Name: virus delivery of crispr guides to the murine prostate for gene alteration
Uploaded: 2018-04-27T15:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration at JoVE.com

Monsieur a été financée par une bourse de la société danoise de cancer (R146-A9394-16-S2). MFB et MKT étaient financés par AUFF NOVA (AUFF-E-2015-FLS-9-8). M. et MFB ont cofinancé par la Graduate School, la santé, AU. Le laboratoire E.F.W. est pris en charge par des subventions du ministère espagnol de l’économie (SAF2015-70857, cofinancé par le FEDER-UE) et un ERC advanced grant (741888 - CSI-Fun).
Nous tenons à remercier Liliana Fajardo Mellor (gènes, le développement et la maladie ; National Cancer Research Center) pour une lecture critique du manuscrit.

Ce protocole implique une intervention chirurgicale chez les souris de laboratoire. Toutes les expériences animales doivent être individuellement examinés et approuvés par un Comité de l’emploi (IACUC) et d’institutionnels animalier. Car l’approche repose sur la survie et de récupération de l’animale, s’assurer anesthésie appropriée, gestion de la douleur et un environnement chirurgical aseptique en tout temps. Utiliser un coussin chauffant pour éviter l’hypothermie pendant l’intervention et jusqu...

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	<li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+incidence+and+mortality+worldwide:+sources,+methods+and+major+patterns+in+GLOBOCAN+2012.">Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012.</a> Int J Cancer. 136, E359-E386 (2015).</li><li>Gerlinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing.">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N Engl J Med. 366, 883-892 (2012).</li><li>Robinson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+Clinical+Genomics+of+Advanced+Prostate+Cancer.">Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer.</a> Cell. 162, 454 (2015).</li><li>Gama Sosa, M. 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Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour modifier l’expression des gènes dans le lobe antérieur de la prostate murine par injection de virus, en créant un nouveau modèle de souris puissante pour cancer de la prostate (Figure 2). L’administration réussie d’un adénovirus a été décrite par Leow et coll. 20058. Nous avons déjà montré comment un adénovirus codant pour une protéine de recombinase Cre peut remplacer des croisements fa...

Détection et le traitement du cancer de la prostate ont considérablement amélioré au cours de la dernière décennie. Pourtant, l’incidence du cancer de la prostate augmente, l’espérance de vie à la suite. Avec environ 1,1 millions nouveaux cas dans le monde entier, il est parmi les causes les plus fréquentes de décès liés au cancer chez les hommes 1. Cancer de la prostate est lent dans son développement, mais lorsque le cancer a progressé à un stade avancé métastatique, le pronostic est médiocre en raison des possibilités de traitement limitée. Jusqu’ici, seulement quelques gènes ont été identifiés comme les pilotes courants dans ce cancer, et son hétérogénéité et multifocality empêche la détection des biomarqueurs et maladie targetable pilotes2,3.
Les techniques classiques de production edged sont souvent affaiblies par leur complexité, les frais en temps opportun et coûts. Modèles knock-out conditionnel ont été employé couramment pour étudier les gènes candidats de cancer de la prostate, qui donnent lieu à une létalité embryonnaire lorsque inactivés dans les cellules germinales4. Les modèles plus courants comportent une recombinase de Cre spécifique de la prostate conduit par soit un Probasin mis à jour le5 ou un promoteur de6 PSA intégrés dans le GEMM de croisement supplémentaire. Dans ces modèles, le gène d’intérêt est ciblé dans la plupart des cellules épithéliales prostatiques, générant une hyperplasie dans l’organe entier, ce qui peut nuire à l’animal de fonction urinaire7.
Livraison viral de la protéine Cre par injection dans le lobe antérieur de la prostate murine peut résoudre ce problème en ciblant seulement quelques cellules8. Pré-requis techniques de laboratoires, d’expertise et objectifs tenant compte, les avantages de la méthode d’un large éventail de variations possibles. Les approches réussies utilisant des adénovirus ciblant JunB et Pten9 ou Lentivirus ciblant le gène Pten et Trp5310 auraient dû être divulgués parmi d’autres. Ajout de transgènes, tels que de la luciférase, la construction virale ou le GEMM permettra en outre une surveillance non invasive de la progression de la maladie par l’intermédiaire de bioluminescence imagerie11.
Génome montage basé sur la technologie CRISPR/Cas9 révèle une occasion nouvelle et rapide pour étudier le cancer grâce à la génération rapide des débouchures somatique12. Livraison virale d’ARN guide unique (sgRNAs) dirigé vers le lobe antérieur de la prostate murine établit un modèle physiologiquement plus pertinent de cancer de la prostate. Par ce moyen, cellules individuelles porteuses de mutations choisies peuvent former des clones capables d’expansion et d’invasion. En outre, utilisation du guide ARN pour plusieurs gènes cibles va générer des clones de cellules avec des altérations dans différents gènes. Cela permettra l’hétérogénéité tumorale et une pression de sélection naturelle sur la progression du cancer, qui peut révéler l’importance de chaque modification génique ou mécanismes épistatiques.
Nous présentons ici une méthode pour délivrer des particules virales à la prostate murine pour altération de l’expression génique. Par une petite incision abdominale, la murin lobe antérieur de la prostate est exposé et les particules virales sont injectées dans le lobe. Cinq jours après la chirurgie, chirurgies clips peuvent être retirés de la peau et le cancer prostatique peut être analysé de 8 semaines après. Dans l’ensemble, il s’agit d’une procédure rapide et rentable, qui a peu d’impact sur la souris et permet la plus grande tumeur de développer sans compromettre la souris.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>26175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,5 ml U-100 insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>324825</td>
			<td>for virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>300013</td>
			<td>for anesthesia injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G 1/2&#39;&#39; needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>304000</td>
			<td>for anesthesia injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Polysorb Suture</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>GL889</td>
			<td>to close the peritoneum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable sterilized surgery drape</td>
			<td>multiple suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>multiple suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-Iodine Prep Pad</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-669-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimming machine</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>GT415</td>
			<td>to shave the abdomen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey Micro Needle Holder</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12500-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow Pattern Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11106-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound Clip System Handle incl. Clips</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12030-01</td>
			<td>to close the skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound Clip System Remover</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12030-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>different models have been used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antisedan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>obtained from the animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butorphanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>obtained from the animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidinhydrochlorid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>obtained from the animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>obtained from the animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-032-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td>Takeda</td>
			<td>7242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virus (AAV, AV)</td>
			<td>multiple suppliers</td>
			<td></td>
			<td>virus used in this protocol is an in-house production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAKT antibody</td>
			<td>CST</td>
			<td>4060</td>
			<td>used 1:200 dillution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP anitbody</td>
			<td>CST</td>
			<td>2956</td>
			<td>used 1:100 dillution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

virus delivery of crispr guides to the murine prostate for gene alteration

Avec une incidence croissante du cancer de la prostate, l’identification de nouveaux pilotes de tumeur ou modulateurs est cruciale. Modèles de souris génétiquement modifiées (GEMM) pour cancer de la prostate sont entravés par l’hétérogénéité tumorale et sa dynamique de microévolution complexes. Modèles murins de cancer de la prostate traditionnels comprennent, entre autres, la lignée germinale et masquages conditionnels, transgénique expression d’oncogènes et des modèles de xénogreffes. Génération de mutations de novo dans ces modèles est complexe, fastidieux et coûteux. En outre, la plupart des modèles traditionnels cible la majorité de l’épithélium de la prostate, tandis que le cancer de la prostate humain est bien connu d’évoluer comme un événement isolé dans un petit sous-ensemble de cellules. Précieux modèles doivent simuler non seulement de début de cancer de la prostate, mais aussi de progression vers la maladie avancée.
Nous décrivons ici une méthode pour cibler quelques cellules de l’épithélium de la prostate par transduction des cellules par des particules virales. La livraison d’un virus machiné pour la prostate murine permet l’altération de l’expression génique dans l’épithélium de la prostate. Quantité et le type de virus par les présentes définira le nombre de cellules ciblées pour modifications géniques de transduction quelques cellules pour le déclenchement du cancer et nombreuses cellules pour la thérapie génique. Par injection à la chirurgie dans le lobe antérieur, distale de la voie urinaire, la tumeur dans ce modèle peut se développer sans nuire à la fonction urinaire de l’animal. En outre, en ciblant uniquement un sous-ensemble de cellules épithéliales prostatiques la technique permet une expansion clonale de la tumeur et imite donc tumorales humaines initiation, progression, ainsi que l’invasion à travers la membrane basale.
Cette nouvelle technique constitue un modèle de cancer de la prostate puissant avec pertinence physiologique améliorée. Souffrance animale est limitée, et puisqu’aucune reproduction supplémentaire n’est requise, nombre d’animaux dans l’ensemble est réduit. Dans le même temps, l’analyse des voies et de nouveaux gènes candidats est accélérée, qui à son tour est plus rentable.

Afin d’évaluer la prestation de virus à la prostate murine, les échantillons ont été analysés trois mois après la chirurgie. Le Rosa26-LSL-Cas9-EGFP souris12 express GFP dans des cellules qui ont été exposés à la Cre protéine exprimée par le virus. Les échantillons de la prostate ont été examinés avec une microscopie à fluorescence pour cerner avec signal GFP (Figure 2 a). Le signal GFP indique l’activité Cre dan...

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Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

Ce protocole décrit une méthode nouvellement créée pour la livraison de virus à la prostate murine. Utilisant la technologie CRISPR/Cas9, surexpression du gène ou livraison recombinase Cre, la technique permet l’orthotopic altération de l’expression génique et implémente un modèle de souris roman pour cancer de la prostate.

Livraison de virus de CRISPR Guides pour la Prostate Murine pour modifications géniques

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Recherche

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Préparation des Exosomes des siARN livraison aux cellules cancéreuses

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