Name: virus delivery of crispr guides to the murine prostate for gene alteration
Uploaded: 2018-04-27T15:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration at JoVE.com

श्री डेनिश कैंसर सोसायटी (R146-A9394-16-S2) से एक फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित किया गया । MFB और मार्केट AUFF नोवा (AUFF-E-२०१५-एफ़एलएस-9-8) द्वारा वित्त पोषित किया गया । श्री और MFB स्नातक स्कूल, स्वास्थ्य, AU द्वारा सह वित्त पोषित किया गया । E.F.W. प्रयोगशाला से अनुदान द्वारा समर्थित है स्पेनी अर्थव्यवस्था के मंत्रालय (SAF2015-70857, सह ERDF द्वारा वित्त पोषित-यूरोपीय संघ) और एक ईआरसी उंनत अनुदान (७४१८८८-सीएसआई-मज़ा) ।
हम Liliana Fajardo Mellor (जीन, विकास और रोग का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं; राष्ट्रीय कैंसर अनुसंधान केंद्र) पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए ।

इस प्रोटोकॉल प्रयोगशाला चूहों में एक शल्य प्रक्रिया शामिल है । सभी पशु प्रयोगों को एक संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा व्यक्तिगत रूप से समीक्षा और अनुमोदित किया जाना चाहिए । दृष्टिकोण के ...

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	<li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+incidence+and+mortality+worldwide:+sources,+methods+and+major+patterns+in+GLOBOCAN+2012.">Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012.</a> Int J Cancer. 136, E359-E386 (2015).</li><li>Gerlinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing.">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N Engl J Med. 366, 883-892 (2012).</li><li>Robinson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+Clinical+Genomics+of+Advanced+Prostate+Cancer.">Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer.</a> Cell. 162, 454 (2015).</li><li>Gama Sosa, M. 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इस प्रोटोकॉल में, हम एक विधि का वर्णन करने के लिए वायरस इंजेक्शन द्वारा murine प्रोस्टेट के पूर्वकाल पालि में जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन, प्रोस्टेट कैंसर के लिए एक शक्तिशाली नए माउस मॉडल बनाने (चि...

पता लगाने और प्रोस्टेट कैंसर के उपचार में काफी पिछले दशक में सुधार हुआ है । फिर भी, प्रोस्टेट कैंसर की घटना बढ़ रही है, जीवन प्रत्याशा के बाद । एक अनुमान के साथ १,१००,००० नए मामलों दुनिया भर में, यह कैंसर के सबसे आम कारणों में से है पुरुषों में मौत से संबंधित 1। प्रोस्टेट कैंसर के विकास में धीमी है, लेकिन जब कैंसर एक उंनत मेटास्टेटिक राज्य में प्रगति की है, रोग का निदान सीमित उपचार के विकल्प के कारण गरीब है । अब तक, केवल कुछ जीन इस कैंसर में आम ड्राइवरों के रूप में पहचान की गई है, और इसकी विविधता और multifocality में बाधा उत्पंन कर रहे है और मार्क्स का पता लगाने के लिए लक्षित रोग ड्राइवरों2,3।
GEMMs पैदा करने की शास्त्रीय तकनीक अक्सर उनकी जटिलता, समय पर खर्च, और लागत से ख़राब कर रहे हैं । सशर्त नॉकआउट मॉडल व्यापक रूप से प्रोस्टेट कैंसर उंमीदवार जीन अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, भ्रूण घातकता में परिणाम है कि जब germline में निष्क्रिय4। सबसे आम मॉडल एक प्रोस्टेट विशेष Cre या तो एक संशोधित बेसिन5 या एक पीएसए6 प्रमोटर अतिरिक्त पार से GEMM में एकीकृत द्वारा संचालित recombinase शामिल प्रजनन । इन मॉडलों में, ब्याज की जीन प्रोस्टेट उपकला कोशिकाओं के बहुमत में लक्षित किया जाएगा, पूरे अंग में हाइपरप्लासिया पैदा कर रहा है, जो जानवरों के मूत्र पथ समारोह7ख़राब हो सकता है.
murine प्रोस्टेट के पूर्वकाल पालि में इंजेक्शन द्वारा Cre प्रोटीन का वायरल वितरण केवल कुछ कोशिकाओं को लक्षित करके इस समस्या को हल कर सकते हैं8. प्रयोगशालाओं तकनीकी पूर्वापेक्षाएं, विशेषज्ञता, और उद्देश्यों को ध्यान में रखते हुए, विधि लाभ संभव विविधताओं की एक विस्तृत श्रृंखला से । सफल एडीनोवायरस लक्ष्यीकरण JunB और Pten9 या Lentivirus लक्ष्यीकरण Pten और Trp5310 के उपयोग के दृष्टिकोण दूसरों के बीच दिखाया गया है । transgenes जोड़ने, इस तरह के luciferase के रूप में वायरल का निर्माण करने के लिए या GEMM इसके अलावा bioluminescence इमेजिंग के माध्यम से रोग प्रगति के गैर इनवेसिव निगरानी सक्षम हो जाएगा11.
जीनोम CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी के आधार पर संपादन एक नया और तेजी से दैहिक पीटकर12के तेजी से उत्पादन के माध्यम से कैंसर का अध्ययन करने का अवसर पता चलता है । murine प्रोस्टेट के पूर्वकाल पालि के लिए निर्देशित एकल गाइड RNAs (sgRNAs) के वायरल प्रसव प्रोस्टेट कैंसर के एक शारीरिक रूप से अधिक प्रासंगिक मॉडल स्थापित करता है । इस तरह से, एकल कोशिकाओं को चुना उत्परिवर्तनों ले जा क्लोन है कि विस्तार और आक्रमण में सक्षम है फार्म कर सकते हैं । इसके अलावा, कई लक्ष्य जीन के लिए गाइड RNAs का उपयोग अलग जीन में परिवर्तन के साथ सेल क्लोन उत्पंन करेगा । यह ट्यूमर विविधता और कैंसर प्रगति, जो प्रत्येक जीन परिवर्तन या epistatic तंत्र के महत्व को प्रकट कर सकते है पर एक प्राकृतिक चयन दबाव की अनुमति होगी ।
यहां हम जीन अभिव्यक्ति के परिवर्तन के लिए murine प्रोस्टेट को वायरल कणों देने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । एक छोटे से उदर चीरा द्वारा, murine पूर्वकाल प्रोस्टेट पालि उजागर और वायरल कणों पालि में इंजेक्ट कर रहे हैं । पांच दिनों के बाद सर्जरी, सर्जिकल क्लिप त्वचा से हटाया जा सकता है और प्रोस्टेट कैंसर से 8 सप्ताह के बाद विश्लेषण किया जा सकता है । कुल मिलाकर, यह एक तेजी से और लागत कुशल प्रक्रिया है, जो माउस पर थोड़ा प्रभाव पड़ता है और बड़ा ट्यूमर माउस समझौता किए बिना विकसित करने की अनुमति देता है ।

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>26175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,5 ml U-100 insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>324825</td>
			<td>for virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>300013</td>
			<td>for anesthesia injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G 1/2&#39;&#39; needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>304000</td>
			<td>for anesthesia injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Polysorb Suture</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>GL889</td>
			<td>to close the peritoneum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable sterilized surgery drape</td>
			<td>multiple suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>multiple suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-Iodine Prep Pad</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-669-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimming machine</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>GT415</td>
			<td>to shave the abdomen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey Micro Needle Holder</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12500-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow Pattern Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11106-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound Clip System Handle incl. Clips</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12030-01</td>
			<td>to close the skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound Clip System Remover</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12030-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>different models have been used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antisedan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>obtained from the animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butorphanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>obtained from the animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidinhydrochlorid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>obtained from the animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>obtained from the animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-032-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td>Takeda</td>
			<td>7242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virus (AAV, AV)</td>
			<td>multiple suppliers</td>
			<td></td>
			<td>virus used in this protocol is an in-house production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAKT antibody</td>
			<td>CST</td>
			<td>4060</td>
			<td>used 1:200 dillution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP anitbody</td>
			<td>CST</td>
			<td>2956</td>
			<td>used 1:100 dillution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

virus delivery of crispr guides to the murine prostate for gene alteration

प्रोस्टेट कैंसर की बढ़ती घटनाओं के साथ, नए ट्यूमर ड्राइवरों या मॉडुलन की पहचान महत्वपूर्ण है । आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल (प्रोस्टेट कैंसर के लिए GEMM) ट्यूमर विविधता और उसके जटिल microevolution गतिशीलता से प्रभावित कर रहे हैं । पारंपरिक प्रोस्टेट कैंसर माउस मॉडल शामिल हैं, दूसरों के बीच, germline और सशर्त नॉकआउट, oncogenes की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति, और xenograft मॉडल । इन मॉडलों में de नोवो उत्परिवर्तनों की पीढ़ी, जटिल समय लेने वाली है, और महंगा है । इसके अलावा, पारंपरिक मॉडलों के अधिकांश प्रोस्टेट उपकला के बहुमत लक्ष्य, जबकि मानव प्रोस्टेट कैंसर अच्छी तरह से केवल कोशिकाओं के एक छोटे सबसेट में एक अलग घटना के रूप में विकसित करने के लिए जाना जाता है. मूल्यवान मॉडल न केवल प्रोस्टेट कैंसर दीक्षा अनुकरण करने की आवश्यकता है, लेकिन यह भी उन्नत रोग के लिए प्रगति.
यहाँ हम वायरल कणों द्वारा transducing कोशिकाओं द्वारा प्रोस्टेट उपकला में कुछ कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए एक विधि का वर्णन. murine प्रोस्टेट के लिए एक इंजीनियर वायरस के वितरण प्रोस्टेट epithelia में जीन अभिव्यक्ति के परिवर्तन की अनुमति देता है । वायरस के प्रकार और मात्रा इसके द्वारा जीन परिवर्तन के लिए लक्षित कोशिकाओं की संख्या को transducing कैंसर दीक्षा और जीन थेरेपी के लिए कई कोशिकाओं के लिए कुछ कोशिकाओं को परिभाषित करेगा । पूर्वकाल पालि में सर्जरी आधारित इंजेक्शन के माध्यम से, मूत्र ट्रैक से बाहर, इस मॉडल में ट्यूमर जानवर के मूत्र समारोह बिगड़ने के बिना विस्तार कर सकते हैं । इसके अलावा, केवल प्रोस्टेट उपकला कोशिकाओं तकनीक का एक सबसेट लक्ष्यीकरण द्वारा ट्यूमर के क्लोनल विस्तार सक्षम बनाता है, और इसलिए मानव ट्यूमर दीक्षा, प्रगति, साथ ही साथ बेसल झिल्ली के माध्यम से आक्रमण की नकल ।
यह उपंयास तकनीक बेहतर शारीरिक प्रासंगिकता के साथ एक शक्तिशाली प्रोस्टेट कैंसर मॉडल प्रदान करता है । पशु पीड़ित सीमित है, और के बाद से कोई अतिरिक्त प्रजनन की आवश्यकता है, समग्र पशु गिनती कम है । एक ही समय में, नए उंमीदवार जीन और रास्ते के विश्लेषण में तेजी आई है, जो बारी में अधिक लागत कुशल है ।

murine प्रोस्टेट को वायरस डिलीवरी का आकलन करने के लिए, नमूनों की सर्जरी के तीन महीने बाद विश्लेषण किया गया । Rosa26-LSL-Cas9-EGFP चूहों की कोशिकाओं में१२ व्यक्त GFP जो विषाणु द्वारा व्यक्त Cre प्रोटीन ...

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Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

इस प्रोटोकॉल murine प्रोस्टेट के लिए वायरस के वितरण के लिए एक नव स्थापित विधि का वर्णन । या तो CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी, जीन एक्सप्रेस, या Cre recombinase वितरण का प्रयोग, तकनीक जीन अभिव्यक्ति के orthotopic परिवर्तन की अनुमति देता है और प्रोस्टेट कैंसर के लिए एक उपंयास माउस मॉडल लागू करता है ।

जीन परिवर्तन के लिए Murine प्रोस्टेट के लिए CRISPR गाइड के वायरस डिलिवरी

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

थकान के एक माउस मॉडल परिधीय विकिरण से प्रेरित

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

पहचान और उपंयास चीर-टैग में जीन हस्तांतरण द्वारा मेटास्टेटिक कारकों के लक्षण वर्णन ; चीर-tva Murine मॉडल

Metastatic cancer accounts for 90% of deaths in patients with solid tumors. There is an urgent need to better understand the drivers of cancer metastasis ...

Generation of Prostate Cancer Cell Models of Resistance to the Anti-mitotic Agent Docetaxel

विरोधी mitotic एजेंट Docetaxel के प्रतिरोध के प्रोस्टेट कैंसर सेल मॉडल की पीढ़ी

Microtubule targeting agents (MTAs) are a mainstay in the treatment of a wide range of tumors. However, acquired resistance to chemotherapeutic drugs is a ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

CRISPR/Cas9 जीन संपादन का प्रयोग Cytokine निर्भर टेम कोशिकाओं में उत्परिवर्ती Calreticulin की Oncogenic गतिविधि की जांच करने के लिए

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

जीभ Extracellular मैट्रिक्स के निर्माण और जीभ स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा में से पुनर्गठन इन विट्रो

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

एक Bioluminescent और फ्लोरोसेंट Orthotopic Syngeneic Murine मॉडल एण्ड्रोजन के आश्रित और बधिया प्रतिरोधी प्रोस्टेट कैंसर

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Phosphopeptide संवर्धन लेबल के साथ युग्मित मुक्त मात्रात्मक जन स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोस्टेट कैंसर में Phosphoproteome की जांच करने के लिए

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

कैंसर कोशिकाओं को सिरना डिलिवरी के लिए Exosomes की तैयारी

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

ऑर्गेनोइड संस्कृति का उपयोग करके माउस प्रोस्टेट एपिथेलियल कोशिकाओं की भेदभाव क्षमता का मूल्यांकन करना

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...