Name: virus delivery of crispr guides to the murine prostate for gene alteration
Uploaded: 2018-04-27T15:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration at JoVE.com

Herr finansierades av ett stipendium från den danska Cancerfonden (R146-A9394-16-S2). MFB och MKT finansierades av AUFF NOVA (AUFF-E-2015-FLS-9-8). Herr och MFB var medfinansieras av Graduate School, hälsa, AU. E.F.W. laboratoriet stöds genom bidrag från det spanska ministeriet för ekonomi (SAF2015-70857, medfinansieras av ERUF-EU) och ett ERC advanced grant (741888 - CSI-roligt).
Vi vill tacka Liliana Fajardo Mellor (gener, utveckling och sjukdom; National Cancer Research Center) för kritisk läsning av manuskriptet.

Detta protokoll innebär ett kirurgiskt ingrepp i laboratoriemöss. Alla djurförsök måste individuellt granskas och godkännas av en institutionell djur vård och användning kommittén (IACUC). Som metoden bygger på djur återhämtning och överlevnad, säkerställa lämplig anestesi, smärtlindring och en aseptiska kirurgiska miljö hela tiden. Använda en värmedyna för att förhindra hypotermi under operation och tills återhämtning från anestesi.
1. Starta överväganden
<ol><li>...

<ol>
	<li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+incidence+and+mortality+worldwide:+sources,+methods+and+major+patterns+in+GLOBOCAN+2012.">Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012.</a> Int J Cancer. 136, E359-E386 (2015).</li><li>Gerlinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing.">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N Engl J Med. 366, 883-892 (2012).</li><li>Robinson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+Clinical+Genomics+of+Advanced+Prostate+Cancer.">Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer.</a> Cell. 162, 454 (2015).</li><li>Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+transgenesis:+an+overview.">Animal transgenesis: an overview.</a> Brain Struct Funct. 214, 91-109 (2010).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+prostate+epithelial+cell-specific+Cre+transgenic+mouse+model+for+tissue-specific+gene+ablation.">Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation.</a> Mech Dev. 101, 61-69 (2001).</li><li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+biallelic+inactivation+of+Pten+in+the+mouse+prostate+leads+to+prostate+cancer+accompanied+by+increased+epithelial+cell+proliferation+but+not+by+reduced+apoptosis.">Targeted biallelic inactivation of Pten in the mouse prostate leads to prostate cancer accompanied by increased epithelial cell proliferation but not by reduced apoptosis.</a> Cancer Res. 65, 5730-5739 (2005).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+p53-dependent+cellular+senescence+in+suppression+of+Pten-deficient+tumorigenesis.">Crucial role of p53-dependent cellular senescence in suppression of Pten-deficient tumorigenesis.</a> Nature. 436, 725-730 (2005).</li><li>Leow, C. C., Wang, X. D., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+of+generating+prostate-specific+Cre-LoxP+gene+switching+via+intraductal+delivery+of+adenovirus.">Novel method of generating prostate-specific Cre-LoxP gene switching via intraductal delivery of adenovirus.</a> Prostate. 65, 1-9 (2005).</li><li>Thomsen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+JUNB/AP-1+promotes+invasive+prostate+cancer.">Loss of JUNB/AP-1 promotes invasive prostate cancer.</a> Cell Death Differ. 22, 574-582 (2015).</li><li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+novel+GEM+model+for+metastatic+prostate+cancer+analysis+and+therapy,+reveals+myc+as+a+driver+of+Pten-mutant+metastasis.">a novel GEM model for metastatic prostate cancer analysis and therapy, reveals myc as a driver of Pten-mutant metastasis.</a> Cancer Discov. 4, 318-333 (2014).</li><li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+in+vivo+validation+of+candidate+drivers+derived+from+the+PTEN-mutant+prostate+metastasis+genome.">Rapid in vivo validation of candidate drivers derived from the PTEN-mutant prostate metastasis genome.</a> Methods. 77-78, 197-204 (2015).</li><li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling.">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159, 440-455 (2014).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate-specific+deletion+of+the+murine+Pten+tumor+suppressor+gene+leads+to+metastatic+prostate+cancer.">Prostate-specific deletion of the murine Pten tumor suppressor gene leads to metastatic prostate cancer.</a> Cancer Cell. 4, 209-221 (2003).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+analysis+indicates+monoclonal+origin+of+lethal+metastatic+prostate+cancer.">Copy number analysis indicates monoclonal origin of lethal metastatic prostate cancer.</a> Nat Med. 15, 559-565 (2009).</li><li>Haffner, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+clonal+origin+of+lethal+prostate+cancer.">Tracking the clonal origin of lethal prostate cancer.</a> J Clin Invest. 123, 4918-4922 (2013).</li><li>Daya, S., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+using+adeno-associated+virus+vectors.">Gene therapy using adeno-associated virus vectors.</a> Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).</li><li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Aspects+of+Development+and+Structure+in+the+Prostate.">Comparative Aspects of Development and Structure in the Prostate.</a> Natl Cancer Inst Monogr. 12, 1-27 (1963).</li><li>McNeal, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+prostate:+an+historical+survey+of+divergent+views.">Anatomy of the prostate: an historical survey of divergent views.</a> Prostate. 1, 3-13 (1980).</li><li>Thomsen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX9+elevation+in+the+prostate+promotes+proliferation+and+cooperates+with+PTEN+loss+to+drive+tumor+formation.">SOX9 elevation in the prostate promotes proliferation and cooperates with PTEN loss to drive tumor formation.</a> Cancer Res. 70, 979-987 (2010).</li></ol>

I detta protokoll beskriver vi en metod för att förändra genuttryck i den främre loben av murina prostata genom virus injektion, att skapa en kraftfull ny musmodell för prostatacancer (figur 2). Framgångsrik förvaltning av ett Adenovirus beskrevs först av Leow et al. 20058. Vi har tidigare visat hur ett Adenovirus som kodar för ett protein som Cre recombinase kan ersätta tidskrävande korsning av en Cre-allelen för vävnadsspecifika radering <sup c...

Upptäckt och behandling av prostatacancer har avsevärt förbättrats under det senaste decenniet. Incidensen av prostatacancer ökar fortfarande, efter förväntad livslängd. Med uppskattningsvis 1,1 miljoner nya fall i hela världen är det bland de vanligaste orsakerna till cancerrelaterad död i män 1. Prostatacancer är långsam i dess utveckling, men när cancern har utvecklats till en avancerad metastaserande stat, prognosen är dålig på grund av begränsade behandlingsalternativ. Hittills har endast ett fåtal gener har identifierats som vanliga förare i denna cancer, och dess heterogenitet och multifocality försvårar identifiering av biomarkörer och targetable sjukdom förare2,3.
Klassiska tekniker av generera GEMMs är ofta nedsatt av sin komplexitet, lägligt utgifter och kostnader. Villkorliga knockout modeller har använts att studera prostatacancer kandidatgener, som resulterar i embryonal dödlighet när inaktiverat i könsceller4. Vanligaste modellerna innebär en prostataspecifikt Cre recombinase drivs av antingen en modifierad Probasin5 eller PSA6 främjare integrerad i GEMM genom ytterligare korsning. I dessa modeller riktas genen av intresse i majoriteten av prostata epitelceller, generera hyperplasi i hela orgeln, som kan försämra djurets urinvägarna funktion7.
Viral leverans av proteinet Cre genom injektion i den främre loben av murina prostata kan lösa problemet genom att bara rikta några celler8. Hänsyn laboratorier tekniska förutsättningar, expertis och målen, metoden fördelarna från ett brett spektrum av möjliga variationer. Framgångsrika metoder utnyttja Adenovirus inriktning JunB och Pten9 eller Lentivirus inriktning Pten och Trp5310 har visats bland annat. Att lägga till transgener, såsom luciferas, den virala konstruktionen eller att GEMM kommer dessutom aktivera icke-invasiv övervakning av sjukdomsprogression via Mareld imaging11.
Gen editering baserat på tekniken CRISPR/Cas9 avslöjar en ny och snabb möjlighet att studera cancer genom snabb generering av somatiska knockouts12. Viral leverans av samma guide RNAs (sgRNAs) riktad till den främre loben av murina prostata upprättar en fysiologiskt mer relevant modell för prostatacancer. Detta sätt kan enstaka celler bär valt mutationer bildar kloner som klarar av expansion och invasion. Dessutom genererar användning av guide RNAs för flera målgener cell kloner med förändringar i olika gener. Detta gör att tumör heterogenitet och ett naturligt urval tryck på cancer progression, som kan avslöja vikten av varje gen ändring eller epistatic mekanismer.
Här presenterar vi en metod för att leverera viruspartiklar till murina prostata för ändring av genuttryck. Genom ett litet snitt för buk, den murina främre prostata loben är utsatt och viruspartiklar injiceras i LOB. Fem dagar efter kirurgi, kirurgiska klipp kan tas bort från huden och prostatic cancer kan analyseras från 8 veckor efter. Sammantaget är detta ett snabbt och kostnadseffektivt förfarande, som har liten inverkan på musen och tillåter större tumör att utveckla utan att kompromissa med musen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>26175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,5 ml U-100 insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>324825</td>
			<td>for virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>300013</td>
			<td>for anesthesia injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G 1/2&#39;&#39; needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>304000</td>
			<td>for anesthesia injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Polysorb Suture</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>GL889</td>
			<td>to close the peritoneum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable sterilized surgery drape</td>
			<td>multiple suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>multiple suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-Iodine Prep Pad</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-669-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimming machine</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>GT415</td>
			<td>to shave the abdomen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey Micro Needle Holder</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12500-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow Pattern Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11106-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound Clip System Handle incl. Clips</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12030-01</td>
			<td>to close the skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound Clip System Remover</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12030-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>different models have been used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antisedan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>obtained from the animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butorphanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>obtained from the animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidinhydrochlorid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>obtained from the animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>obtained from the animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-032-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td>Takeda</td>
			<td>7242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virus (AAV, AV)</td>
			<td>multiple suppliers</td>
			<td></td>
			<td>virus used in this protocol is an in-house production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAKT antibody</td>
			<td>CST</td>
			<td>4060</td>
			<td>used 1:200 dillution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP anitbody</td>
			<td>CST</td>
			<td>2956</td>
			<td>used 1:100 dillution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

virus delivery of crispr guides to the murine prostate for gene alteration

Med en ökande incidens av prostatacancer är identifiering av nya tumör drivrutiner eller modulatorer avgörande. Genetiskt modifierade musmodeller (GEMM) för prostatacancer hämmas av tumör heterogenitet och dess komplexa mikroevolution dynamics. Traditionella prostatacancer mus-modeller, bland andra, könsceller och villkorlig knockouts, transgena uttrycket av onkogener och xenograft-modeller. Generation av de novo -mutationer i dessa modeller är komplexa, tidskrävande och kostsamma. Dessutom rikta de flesta av traditionella modeller majoriteten av prostata epitelet, mänsklig prostatacancer är väl känt att utvecklas som en isolerad händelse i endast en liten delmängd av celler. Värdefulla modeller behöver simulera inte bara prostatacancer initiering, men också progression till avancerad sjukdom.
Här beskriver vi en metod för att rikta några celler i prostata epitlet av transducing celler av viruspartiklar. Leverans av en konstruerad virus till murina prostata tillåter ändring av genuttryck i de prostata epitel. Virustyp och kvantitet kommer härmed definiera antalet riktade celler för gen ändring av transducing några för cancer initiering och många celler för genterapi. Genom kirurgi-baserat injektion i den främre loben, distala från urinvägarna spåret, kan tumören i denna modell expandera utan att försämra funktionen urin av djuret. Dessutom genom att rikta en delmängd av prostata epitelceller tekniken möjliggör klonal expansion av tumören, och därför härmar mänskliga tumör initiering, progression, samt invasion genom basala membranet.
Denna nya teknik ger en kraftfull prostatacancer modell förbättrade fysiologiska betydelse. Djurplågeri är begränsad, och eftersom det krävs inga ytterligare avel, övergripande djur räknas minskas. Samtidigt, är analys av nya kandidatgener och vägar snabbare, vilket i sin tur är mer kostnadseffektiva.

För att bedöma virus leverans till murina prostata, analyserades prover tre månader efter operationen. Rosa26-LSL-Cas9-andra möss12 uttrycker GFP i celler som har exponerats för Cre protein uttryckt av virus. De prostata proverna undersöktes med en fluorescensmikroskopi att identifiera områden med GFP signal (figur 2A). GFP signalen indikerar Cre aktivitet i prostata epitelet men inte om genen redigering har inducerats av CRISPR...

Watch this Scientific Journal Video about Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration at JoVE.com

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

Det här protokollet beskriver en nyligen etablerade metod för virus leverans till murina prostatan. Använder antingen CRISPR/Cas9-teknik, gen överuttryck eller Cre recombinase leverans, tekniken tillåter ortotop ändring av genuttryck och implementerar en ny musmodell för prostatacancer.

Virus leverans av CRISPR guider till murina prostatan för gen ändring

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

En musmodell av trötthet inducerad av perifera bestrålning

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Identifiering och karakterisering av metastaserande faktorer av genöverföring i romanen RIP-taggen; RIP-tva murina modell

Metastatic cancer accounts for 90% of deaths in patients with solid tumors. There is an urgent need to better understand the drivers of cancer metastasis ...

Generation of Prostate Cancer Cell Models of Resistance to the Anti-mitotic Agent Docetaxel

Generationen av prostatacancer cellmodeller av motstånd mot den anti mitotiska Agent Docetaxel

Microtubule targeting agents (MTAs) are a mainstay in the treatment of a wide range of tumors. However, acquired resistance to chemotherapeutic drugs is a ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

Med hjälp av CRISPR/Cas9 gen redigering för att undersöka onkogena aktiviteten av muterade Calreticulin i cytokin beroende av hematopoetiska celler

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

Tillverkning av tunga extracellulära Matrix och beredning av tungan skivepitelcancer In Vitro

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

En självlysande och fluorescerande ortotop syngena murina modell av Androgen-beroende och kastrationsresistent prostatacancer

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Phosphopeptide anrikning tillsammans med etikett-fri kvantitativa masspektrometri att undersöka Phosphoproteome vid prostatacancer

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

Beredning av Exosomes för siRNA leverans till cancerceller

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

Utvärdering av differentierings kapacitet av mus prostata epitelceller med Organoid kultur

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...