Name: virus delivery of crispr guides to the murine prostate for gene alteration
Uploaded: 2018-04-27T15:30:00
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미스터 덴마크 암 협회 (R146-A9394-16-S2)에서 친목에 의해 투자 되었다. MFB와 시가 AUFF 노바 (AUFF-E-2015-FLS-9-8)에 의해 투자 되었다. 미스터와 MFB 공동 대학원, 건강, AU에 의해 투자 되었다. E.F.W. 실험실은 경제 (SAF2015-70857, ERDF-유럽 연합에 의해 공동 투자)와 그랜트 (741888-과학 수사 대-재미) 고급 한 ERC의 스페인 정부에서 교부 금에 의해 지원 됩니다.
Liliana Fajardo Mellor (유전자, 개발 및 질병; 감사 하겠습니다. 국립 암 연구 센터) 원고의 중요 한 독서에 대 한.

이 프로토콜에는 실험실 쥐에서 수술을 포함 한다. 모든 동물 실험을 개별적으로 검토 하 고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 될 해야 합니다. 동물 복구 및 생존에 접근을 기반으로, 모든 시간에 적절 한 마 취, 통증 관리, 무 균 수술 환경 확인 합니다. 가 열 패드를 사용 하 여 수술 및 마 취에서 회복까지 저체온증을 방지 하기 위해.
1. 시작 시 고려 사항
<ol...

<ol>
	<li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+incidence+and+mortality+worldwide:+sources,+methods+and+major+patterns+in+GLOBOCAN+2012.">Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012.</a> Int J Cancer. 136, E359-E386 (2015).</li><li>Gerlinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing.">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N Engl J Med. 366, 883-892 (2012).</li><li>Robinson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+Clinical+Genomics+of+Advanced+Prostate+Cancer.">Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer.</a> Cell. 162, 454 (2015).</li><li>Gama Sosa, M. 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C., Wang, X. D., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+of+generating+prostate-specific+Cre-LoxP+gene+switching+via+intraductal+delivery+of+adenovirus.">Novel method of generating prostate-specific Cre-LoxP gene switching via intraductal delivery of adenovirus.</a> Prostate. 65, 1-9 (2005).</li><li>Thomsen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+JUNB/AP-1+promotes+invasive+prostate+cancer.">Loss of JUNB/AP-1 promotes invasive prostate cancer.</a> Cell Death Differ. 22, 574-582 (2015).</li><li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+novel+GEM+model+for+metastatic+prostate+cancer+analysis+and+therapy,+reveals+myc+as+a+driver+of+Pten-mutant+metastasis.">a novel GEM model for metastatic prostate cancer analysis and therapy, reveals myc as a driver of Pten-mutant metastasis.</a> Cancer Discov. 4, 318-333 (2014).</li><li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+in+vivo+validation+of+candidate+drivers+derived+from+the+PTEN-mutant+prostate+metastasis+genome.">Rapid in vivo validation of candidate drivers derived from the PTEN-mutant prostate metastasis genome.</a> Methods. 77-78, 197-204 (2015).</li><li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling.">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159, 440-455 (2014).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate-specific+deletion+of+the+murine+Pten+tumor+suppressor+gene+leads+to+metastatic+prostate+cancer.">Prostate-specific deletion of the murine Pten tumor suppressor gene leads to metastatic prostate cancer.</a> Cancer Cell. 4, 209-221 (2003).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+analysis+indicates+monoclonal+origin+of+lethal+metastatic+prostate+cancer.">Copy number analysis indicates monoclonal origin of lethal metastatic prostate cancer.</a> Nat Med. 15, 559-565 (2009).</li><li>Haffner, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+clonal+origin+of+lethal+prostate+cancer.">Tracking the clonal origin of lethal prostate cancer.</a> J Clin Invest. 123, 4918-4922 (2013).</li><li>Daya, S., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+using+adeno-associated+virus+vectors.">Gene therapy using adeno-associated virus vectors.</a> Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).</li><li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Aspects+of+Development+and+Structure+in+the+Prostate.">Comparative Aspects of Development and Structure in the Prostate.</a> Natl Cancer Inst Monogr. 12, 1-27 (1963).</li><li>McNeal, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+prostate:+an+historical+survey+of+divergent+views.">Anatomy of the prostate: an historical survey of divergent views.</a> Prostate. 1, 3-13 (1980).</li><li>Thomsen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX9+elevation+in+the+prostate+promotes+proliferation+and+cooperates+with+PTEN+loss+to+drive+tumor+formation.">SOX9 elevation in the prostate promotes proliferation and cooperates with PTEN loss to drive tumor formation.</a> Cancer Res. 70, 979-987 (2010).</li></ol>

이 프로토콜에서 바이러스 주입에 의해 murine 전립선의 앞쪽 엽에 유전자 발현을 변경 하는 방법에 설명 하 고 전립선 암 (그림 2)에 대 한 강력한 새로운 마우스 모델을 만드는 우리. 아 데 노 바이러스의 성공적인 관리 Leow 그 외 여러분 20058에 의해 처음으로 설명. 우리는 이전 어떻게 Cre recombinase 단백질에 대 한 코딩 하는 아 데 노비 루스 조직 관련 ?...

검색 및 전립선 암 치료는 지난 10 년간 크게 개선 됩니다. 아직도, 전립선 암 발생률은 증가, 수명에 따라. 약 1.1 백만 새로운 경우 전세계, 그것 남자 1에 암 관련 된 죽음의 일반적인 원인 중 하나입니다. 전립선 암은 그 개발에서 속도가 느린 하지만 암 고급 전이성 상태로 진행, 예 후 불량-제한 된 치료 옵션. 지금까지 몇 가지 유전자만이 암에 일반적인 드라이버 확인 되었습니다 그리고 그것의 및 multifocality 방해 biomarkers 및 대상 질병 드라이버2,3의 탐지.
클래식 기법의 생성 GEMMs는 종종 그들의 복잡성, 적시 비용, 및 비용에 의해 손상 됩니다. 조건부 녹아웃 모델 배아 치 생식4에서 비활성화 하는 경우에 발생 하는 전립선 암 후보 유전자 연구에 널리 사용 되어 왔습니다. 가장 일반적인 모델 수정된 Probasin5 중 하나에 의해 구동 전립선 특정 Cre recombinase 또는 PSA6 발기인 추가 교차 사육으로는 GEMM에 통합을 포함 한다. 이 모델에서 대부분 전립선 상피 세포의 증식을 생성 하는 동물의 요로 기능7저하 될 수 있습니다 전체 기관에 관심사의 유전자를 대상 것입니다.
Murine 전립선의 앞쪽 엽에 주입 하 여 Cre 단백질의 바이러스 배달만 몇 셀8을 대상으로 하 여이 문제를 해결할 수 있습니다. 고려 실험실 기술 필수 구성 요소, 전문성, 그리고 목표, 방법 혜택 가능한 변이의 광범위 한 범위에서. 아 데 노비 루스 JunB 와 Pten9 또는 Lentivirus Pten 및 Trp5310 타겟팅 타겟팅을 활용 하 여 성공적인 접근 다른 표시 되었습니다. 바이러스 성 구조 나는 GEMM transgenes luciferase, 등을 추가 또한 생물 발광 영상11통해 질병 진행의 비-침략 적 모니터링 활성화 됩니다.
게놈 편집 CRISPR/Cas9 기술을 기반으로 새롭고 빠른 기회를 체세포 녹아웃12의 빠른 생성을 통해 암 연구를 보여준다. 단일 가이드 RNAs (sgRNAs)의 바이러스 배달 murine 전립선의 앞쪽 엽 감독 전립선 암의 순수 더 관련 모델을 설정 합니다. 이 방법으로 단일 셀 선택한 돌연변이 나르는 확장 및 침략 수 있는 클론을 형성할 수 있다. 또한, 여러 대상 유전자에 대 한 가이드 RNAs의 사용 다른 유전자에 변경 셀 클론을 생성 합니다. 이 각 유전자 변경 또는 epistatic 메커니즘의 중요성을 계시 할 수 있다 암 진행에 종양이 고 자연 선택의 압력을 허용할 것 이다.
여기 우리는 유전자 발현의 변경 murine 전립선에 바이러스 성 입자를 전달 하는 방법을 제시. 작은 복 부 절 개 하 여 murine 앞쪽 전립선 엽 노출 하 고 바이러스 성 입자는 엽에 주입 됩니다. 5 일 수술 후, 수술 클립은 피부에서 제거 될 수 있습니다 그리고 전립선 암은 8 주 후에서 분석 될 수 있다. 전반적으로, 이것은 마우스를 타협 하지 않고 개발에 더 큰 종양 하는 마우스에 작은 영향을 신속 하 고 비용 효율적인 절차.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>26175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,5 ml U-100 insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>324825</td>
			<td>for virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>300013</td>
			<td>for anesthesia injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G 1/2&#39;&#39; needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>304000</td>
			<td>for anesthesia injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Polysorb Suture</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>GL889</td>
			<td>to close the peritoneum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable sterilized surgery drape</td>
			<td>multiple suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>multiple suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-Iodine Prep Pad</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-669-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimming machine</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>GT415</td>
			<td>to shave the abdomen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey Micro Needle Holder</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12500-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow Pattern Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11106-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound Clip System Handle incl. Clips</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12030-01</td>
			<td>to close the skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound Clip System Remover</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12030-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>different models have been used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antisedan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>obtained from the animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butorphanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>obtained from the animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidinhydrochlorid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>obtained from the animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>obtained from the animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-032-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td>Takeda</td>
			<td>7242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virus (AAV, AV)</td>
			<td>multiple suppliers</td>
			<td></td>
			<td>virus used in this protocol is an in-house production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAKT antibody</td>
			<td>CST</td>
			<td>4060</td>
			<td>used 1:200 dillution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP anitbody</td>
			<td>CST</td>
			<td>2956</td>
			<td>used 1:100 dillution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

virus delivery of crispr guides to the murine prostate for gene alteration

전립선 암의 증가 발생, 새로운 종양 드라이버 또는 변조기의 식별은 결정적 이다. 전립선 암에 대 한 유전자 조작된 마우스 모델 (GEMM) 종양이 성분 및 그것의 복잡 한 microevolution 역학에 의해 방해 된다. 전통적인 전립선 암 마우스 모델을 포함, 다른 사람, 사이 생식 및 조건부 녹아웃, oncogenes, 및이 종이 식 모델의 유전자 변형 식. 이러한 모델에 de novo 돌연변이의 발생은, 시간이 걸리는, 복잡 하 고 비용이 많이 드는. 또한, 전통적인 모델의 대부분 인간의 전립선 암 세포의 작은 하위 집합만 있는 고립 된 이벤트로 진화 하는 잘 알려진 반면 전립선 상피의 대다수를 대상. 귀중 한 모델 전립선 암 개시 뿐만 아니라 고급 질병 진행을 시뮬레이션 해야 합니다.
여기는 바이러스 입자에 의해 전립선 상피 세포를 시험 하 여 몇 가지 셀을 대상 하는 방법에 설명 합니다. Murine 전립선에는 설계 된 바이러스의 배달 전립선 epithelia에 유전자 발현의 변경 수 있습니다. 바이러스 유형 및 수량 이로써 암 개시에 대 한 몇 가지 세포 및 유전자 치료에 대 한 많은 셀 시험에 의해 유전자 변경 대상된 셀 수를 정의 합니다. 앞쪽 엽, 비뇨 기 추적에서 원심에서 수술 기반 주사를 통해이 모델에서 종양 동물의 오 줌 기능을 방해 하지 않고 확장할 수 있습니다. 또한, 전립선 상피 세포의 하위 집합만 대상으로 기술, 종양의 클론 확장을 가능 하 게 하 고 따라서 인간의 종양 개시, 진행, 뿐만 아니라 기저 막 통해 침공을 싫어 하지.
이 새로운 기술은 향상 된 생리 적인 관련성 강력한 전립선 암 모델을 제공합니다. 동물의 고통을 제한, 되며 아무 추가 사육 필수 이기 때문에, 전체 동물 수를 줄일 수 있다. 동시에 새로운 후보 유전자 및 통로의 분석 가속, 차례 차례로 더 비용 효율적입니다.

평가 murine 전립선에 바이러스 배달, 샘플 수술 후 3 개월을 분석 했다. Rosa26-LSL-Cas9-EGFP 쥐12 셀 Cre 단백질은 바이러스에 의해 표현에 노출에 GFP를 표현 한다. 전립선 샘플 GFP 신호 (그림 2A) 영역을 식별 하는 형광 현미경 검사 법으로 시험 되었다. GFP 신호 전립선 상피만 하지 여부 유전자 편집 유도 하고있다 CRISPR 가이드 Cre 활동을 나?...

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Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

이 프로토콜 murine 전립선에 바이러스 배달 하는 새로 설립된 방법을 설명합니다. CRISPR/Cas9 기술, 유전자 overexpression 또는 Cre recombinase 배달 사용 하 여, 기술 유전자 발현의 orthotopic 변경 허용 하 고 전립선 암에 대 한 새로운 마우스 모델을 구현.

CRISPR의 바이러스 배달 Murine 전립선 유전자 변경에 대 한 가이드

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

주변 방사선 조사에 의해 유도 된 피로의 마우스 모델

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

연구

암 연구학

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

식별 및 태그-소설 RIP;으로 유전자 이동에 의해 전이성 요인의 특성 RIP-tva Murine 모델

Metastatic cancer accounts for 90% of deaths in patients with solid tumors. There is an urgent need to better understand the drivers of cancer metastasis ...

Generation of Prostate Cancer Cell Models of Resistance to the Anti-mitotic Agent Docetaxel

반대로 mitotic 에이전트 Docetaxel에 전립선 암 세포 모델의 생성

Microtubule targeting agents (MTAs) are a mainstay in the treatment of a wide range of tumors. However, acquired resistance to chemotherapeutic drugs is a ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

CRISPR/Cas9를 사용 하 여 유전자 돌연변이 Calreticulin Cytokine 종속 조 혈 모 세포에서의 종양 활동을 조사 하기 위해 편집

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

혀 기질과 혀 편평 세포 암 종에서 생체 외에서 의 재구성의 제조

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

발광 및 형광 Orthotopic Syngeneic Murine 모델 Androgen 종속 및 거세 내성 전립선 암

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

전립선 암에 있는 Phosphoproteome를 조사 하기 위해 양적 라벨 무료 질량 분석으로 결합 된 Phosphopeptide 농축

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

SiRNA 암 세포에 배달에 대 한 Exosomes의 준비

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

유기체 배양을 사용하여 마우스 전립선 상피 세포의 분화 능력 평가

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...