermis çıkarılan ve vasküler sızıntı düzeyini test madde ve araç indüklenen bir oranı olarak optik yoğunluk (Şekil 2) hesaplanır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="972">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:320px;">Pyrilamine maleate salt</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">P5514-5G</td>
			<td style="width:167px;">Resuspend in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Deionised Formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4117</td>
			<td>Use in fume cupboard</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microlance Needles 30g x 0.5&#34;</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sterile Plastipak 1ml Luer</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:320px;">Sterile MicroFine syriinges 0.3 ml - 8 mm - 30G&#160;</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>324826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Evans blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse restrainer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heat chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hair clippers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isoflurane</td>
			<td>Merial</td>
			<td>ap/drugs/220/96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Scalpal&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Blunt scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heatblock</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cork board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Benchtop refrigerated centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor 165</td>
			<td>Reliatech</td>
			<td>M30-004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating vascular hyperpermeability-inducing agents in the skin with the miles assay

Omurgalı organizmalarda vasküler endotel birincil işlevi kan ve mademki endotel kan hücreleri, plazma oluştururlar ve Su geçirgenliği göre adapte edilebilir vücudun her doku arasında bir engel olarak hizmet etmektir fizyolojik gerek. Bazı hastalıklar, sitokinler ve büyüme faktörleri geçici damar geçirgenliği artırmak için endotel bariyer hedefleyen serbest bırakılır; Ancak, uzun süre varlıklarını kronik vasküler hyperpermeability ve ödem böylece doku zarar neden olabilir. Mil tahlil araştırmacılar damar hyperpermeability damar sızıntı proxy ölçümü ile çalışmaya olanak sağlayan bir vivo içinde tekniğidir. Burada, memeli fizyolojisi ve patoloji çalışmaya en yaygın olarak kullanılan model organizmadır fareyi, bu yordamı gerçekleştirme hakkında ayrıntılı bir protokol sağlar. Yordamı Evans mavi boya geçirgenliği indükleyici ajanlar ve araç kontrol çözümleri birden çok intradermal enjeksiyon tarafından içine karşıt yanları fare takip dolaşımdaki albümin etiketlemek için İntravenöz enjeksiyon içerir. Sonuç olarak, Evans mavi boya yavaş yavaş nerede birikir ve miktar olarak kaçak araç göre geçirgenliği indükleyici aracı tarafından indüklenen için çıkarılan dermise sızdırıyor. Mil tahlil vahşi yazıyla gerçekleştirilen yeniden ya da genetik olarak fare modelleri değişiklik ve aracıları/hedefleri inducing veya engelleme yeteneğine sahip tanımlamak ve vasküler geçirgenliği düzenleyen moleküler mekanizmaları incelemek için ilaç idaresi ile kombine edilebilir hyperpermeability.

Biz mil tahlil VEGF-bir araç denetime (PBS) wildtype C57/Bl6 farelerde göre vasküler sızıntı ikna yeteneği değerlendirmek için kullanılır. İşte, wildtype fareler uyarılmış 50 içeren 20 µL çözüm intradermal enjeksiyon ile kullanarak bir temsilci deney göstermektedir ng VEGF-a PBS veya araç PBS sadece. Evans mavi boya sızıntı VEGF-A ile enjekte deri örnekleri net artış PBS'ye karşılaştırıldığında belirgin in situ (Şekil 1E) oldu ve formamide (Şekil 2A) boya çıkarma sonra. Miktar birden çok deneyler göstermektedir 50 ng VEGF-a daha fazla Evans PBS yalnız (Şekil 2B), ortalama daha mavi sızıntı 3-fold vasküler sızıntı araç (Şekil 2C) göre artış önemli ölçüde indükler.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig1.jpg"> Şekil 1: mil tahlil vasküler sızıntı indüksiyon. Şematik Gösterim (üst panelleri) ve karşılık gelen görüntüleri (alt paneller) mil tahlil fare gerçekleştirirken sıralı adımları. (A)Pyrilamine maleat enjekte edilir intraperitoneally endojen histamin yayımlanmasından önce (B) İntravenöz enjeksiyon 100 µl 1 Evans kuyruk mavi damar fare % 10-30 dakika önlemek için. (C) 30 dk sonra vasküler sızıntı aracı intradermal enjeksiyon tarafından indüklenen (50 ng VEGF-a; yeşil daireler) araç kontrol (PBS; beyaz daireler) karşı. (D, E) -E doğru giriş yer Evans mavi birikimi, fare toplandılar 20 dakika sonra intradermal enjeksiyon ve her iki yanları deri disseke ve aşağı tuş. IP: mayi; damar yolu: intravenöz; Kimlik: intradermal; ölçek çubukları, 1 cm. <a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig2.jpg"> Şekil 2: mil tahlil vasküler sızıntı Quantification. (A)Evans mavi boya formamide her intradermal enjeksiyon Şekil 1 ' deki elde edilen ve bir 96-şey plaka ile spektrofotometre okuma absorbans için yüklenen cilt örneklerinden elde edilir. (B, C) Her iki geçirgenliği indükleyici Aracısı ya da (B) normalleştirilmiş absorbans değerleri (optik yoğunluk, OD) komplo tarafından birden fazla deneyler üzerinden absorbans okuma grafik olarak gösterilmesi (VEGF-A; koyu yeşil daireler) ve araç (PBS; gri daireler), veya (C) kat aracı araç karşı OD içinde değiştirme (hata çubukları: SEM). Absorbans okumalar onaylatılacak PBS ve (A) gösterilen VEGF-A örnekler ortalama olarak ve sırasıyla (B, C) beyaz veya yeşil daireler olarak gösterilir. <a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay at JoVE.com

Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

Burada, fare deri içine geçirgenliği teşvik ajanların intradermal yönetimi tarafından indüklenen vasküler sızıntı ölçmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bu teknik yeteneği teşvik veya vasküler sızıntı engelleyen veya vasküler geçirgenliği düzenleyen moleküler mekanizmaları incelemek için moleküllerin belirlemek için kullanılabilir.

Vasküler Hyperpermeability indükleyici ajanlar cilt mil tahlil ile değerlendirilmesi

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby ...

Research

JoVE Journal

Biology

Construction and Implantation of a Microinfusion System for Sustained Delivery of Neuroactive Agents.

Nöroaktif Acenteleri Sürekli teslim için bir mikroinfüzyon Sistemi İnşaat ve İmplantasyon.

Sustained delivery of neuroactive agents is widely used in neuroscience, but poses many technical challenges. It is necessary to deliver the agent with ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

Clonogenic Testi: yapışkan Hücreler

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Embriyonik Ekstremite Cilt damarları Tüm montaj İmmünohistokimyasal Analizi: Embriyo vasküler dallanma Morphogenesis Eğitim Model Sistemi

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Germ benzeri hücreler içine Yenidoğan Fare Cilt Türetilmiş Kök Hücre Farklılaşma<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Murin Koroner Damar düz kas hücrelerinin izolasyonu

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

Perivasküler Adipose dokularında modülasyon odaklı Izole mezenterik arterlerin kullanıldığı vasküler ton tepkisini değerlendirmek

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic ...

Deep Vascular Imaging in the Eye with Flow-Enhanced Ultrasound

Flow-Enhanced Ultrason ile Gözde Derin Vasküler Görüntüleme

The retina within the eye is one of the most energy-demanding tissues in the body and thus requires high rates of oxygen delivery from a rich blood ...

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

Yapışma Ayak İzi Tahlili ile Hücre Yuvarlanmasında Görüntüleme Moleküler Yapışması

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Kemirgenlerin Kafalarında Tanımlanmış İvmelenmeler Oluşturmak için Pasif Kafa Hareketinin Uygulanması

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Kardiyak ve Vasküler Düz Kas Hücrelerinin Elektrofizyolojik Çalışmalar İçin Yetişkin, Genç, Larva ve Embriyonik Zebra Balıklarından İzolasyonu

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...