Name: virus delivery of crispr guides to the murine prostate for gene alteration
Uploaded: 2018-04-27T15:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration at JoVE.com

Г-н финансировался стипендий от датской онкологическое общество (R146-A9394-16-S2). MFB и MKT финансировались, Нова AUFF (AUFF-E-2015-FLS-9-8). Г-н и MFB совместно финансируется выпускник школы, здравоохранение, АС. Лаборатория E.F.W. поддерживается грантов от министерства экономики (SAF2015-70857, совместно финансируемые ЕФРР-ЕС) и КЧП расширенный Грант (741888 - CSI-Fun) Испании.
Мы хотим поблагодарить Лилиана Fajardo Меллор (генов, развития и болезней; Национальный онкологический исследовательский центр) для критических чтении рукописи.

Этот протокол включает хирургическая процедура в лабораторных мышей. Все эксперименты на животных должны быть индивидуально рассматриваются и утверждаются институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC). Как подход основан на животных восстановления и выживания, обесп?...

<ol>
	<li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+incidence+and+mortality+worldwide:+sources,+methods+and+major+patterns+in+GLOBOCAN+2012.">Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012.</a> Int J Cancer. 136, E359-E386 (2015).</li><li>Gerlinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing.">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N Engl J Med. 366, 883-892 (2012).</li><li>Robinson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+Clinical+Genomics+of+Advanced+Prostate+Cancer.">Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer.</a> Cell. 162, 454 (2015).</li><li>Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+transgenesis:+an+overview.">Animal transgenesis: an overview.</a> Brain Struct Funct. 214, 91-109 (2010).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+prostate+epithelial+cell-specific+Cre+transgenic+mouse+model+for+tissue-specific+gene+ablation.">Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation.</a> Mech Dev. 101, 61-69 (2001).</li><li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+biallelic+inactivation+of+Pten+in+the+mouse+prostate+leads+to+prostate+cancer+accompanied+by+increased+epithelial+cell+proliferation+but+not+by+reduced+apoptosis.">Targeted biallelic inactivation of Pten in the mouse prostate leads to prostate cancer accompanied by increased epithelial cell proliferation but not by reduced apoptosis.</a> Cancer Res. 65, 5730-5739 (2005).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+p53-dependent+cellular+senescence+in+suppression+of+Pten-deficient+tumorigenesis.">Crucial role of p53-dependent cellular senescence in suppression of Pten-deficient tumorigenesis.</a> Nature. 436, 725-730 (2005).</li><li>Leow, C. C., Wang, X. D., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+of+generating+prostate-specific+Cre-LoxP+gene+switching+via+intraductal+delivery+of+adenovirus.">Novel method of generating prostate-specific Cre-LoxP gene switching via intraductal delivery of adenovirus.</a> Prostate. 65, 1-9 (2005).</li><li>Thomsen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+JUNB/AP-1+promotes+invasive+prostate+cancer.">Loss of JUNB/AP-1 promotes invasive prostate cancer.</a> Cell Death Differ. 22, 574-582 (2015).</li><li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+novel+GEM+model+for+metastatic+prostate+cancer+analysis+and+therapy,+reveals+myc+as+a+driver+of+Pten-mutant+metastasis.">a novel GEM model for metastatic prostate cancer analysis and therapy, reveals myc as a driver of Pten-mutant metastasis.</a> Cancer Discov. 4, 318-333 (2014).</li><li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+in+vivo+validation+of+candidate+drivers+derived+from+the+PTEN-mutant+prostate+metastasis+genome.">Rapid in vivo validation of candidate drivers derived from the PTEN-mutant prostate metastasis genome.</a> Methods. 77-78, 197-204 (2015).</li><li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling.">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159, 440-455 (2014).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate-specific+deletion+of+the+murine+Pten+tumor+suppressor+gene+leads+to+metastatic+prostate+cancer.">Prostate-specific deletion of the murine Pten tumor suppressor gene leads to metastatic prostate cancer.</a> Cancer Cell. 4, 209-221 (2003).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+analysis+indicates+monoclonal+origin+of+lethal+metastatic+prostate+cancer.">Copy number analysis indicates monoclonal origin of lethal metastatic prostate cancer.</a> Nat Med. 15, 559-565 (2009).</li><li>Haffner, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+clonal+origin+of+lethal+prostate+cancer.">Tracking the clonal origin of lethal prostate cancer.</a> J Clin Invest. 123, 4918-4922 (2013).</li><li>Daya, S., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+using+adeno-associated+virus+vectors.">Gene therapy using adeno-associated virus vectors.</a> Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).</li><li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Aspects+of+Development+and+Structure+in+the+Prostate.">Comparative Aspects of Development and Structure in the Prostate.</a> Natl Cancer Inst Monogr. 12, 1-27 (1963).</li><li>McNeal, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+prostate:+an+historical+survey+of+divergent+views.">Anatomy of the prostate: an historical survey of divergent views.</a> Prostate. 1, 3-13 (1980).</li><li>Thomsen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX9+elevation+in+the+prostate+promotes+proliferation+and+cooperates+with+PTEN+loss+to+drive+tumor+formation.">SOX9 elevation in the prostate promotes proliferation and cooperates with PTEN loss to drive tumor formation.</a> Cancer Res. 70, 979-987 (2010).</li></ol>

В этом протоколе мы описываем метод для изменения экспрессии генов в передней доле мышиных предстательной железы путем инъекции вируса, создание мощной новой модели мыши для рака простаты (рис. 2). Успешного управления аденовирус был впервые описан Leow et al. в 2005 году<s...

За последнее десятилетие значительно улучшились обнаружения и лечения рака простаты. Тем не менее растет заболеваемость раком простаты, после ожидаемой продолжительности жизни. С приблизительно 1,1 миллиона новых случаев во всем мире это среди наиболее распространенных причин связанных с раком смерти мужчин 1. Рак предстательной железы является медленным в своем развитии, но когда рак прогрессировала в передовых метастатическим состояние, прогноз плохо из-за ограниченного лечения. Пока только несколько генов были определены как общие драйвера в этой рака, и его неоднородности и multifocality препятствует обнаружению биомаркеров и ориентации болезнь водители2,3.
Классические методы генерации GEMMs часто препятствовали их сложности, своевременно расходы и издержки. Условное нокаут модели широко использовался для изучения рака простаты кандидат гены, которые приводят к эмбриональной летальность при инактивированная микрофлорой4. Наиболее распространенные модели связаны рекомбиназа Cre простат специфического, движимый либо модифицированных Probasin5 или6 промоутер PSA интегрированы в ГЭММ, дополнительные метисации. В этих моделях гена интереса будут направлены в большинстве эпителиальных клеток простаты, генерации гиперплазии в весь орган, который может нарушить животного мочевыделительной функции7.
Вирусная доставки Cre белка путем инъекций в передней доле мышиных предстательной железы может решить эту проблему, только против нескольких клеток8. Принимая во внимание, метод выгоды от широкого круга возможных вариантов лаборатории технические предпосылки, опыт и целей. Успешные подходы, используя аденовирус, Хунб и Pten9 или человека, ориентация Pten и Trp5310 показали среди других. Добавление трансгенов, например Люцифераза, вирусный конструкции или ГЭММ Кроме того позволит Неинвазивный мониторинг прогрессирования заболевания через биолюминесценции изображений11.
Изменения генома, основанный на технологии ТРИФОСФАТЫ/Cas9 показывает новая и быстрая возможность изучить рака путем быстрого поколения соматических нокауты12. Вирусная доставки одного руководство РНК (sgRNAs) направлена к передней доле мышиных простаты устанавливает физиологически более соответствующие модели рака простаты. Таким образом отдельные клетки, переноски выбранной мутации могут образовывать клоны, которые способны расширения и вторжения. Кроме того использование руководство РНК для нескольких целевых генов будет создавать клоны клеток с изменениями в различных генов. Это позволит опухоли неоднородность и естественного отбора давления на прогрессии рака, который может выявить важность каждого гена изменения или epistatic механизмов.
Здесь мы представляем способ доставить вирусных частиц в мышиных простаты для изменения экспрессии генов. С небольшой разрез брюшной подвергается мышиных передней доле предстательной железы и вирусных частиц вводят в мочку. Пять дней после операции, хирургические зажимы могут быть удалены с поверхности кожи и рака предстательной железы могут быть проанализированы из 8 недель после. В целом это быстрый и экономичный процедура, которая имеет незначительное влияние на мыши и позволяет больше опухоли развивать без ущерба для мыши.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>26175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,5 ml U-100 insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>324825</td>
			<td>for virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>300013</td>
			<td>for anesthesia injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G 1/2&#39;&#39; needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>304000</td>
			<td>for anesthesia injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Polysorb Suture</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>GL889</td>
			<td>to close the peritoneum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable sterilized surgery drape</td>
			<td>multiple suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>multiple suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-Iodine Prep Pad</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-669-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimming machine</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>GT415</td>
			<td>to shave the abdomen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey Micro Needle Holder</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12500-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow Pattern Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11106-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound Clip System Handle incl. Clips</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12030-01</td>
			<td>to close the skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound Clip System Remover</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12030-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>different models have been used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antisedan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>obtained from the animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butorphanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>obtained from the animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidinhydrochlorid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>obtained from the animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>obtained from the animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-032-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td>Takeda</td>
			<td>7242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virus (AAV, AV)</td>
			<td>multiple suppliers</td>
			<td></td>
			<td>virus used in this protocol is an in-house production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAKT antibody</td>
			<td>CST</td>
			<td>4060</td>
			<td>used 1:200 dillution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP anitbody</td>
			<td>CST</td>
			<td>2956</td>
			<td>used 1:100 dillution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

virus delivery of crispr guides to the murine prostate for gene alteration

Рост заболеваемости раком простаты выявление новых драйверов опухоли или модуляторы имеет решающее значение. Генетически модифицированные мыши модели (ГЭММ) для рака простаты сдерживаются неоднородность опухоли и ее динамика сложных Микроэволюция. Модели мыши традиционных рака простаты включают, среди прочего, микрофлорой и условного нокауты, трансгенных выражение онкогенов и гранулы ксенотрансплантата моделей. Поколение de novo мутаций в этих моделях является сложным, длительным и дорогостоящим. Кроме того большинство традиционных моделей целевой большинство эпителия простаты, в то время как хорошо известно человека рак простаты развиваться как изолированное событие в только небольшое подмножество ячеек. Ценность модели необходимо моделировать не только начало рака простаты, но и прогрессирования заболевания.
Здесь мы описываем метод целевым несколько ячеек путем преобразования клеток в эпителии простаты вирусных частиц. Доставка инженерии вируса в мышиных простаты позволяет изменения экспрессии генов в эпителия простаты. Тип вируса и количество будут настоящим определяется количество целевых ячеек для изменения гена преобразователя несколько клетки для начала рака и многие клетки для генной терапии. Через на основе хирургии инъекций, в передней доле, дистальная от мочевыводящих путей трек опухоли в этой модели можно развернуть без ущерба функцию мочи животного. Кроме того выбирая только подмножество эпителиальных клеток простаты техника позволяет клоновых расширения опухоли и поэтому имитирует человека опухоли посвящения, прогрессии, а также вторжения через базальную мембрану.
Этот роман техника обеспечивает мощный рака простаты модель с улучшение физиологических актуальность. Страдания животных ограничен, и поскольку без дополнительного размножения требуется, уменьшается общая животных игр. В то же время анализ новых генов кандидата и пути ускорения, который в свою очередь является более экономически эффективным.

Чтобы оценить вирус доставки мышиных простаты, образцы были проанализированы три месяца после операции. Rosa26-LSL-Cas9-EGFP мышей12 Экспресс GFP в клетках, которые были подвержены Cre белка, выраженные вирус. Простаты образцы были рассмотрены с флуоресцентной микрос...

Watch this Scientific Journal Video about Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration at JoVE.com

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

Этот протокол описывает недавно созданный метод для доставки вирус мышиных простаты. Использование технологии ТРИФОСФАТЫ/Cas9, гиперэкспрессия генов или Cre рекомбиназа поставка, техника позволяет ортотопическая изменения экспрессии генов и реализует модель Роман мыши для рака простаты.

Вирус доставки ТРИФОСФАТЫ руководств для мышиных простаты для изменения гена

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Мышь Модель усталости, индуцированный Peripheral Облучение

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Определение и характеристика метастатическим факторов путем переноса генов в романе RIP-тег; РИП tva мышиных модель

Metastatic cancer accounts for 90% of deaths in patients with solid tumors. There is an urgent need to better understand the drivers of cancer metastasis ...

Generation of Prostate Cancer Cell Models of Resistance to the Anti-mitotic Agent Docetaxel

Поколение моделей клеток рака простаты сопротивления против митотическая агент доцетаксел

Microtubule targeting agents (MTAs) are a mainstay in the treatment of a wide range of tumors. However, acquired resistance to chemotherapeutic drugs is a ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

С помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9 гена, редактирования для изучения онкогенных активность мутантов Calreticulin в зависимых Cytokine гемопоэтических клеток

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Изготовление язык внеклеточного матрикса и воссоздание язык плоскоклеточный рак в пробирке

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

Биолюминесцентных и флуоресцентный ортотопическая сингенных мышиных модель андроген зависимых и кастрация стойкие рака простаты

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Phosphopeptide обогащения, в сочетании с Label бесплатно количественного масс-спектрометрии для расследования Phosphoproteome рака простаты

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

Подготовка Exosomes siRNA доставки раковых клеток

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

Оценка дифференциации потенциала мыши простаты эпителиальных клеток с использованием органоидной культуры

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...