Name: virus delivery of crispr guides to the murine prostate for gene alteration
Uploaded: 2018-04-27T15:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration at JoVE.com

Señor fue financiado por una beca de la sociedad danesa del cáncer (R146-A9394-16-S2). MFB y MKT fueron financiados por AUFF NOVA (AUFF-E-2015-FLS-9-8). Señor y MFB fueron financiado por la escuela de postgrado, salud, AU. El laboratorio E.F.W. es apoyado por becas del Ministerio de economía (SAF2015-70857, cofinanciado por el FEDER de la UE) y una ERC advanced grant (741888 - CSI-Fun).
Queremos agradecer a Liliana Fajardo Mellor (Genes, desarrollo y enfermedad; Centro Nacional de investigación de cáncer) para la lectura crítica del manuscrito.

Este protocolo trata de un procedimiento quirúrgico en ratones de laboratorio. Todos los experimentos con animales deben ser revisados y aprobados por un cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) individualmente. Como el enfoque se basa en la supervivencia y recuperación de animales, asegurar adecuada anestesia, manejo del dolor y un ambiente quirúrgico aséptico en todos los tiempos. Use una almohadilla de calefacción para prevenir la hipotermia durante la cirugía y hasta la recuperación de la anes...

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	<li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+incidence+and+mortality+worldwide:+sources,+methods+and+major+patterns+in+GLOBOCAN+2012.">Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012.</a> Int J Cancer. 136, E359-E386 (2015).</li><li>Gerlinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing.">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N Engl J Med. 366, 883-892 (2012).</li><li>Robinson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+Clinical+Genomics+of+Advanced+Prostate+Cancer.">Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer.</a> Cell. 162, 454 (2015).</li><li>Gama Sosa, M. 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C., Wang, X. D., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+of+generating+prostate-specific+Cre-LoxP+gene+switching+via+intraductal+delivery+of+adenovirus.">Novel method of generating prostate-specific Cre-LoxP gene switching via intraductal delivery of adenovirus.</a> Prostate. 65, 1-9 (2005).</li><li>Thomsen, M. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+clonal+origin+of+lethal+prostate+cancer.">Tracking the clonal origin of lethal prostate cancer.</a> J Clin Invest. 123, 4918-4922 (2013).</li><li>Daya, S., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+using+adeno-associated+virus+vectors.">Gene therapy using adeno-associated virus vectors.</a> Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).</li><li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Aspects+of+Development+and+Structure+in+the+Prostate.">Comparative Aspects of Development and Structure in the Prostate.</a> Natl Cancer Inst Monogr. 12, 1-27 (1963).</li><li>McNeal, J. 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En este protocolo, se describe un método para alterar la expresión génica en el lóbulo anterior de la próstata murina por inyección de virus, creando un poderoso nuevo modelo de ratón para cáncer de próstata (figura 2). La administración exitosa de un Adenovirus primero fue descrita por Leow et en 20058. Anteriormente hemos mostrado cómo un Adenovirus que codifica para una proteína del recombinase de Cre puede substituir cruces desperdiciadora de ...

Detección y tratamiento del cáncer de próstata han mejorado significativamente durante la última década. Aún así, la incidencia de cáncer de próstata está aumentando, a raíz de la esperanza de vida. Con un estimado 1,1 millones nuevos casos en todo el mundo, es una de las causas más comunes de muerte relacionada con cáncer en los hombres 1. El cáncer de próstata es lento en su desarrollo, pero cuando el cáncer ha progresado a un estado metastásico avanzado, el pronóstico es pobre debido a las opciones de tratamiento limitadas. Hasta ahora, sólo unos pocos genes se han identificado como controladores comunes de este cáncer, y su heterogeneidad y multifocalidad impide la detección de biomarcadores y enfermedad targetable controladores2,3.
Técnicas clásicas de GEMMs generación a menudo se deterioran por su complejidad, gastos de tiempo y costos. Modelos condicionales han sido ampliamente utilizados para el estudio de genes candidatos de cáncer de próstata, que resultan en mortalidad embrionaria cuando inactivado en la línea germinal4. Modelos más comunes implican un recombinase de Cre prostático específico conducido por cualquiera un Probasin modificado5 o promotor PSA6 integrada en el GEMM por cruzamiento adicional. En estos modelos, el gen de interés estará dirigido en la mayoría de las células epiteliales prostáticas, generación de hiperplasia en el órgano entero, que puede perjudicar tracto urinario función7 del animal.
Entrega viral de la proteína de Cre por inyección en el lóbulo anterior de la próstata murina puede resolver este problema dirigiéndose sólo a unas pocas células8. Teniendo en cuenta, los beneficios del método de una amplia gama de variaciones posibles requisitos técnicos de laboratorios, conocimientos y objetivos. Enfoques exitosos utilizando Adenovirus a JunB y Pten9 o Lentivirus a Pten y Trp5310 ha demostrado entre otros. Agregar los transgenes, como luciferasa, el constructo viral o el GEMM además permitirá monitorización no invasiva de progresión de la enfermedad mediante bioluminiscencia imagen11.
La edición del genoma basado en la tecnología CRISPR/Cas9 revela una oportunidad nueva y rápida para el estudio de cáncer a través de la rápida generación de nocauts somática12. Entrega viral solo guía RNAs (sgRNAs) dirigida al lóbulo anterior de la próstata murino establece un modelo fisiológico más relevante del cáncer de próstata. De esta forma, las células con mutaciones solicitadas pueden formar clones capaces de expansión y de invasión. Además, uso de guía RNAs para varios genes diana va a generar clones de células con alteraciones en distintos genes. Esto permitirá que la heterogeneidad del tumor y una presión de selección natural en la progresión del cáncer, que puede revelar la importancia de cada alteración de genes o mecanismos epistáticas.
Aquí presentamos un método para entregar partículas virales a la próstata murina para alteración de la expresión génica. Por una pequeña incisión abdominal, se expone el lóbulo prostático anterior murino y se inyectan partículas virales en el lóbulo. Cinco días después de la cirugía, quirúrgicos clips pueden eliminarse de la piel y el cáncer prostático puede ser analizada desde 8 semanas después. En general, este es un procedimiento rápido y eficiente, que tiene poco impacto en el ratón y permite mayor tumor sin comprometer el ratón.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>26175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,5 ml U-100 insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>324825</td>
			<td>for virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>300013</td>
			<td>for anesthesia injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G 1/2&#39;&#39; needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>304000</td>
			<td>for anesthesia injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Polysorb Suture</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>GL889</td>
			<td>to close the peritoneum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable sterilized surgery drape</td>
			<td>multiple suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>multiple suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-Iodine Prep Pad</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-669-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimming machine</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>GT415</td>
			<td>to shave the abdomen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey Micro Needle Holder</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12500-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow Pattern Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11106-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound Clip System Handle incl. Clips</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12030-01</td>
			<td>to close the skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound Clip System Remover</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12030-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>different models have been used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antisedan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>obtained from the animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butorphanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>obtained from the animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidinhydrochlorid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>obtained from the animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>obtained from the animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-032-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td>Takeda</td>
			<td>7242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virus (AAV, AV)</td>
			<td>multiple suppliers</td>
			<td></td>
			<td>virus used in this protocol is an in-house production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAKT antibody</td>
			<td>CST</td>
			<td>4060</td>
			<td>used 1:200 dillution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP anitbody</td>
			<td>CST</td>
			<td>2956</td>
			<td>used 1:100 dillution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

virus delivery of crispr guides to the murine prostate for gene alteration

Con una incidencia creciente del cáncer de próstata, identificación de nuevos controladores de tumor o moduladores es crucial. Modelos de ratón modificados genéticamente (GEMM) para cáncer de próstata se ven obstaculizados por la heterogeneidad del tumor y su dinámica compleja de la microevolución. Modelos de ratón de cáncer de próstata tradicionales incluyen, entre otros, del germline y nocauts condicionales, la expresión transgénica de oncogenes y modelos de xenoinjerto. Generación de mutaciones de novo en estos modelos es complejo, lento y costoso. Además, la mayoría de los modelos tradicionales de destino la mayoría del epitelio prostático, mientras que el cáncer de próstata humano es bien sabido evolucionar como un evento aislado en sólo un pequeño subconjunto de células. Modelos valiosos deben simular no sólo iniciación del cáncer de próstata, pero también la progresión a enfermedad avanzada.
Aquí se describe un método para atacar algunas células en el epitelio de la próstata las células transductoras de partículas virales. La entrega de un virus dirigido a la próstata murina permite la alteración de la expresión génica en el epitelio de la próstata. Cantidad y tipo de virus por este medio definirá el número de células específicas de alteración genética por transducción de algunas células para la iniciación del cáncer y muchas células para la terapia génica. A través de inyección basados en cirugía en el lóbulo anterior, distal de la vía urinaria, el tumor en este modelo puede ampliarse sin deteriorar la función urinaria del animal. Además, dirigiéndose a sólo un subconjunto de células epiteliales prostáticas la técnica permite expansión clonal del tumor y por lo tanto imita la iniciación del tumor humano, progresión, así como invasión a través de la membrana basal.
Esta novedosa técnica ofrece un modelo de cáncer de próstata de gran alcance con mayor relevancia fisiológica. Sufrimiento de los animales es limitado, y ya no cría adicional se requiere, en general animal cuenta se reduce. Al mismo tiempo, se aceleraron el análisis de nuevos genes candidatos y vías, que a su vez es más rentable.

Evaluar la distribución de virus a la próstata murina, analizaron muestras de tres meses después de la cirugía. Rosa26-LSL-Cas9-EGFP ratones12 expresan GFP en células que han sido expuestos a la proteína de Cre expresada por el virus. Las muestras de la próstata fueron examinadas con un microscopio de fluorescencia para identificar áreas con señal de GFP (figura 2A). La señal GFP indica actividad Cre en el epitelio de la pró...

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Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

Este protocolo describe un método nuevo para la entrega del virus a la próstata murina. Usando tecnología CRISPR/Cas9, sobreexpresión del gen o entrega del recombinase de Cre, la técnica permite orthotopic alteración de la expresión génica e implementa un modelo novedoso ratón para cáncer de próstata.

Virus de la entrega de guías CRISPR para la próstata murina por alteración del gen

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Un modelo de ratón de la fatiga inducida por irradiación periférica

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Identificación y caracterización de factores metastásicos por transferencia de genes dentro de la novela RIP-etiqueta; RIP-tva modelo murino

Metastatic cancer accounts for 90% of deaths in patients with solid tumors. There is an urgent need to better understand the drivers of cancer metastasis ...

Generation of Prostate Cancer Cell Models of Resistance to the Anti-mitotic Agent Docetaxel

Generación de modelos de celulares de cáncer de próstata de la resistencia a lo agente anti-mitotic Docetaxel

Microtubule targeting agents (MTAs) are a mainstay in the treatment of a wide range of tumors. However, acquired resistance to chemotherapeutic drugs is a ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

Utilizando CRISPR/Cas9 Gene edición para investigar la actividad oncogénica del mutante calreticulina en dependiente de citoquinas de células hematopoyéticas

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Fabricación de la matriz extracelular de la lengua y reconstitución de células escamosas de lengua In Vitro

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

Un modelo murino Syngeneic bioluminiscente y fluorescente ortotópico de cáncer de próstata andrógeno-dependiente y resistente a la castración

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Enriquecimiento de fosfopéptidos acoplada con espectrometría de masa libre de etiqueta cuantitativa para investigar la Phosphoproteome en cáncer de próstata

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

Preparación de exosomas siRNA entrega a las células cancerosas

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

Evaluación de la capacidad de diferenciación de las células epiteliales de próstata de ratón utilizando el cultivo organoide

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

In Vitro Establecimiento de una línea celular de cáncer de cabeza y cuello de murine genéticamente diseñada utilizando un sistema de virus Cas9 asociado con Adeno