Name: integrate imaging flow cytometry and transcriptomic profiling to evaluate altered endocytic cd1d trafficking
Uploaded: 2018-10-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking at JoVE.com

يشكر المؤلفون جوليتو روبرت (مركز الدم هوكسوورث) لعينات الدم البشري ويقرأ الدكتور ليانغ نيو لتطبيع التعبير الجيني. ونشكر أيضا دعم منحة من "معهد البيئة الصحية العلوم الوطنية" (ES006096)، ومركز لعلم الوراثة البيئية (CEG) مشروع تجريبي (أدمغة)، المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (AI115358) (أدمغة)، جامعة منح "مجلس البحوث في جامعة سينسيناتي" (أدمغة)، وجامعة "سينسيناتي كلية للطب الأساسية تعزيز التمويل" (عاشرا ض.).

بروتوكولات البشرية في هذه الدراسة قد أقر "المجلس الاستعراض المؤسسي" لجامعة سينسيناتي، وأجريت جميع الأساليب وفقا للمبادئ التوجيهية ذات الصلة واللوائح. وتم الحصول على عينات دم من المانحين صحية من مركز الدم هوكسوورث في المركز الطبي في جامعة سينسيناتي.
1-ترانسكريبتوميك التنميط...

<ol>
	<li>Roche, P. A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+Processing+and+Presentation+Mechanisms+in+Myeloid+Cells.">Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells.</a> Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MR1+uses+an+endocytic+pathway+to+activate+mucosal-associated+invariant+T+cells.">MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells.</a> The Journal of experimental medicine. 205 (5), 1201-1211 (2008).</li><li>Nakamura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomes+are+specialized+platforms+for+bacterial+sensing+and+NOD2+signalling.">Endosomes are specialized platforms for bacterial sensing and NOD2 signalling.</a> Nature. 509 (7499), 240-244 (2014).</li><li>Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+antigen+processing.">Pathways of antigen processing.</a> Annual review of immunology. 31, 443-473 (2013).</li><li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+natural+killer+T+cells:+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions.">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li><li>Zajonc, D. M., Kronenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1+mediated+T+cell+recognition+of+glycolipids.">CD1 mediated T cell recognition of glycolipids.</a> Current opinion in structural biology. 17 (5), 521-529 (2007).</li><li>Cox, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+cellular+lipids+bound+to+human+CD1d+molecules.">Determination of cellular lipids bound to human CD1d molecules.</a> PloS one. 4 (5), e5325 (2009).</li><li>Yuan, W., Kang, S. J., Evans, J. E., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+lipid+ligands+associated+with+human+CD1d+targeted+to+different+subcellular+compartments.">Natural lipid ligands associated with human CD1d targeted to different subcellular compartments.</a> Journal of immunology. 182 (8), 4784-4791 (2009).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+deoxyceramides+and+diacylglycerols+as+CD1b+scaffold+lipids+among+diverse+groove-blocking+lipids+of+the+human+CD1+system.">Discovery of deoxyceramides and diacylglycerols as CD1b scaffold lipids among diverse groove-blocking lipids of the human CD1 system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19335-19340 (2011).</li><li>de Jong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1a-autoreactive+T+cells+recognize+natural+skin+oils+that+function+as+headless+antigens.">CD1a-autoreactive T cells recognize natural skin oils that function as headless antigens.</a> Nature. 15 (2), 177-185 (2014).</li><li>Trombetta, E. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+antigen+processing+in+vitro+and+in+vivo.">Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo.</a> Annual review of immunology. 23, 975-1028 (2005).</li><li>Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+immunophenotyping+for+the+Human+Immunology+Project.">Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project.</a> Nature reviews. Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).</li><li>Sharma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+endocytic+lipid+antigen+presentation+by+common+lipophilic+environmental+pollutants.">Inhibition of endocytic lipid antigen presentation by common lipophilic environmental pollutants.</a> Science Reports. 7 (1), 2085 (2017).</li><li>Boom, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids.">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> Journal of clinical microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).</li><li>Nachamkin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agilent+2100+bioanalyzer+for+restriction+fragment+length+polymorphism+analysis+of+the+Campylobacter+jejuni+flagellin+gene.">Agilent 2100 bioanalyzer for restriction fragment length polymorphism analysis of the Campylobacter jejuni flagellin gene.</a> Journal of clinical microbiology. 39 (2), 754-757 (2001).</li><li>Kaimal, V., Bardes, E. E., Tabar, S. C., Jegga, A. G., Aronow, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToppCluster:+a+multiple+gene+list+feature+analyzer+for+comparative+enrichment+clustering+and+network-based+dissection+of+biological+systems.">ToppCluster: a multiple gene list feature analyzer for comparative enrichment clustering and network-based dissection of biological systems.</a> Nucleic acids research. 38 (Web Server issue), W96-W102 (2010).</li><li>Bauer-Mehren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+genomic+information+with+biological+networks+using+Cytoscape).">Integration of genomic information with biological networks using Cytoscape).</a> Methods in molecular biology. 1021, 37-61 (2013).</li><li>Cline, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+biological+networks+and+gene+expression+data+using+Cytoscape.">Integration of biological networks and gene expression data using Cytoscape.</a> Nature protocols. 2 (10), 2366-2382 (2007).</li><li>Huang, S., Moody, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-unrestricted+T+cells+in+the+human+CD1+system.">Donor-unrestricted T cells in the human CD1 system.</a> Immunogenetics. 68 (8), 577-596 (2016).</li><li>Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Innate-Like+T+Cells+in+Tuberculosis.">Targeting Innate-Like T Cells in Tuberculosis.</a> Frontiers in immunology. 7, 594 (2016).</li><li>Moody, D. B., Porcelli, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pathways+of+CD1+antigen+presentation.">Intracellular pathways of CD1 antigen presentation.</a> Nature reviews. Immunology. 3 (1), 11-22 (2003).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Diard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+cooperative+virulence+by+the+expression+of+an+avirulent+phenotype.">Stabilization of cooperative virulence by the expression of an avirulent phenotype.</a> Nature. 494 (7437), 353-356 (2013).</li><li>Bader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proliferative+and+mature+beta-cells+in+the+islets+of+Langerhans.">Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans.</a> Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).</li><li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+imaging+software+tools.">Biological imaging software tools.</a> Nature. 9 (7), 697-710 (2012).</li><li>Costes, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+and+quantitative+measurement+of+protein-protein+colocalization+in+live+cells.">Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells.</a> Biophysical journal. 86 (6), 3993-4003 (2004).</li></ol>

هو تحدي تأكيد طريقا المعدلة الجينات الوظيفية، بسبب الجينات أثرت على نطاق واسع التي تنطوي على مسارات متعددة، وصعوبة إدماج الأنشطة الخلوية الفردية وسكاني. استخدمنا التصوير التدفق الخلوي للتحديد اختبار CD1d الاتجار في المقصورات اندوسيتيك. التصوير التدفق الخلوي يدمج سكاني قياس الخلايا والمظ...

مستضد العرض التقديمي عادة ما ينطوي على البروتين داخل الخلايا الاتجار بالأشخاص، التي قد تحقق غالباً استخدام توصيف الخصائص المورفولوجية والتنميط المظهرية من مستضد تقديم الخلايا1،2،3 . لدمج مزايا التصوير وأساليب فينوتيبينج، يصف لنا منصة تحليل تصوير في كل من خلية مفردة ومستويات السكان تبرهن كولوكاليزيشن تغيير بروتين في الخلايا الجذعية البشرية (DCs). في الببتيد مستضد العرض الرئيسية histocompatibility المعقد (MHC) الفئة الأولى جزيئات الربط ببتيد قصيرة (8-10 البقايا) في هيولى لتنشيط CD8 التقليدية+ تي الخلايا، بينما MHC class ثانيا جزيئات تربط أطول نسبيا الببتيد (بقايا ~ 20) في مقصورات اندوسيتيك لتنشيط خلايا CD4 التقليدية الخلايا+ ر1،4. على النقيض من ذلك، يتم تنشيط خلايا تي الخاصة بالدهن من البروتينات CD1 مع المستضدات الدهن تحميل أساسا في المقصورات اندوسيتيك5،6. يتطلب عرض مستضد الدهن المعروض من نواتج الأيض الدهون المنتجة في دهن الأيض7،،من89،10 والتحميل من نواتج الأيض الدهني الوظيفية للبروتينات CD1 في المقصورات اندوسيتيك5،6. وفي هذا السياق، مختلف العوامل الخلوية تحوير المادة الدهنية مستضد العرض، لا سيما في التعرض البيئي للملوثات محبتين والاضطرابات المناعية، أمرا حاسما لتعريفها. في هذه الدراسة، استخدمنا التحليل ترانسكريبتوميك وتنميط الصورة وتحليل التصوير الخلوية وسكاني للبشرية DCs المشتقة من الوحيدات لتحديد البروتين اندوسيتيك الاتجار بالمساهمة في عرض مستضد الدهن في التعرض للملوثات. بالتأكيد، يمكن تطبيق هذا المنهاج المشترك لدراسة الاتجار بالبروتين سوبسيلولار وكولوكاليزاتيون في مختلف العمليات البيولوجية.
من الناحية التقنية، تجلى التعريب سوبسيلولار البروتين عادة استخدام الفحص المجهري [كنفوكل] وتحليلها إحصائيا في عدد محدود من الكشف عن الخلايا1،2،،من311. وعلاوة على ذلك، التدفق الخلوي طبق على نطاق واسع إلى بوابة الخلية السكان مع إشارات شارك الملون البروتينات متعددة على مستوى خلوي12؛ ولكن هذا يفتقر إلى وضع تصور مفصل للبروتين سوبسيلولار كولوكاليزيشن. لتحقيق تحليلات شاملة وإحصائية لنسبة البروتين كولوكاليزاتيون على المستويين الخلوي والسكان، ونحن إدراج التصوير نهج التنميط والتحليل لتحديد ملامح كولوكاليزاتيون البروتين مع البيولوجية أهمية. على وجه التحديد، يمكننا استخدام التصوير التدفق الخلوي للكشف عن كولوكاليزيشن CD1d وغشاء الليزوزومية المرتبطة بالبروتين 1 (Lamp1) البروتينات في هذه الدراسة. وكان التحليل الكمي لجزيئات كولوكاليزيد سابقا صعبة يجب القيام بها في نطاق سكاني. في هذه الدراسة، علينا تكييف البرنامج ImageJ-فيجي للنظر في النسبة المئوية للبروتين كولوكاليزاتيون مع عدد كبير من الخلايا الملون المشترك على المستويين الخلوي سكاني والفردية. على وجه التحديد، قمنا بقياس المجالات شارك المترجمة وكثافة وحجم سكاني تدعم الاستنتاج بأن البروتين CD1d أبقى إلى حد كبير في أواخر مقصورات اندوسيتيك للإنسان وحدات تحكم المجال Dc في التعرض الملوثات محبتين بنزو [أ] بيرين (BaP)13 . توفير هذا الخلوي مجتمعة والسكان التصوير تحليل النتائج استنساخه بدرجة عالية وشاملة ويعتد به إحصائيا من CD1d-Lamp1 كولوكاليزيشن ذات الصلة بالمادة الدهنية تحول دون مستضد العرض التقديمي.
الترنسكربيتوم Dc البشرية المعرضة BaP تؤيد بقوة الفرضية القائلة بأن الأيض الدهني اندوسيتيك والاتجار اندوسيتيك CD1d كانت ضعف في التعرض BaP. لاختبار هذه الفرضية، طبقنا التصوير التدفق الخلوي الشخصية صور سكان العاصمة التي كانت تشارك ملطخة بالبروتينات متعددة بما في ذلك العاصمة علامات وعلامات اندوسيتيك و CD1d. أخيرا، حللت إحصائيا الخلايا الملون المشترك لإظهار النسبة المئوية لكثافة ومناطق كولوكاليزيشن CD1d و Lamp1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1340px;" width="1340">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Transcriptomics</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td style="width:417px;">HiSeq 2500 v4</td>
			<td style="width:191px;">Illumina HiSeq system</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">ImagingStream X</td>
			<td style="width:448px;">Millipore</td>
			<td>100220</td>
			<td>Imaging flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">mirVana miRNA Isolation Kit</td>
			<td style="width:448px;">Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Total RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agilent RNA 6000 Pico Kit</td>
			<td style="width:448px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Total RNA QC analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler</td>
			<td style="width:448px;">Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>PCR, enzyme reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module&#160;</td>
			<td style="width:448px;">New England Biolab</td>
			<td></td>
			<td>PolyA RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Automated SMARTer Apollo system</td>
			<td style="width:448px;">Takara</td>
			<td></td>
			<td>PolyA RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td style="width:448px;">New England Biolab</td>
			<td></td>
			<td>Library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agencourt AMPure XP magnetic beads</td>
			<td style="width:448px;">Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>DNA purification&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:448px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Library QC, size distribution analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td style="width:448px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Library QC, size distribution analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher)</td>
			<td style="width:448px;">Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Library quantification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NEBNext Library Quant Kit</td>
			<td style="width:448px;">New England Biolab</td>
			<td></td>
			<td>Library quantification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">cBot</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Library cluster generation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot &#8211; HS</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Library cluster generation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">HiSeq 1000</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">TruSeq SBS Kit v3 - HS (50-cycles)</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7)</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td style="width:417px;">L243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5)</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td align="right" style="width:417px;">3.9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Brilliant violet 421</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td style="width:417px;">L161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">PE-anti-mouse IgG2b</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td align="right" style="width:417px;">51.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Alexa Fluor 647 (AF647)</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td style="width:417px;">CD107a(H4A3)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integrate imaging flow cytometry and transcriptomic profiling to evaluate altered endocytic cd1d trafficking

تحليل سكاني لتغيير الخصائص المورفولوجية والوظيفية للبروتينات اندوسيتيك صعبة بسبب الطلب على التقاط الصور في إجراء تحليل صورة الإحصائية ومستوى خلية واحدة على مستوى سكاني. وللتغلب على هذه الصعوبة، استخدمنا التصوير التدفق الخلوي وترانسكريبتوميك التنميط (الحمض النووي الريبي-seq) لتحديد تغيير التعريب سوبسيلولار بالمجموعة من التمايز د 1 البروتين (CD1d) المرتبطة بالتعبير الجيني اندوسيتيك البصر في الإنسان الخلايا الجذعية (DCs)، التي تتعرض للمشترك محبتين الهواء الملوثات بنزو [أ] بيرين. وقد تم تحليل كولوكاليزيشن CD1d والبروتينات علامة اندوسيتيك Lamp1 الآلاف من خلية الصور التي تم التقاطها مع التصوير التدفق الخلوي استخدام الأفكار وفيجي إيماجيج البرامج. كانت تصور العديد من الصور الخلوية مع البروتينات CD1d و Lamp1 شارك الملون بعد النابضة في CD1d+Lamp1+ وحدات تحكم المجال Dc باستخدام الأفكار. كولوكاليزاتيون CD1d و Lamp1 المعززة عند التعرض تجلى كذلك استخدام سكاتيربلوتس ثريشولديد، اختبار مع المعاملات في ماندر لكثافة مترجمة شارك، ودبر BaP استناداً إلى النسبة المئوية للمناطق شارك المترجمة باستخدام إيماجيج وفيجي. وتوفر البيانات لدينا نهج الآلي و bioinformatic مفيدة لقياس البروتين كولوكاليزاتيون على المستويات الخلوية كل واحد وسكاني، دعم البصر نتيجة وظيفية لتغيير ترانسكريبتوميك في الإنسان المعرضة للملوثات وحدات تحكم المجال Dc.

الملوثات محبتين BaP تبديل مجموعات الجينات اندوسيتيك في DCs المشتقة من الوحيدات DCs. الإنسان البشري من كل جهة مانحة (n = 3) المحتضنة مع BaP وفرزها لوحدات تحكم المجال Dc التقليدية، التي كانت تستخدم كذلك لتحليل الحمض النووي الريبي الاستخراج وترانسكريبتوميك كما هو موضح . عند تطبيع ال?...

Watch this Scientific Journal Video about Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking at JoVE.com

Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking

ويوفر نهج مثالي للكشف عن تغيير الخصائص المورفولوجية والوظيفية للخلايا على الصعيدين الفردي وسكاني التصوير التدفق الخلوي. قد تجلى تعطل وظيفة اندوسيتيك لعرض مستضد الدهن في الخلايا الجذعية البشرية المعرضة للملوثات مع ترانسكريبتوميك مجتمعة التنميط التعبير الجيني ومظاهره المورفولوجية للاتجار بالبروتين.

دمج تصوير التدفق الخلوي والتنميط لتقييم الاتجار بتغيير CD1d اندوسيتيك ترانسكريبتوميك

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single ...

هذه الطرق دمج الجيل التالي تسلسل وتدفق تحليل التصوير القياسات الخلية. يمكن أن يساعد في الإجابة على أسئلة مثيرة للاهتمام ، مثل ما إذا كانت بعض التعديلات الظاهرية متورطة ، بدلاً من النص ، خاصة في بيئة التعرض للملوثات. والميزة الرئيسية لهذه الطريقة البسيطة بالنسبة لنا هي أننا يمكن أن نستخدمها لقياس التكلس من البروتين المهم بيولوجيا، لتفسير نتائج التعبير الجيني التفاضلي الرئيسي على المستوى الوظيفي.تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو تشخيص النتائج المرضية والسمية. كنظرية تصويرية، فإن Forsee لديه القدرة على ربط التعبير الجيني بوظيفة البروتين. عموما، سوف الأفراد جديدة لهذه الطريقة النضال بسبب المطالب التقنية العالية من التصوير والتحليل النسخي.لتسلسل مكتبة الخلايا المتسخة المشتقة من الدنوديتية البشرية ، قم أولاً بتحميل الكواشف التسلسلية وفهرستها على رفوف الكشف الحيوي المتسلسلة وفهرسةها ، على التوالي ، ووضع الرفوف في حمام مائي من الدرجة المختبرية لمدة ساعة واحدة ، حتى يذوب كل الجليد ، ويتم خلط الكواشف تمامًا. أثناء ذوبان الكواشف، الطاقة على المنظم، توصيل الكمبيوتر إلى محرك أقراص شبكة عند ظهور محرك الأقراص عدم إخراج، ثم تشغيل برنامج التحكم المنظم. المقبل، إضافة حوالي 100 ملليلتر من محلول غسل الصيانة لكل من الزجاجات في رف مُكشف التركيب الحيوي التسلسلي، وبرغي غطاء قمع على كل زجاجة.إضافة ما يقرب من 12 ملليلتر من محلول غسل الصيانة لكل أنبوب مخروطي 15 ملليلتر في رف الكاشف الفهرسة، وتجاهل القبعات. ثم قم بتحميل كلا الحوامل على جهاز التسلسل. حدد الصيانة غسل داخل برنامج التحكم المنظم، واتبع التعليمات لتنظيف نظام السائل المنظم.استخدام مصباح يدوي لفحص بصريا الخلية تدفق للفقاعات التي تمر عبر الممرات، للتأكد من عدم وجود تسرب. عند الانتهاء من تسلسل الغسيل، افتح علامة التبويب تسلسل، ثم ابدأ تشغيل جديد، وتوجيه بيانات الإخراج إلى محرك أقراص شبكة. قم بتحميل ورقة عينة لـ demultiplexing، وأدخل معلومات الكاشف المناسبة.استخدم خلية تدفق مستخدمة لرُد النظام، مع الكواشف التسلسلية. بمجرد اكتمال إنشاء الكتلة، قم بإزالة خلية التدفق. ورش بخفة الخلية بالماء.امسح خلية التدفق الجافة بورق العدسة، متبوعاً برذاذ خفيف مع 95٪ إيثانول. بعد مسح خلية التدفق الجافة مرة أخرى، تحقق من سطح الخلية تدفق ضد الضوء للتأكد من أنها نظيفة، دون الحطام أو بقايا الملح. عند الانتهاء من الخطوة الرئيسية تحميل خلية تدفق متفاوت المسافات، وبدء التسلسل.سيتم تشغيل برنامج عارض تحليل التسلسل تلقائيًا. وبعد حوالي 26 ساعة، قم بمراقبة جودة بيانات التسلسل من خلال برنامج التحكم في التسلسل العالي، وبرمجيات عرض تحليل التسلسل لتقييم جودة البيانات، ولأي استكشاف للأعطال وإصلاحها. ثم، عند الانتهاء من تسلسل، تغيير طوقا الخلية تدفق، وإجراء غسل الصيانة قبل البدء في تشغيل المقبل.بعد تدفق التصوير السيتري للخلايا التشعبية المعرضة للملوثات، افتح ImageJ فيجي، ودمج صور الخلايا المحفوظة 100 لمجموعات عينات الخلايا الجذعية البشرية غير المكشوفة والملوثة في ملفات فردية وفقًا لمجموعة المعالجة. لتحليل CD1d، و كولويبلييشن Lamp1 داخل المجموعتين السكانيتين، افتح صورة الخلايا المدمجة المُعرّضة للملوثات 100، وحدد قنوات الصورة واللون والانقسام لتقسيم الصورة إلى صورتين فرديتين مع فلوفور واحد لكل قناة. لإنشاء مخطط مبعثر من بكسل ا colocalized حدد تحليل و كولكاليسيشن عتبة، واضغط على شاشة الطباعة لحفظ مؤامرة مبعثر.لحساب معامل التكلس الخاص بـ Mander لكل صورة خلوية مفردة، استخدم أداة التحديد البيضاوي لتحديد صورة أحادية الخلية على ملف الصورة باستخدام القنوات المنقسمة، وحدد تحليل، وتكلسية، وعتبة التكلس مرة أخرى. ثم حدد القناة 1 من مربع الحوار لمنطقة الاهتمام، ثم انقر فوق موافق. عند حساب المعامل لكافة صور الخلايا 100، قم باستيراد النتائج إلى جدول بيانات مناسب، وكرر التحليل الخاص بعيّنة الخلايا غير المكشوفة للتحكم. وباستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي وتحليلات البيانات المستنسخة، تم تحديد العديد من مجموعات الجينات المتغيرة الرئيسية، بما في ذلك استقلاب الدهون ووظائف الغدد الصماء في البلدان النامية المعرضة للملوثات.على مستوى صورة الخلية الفردية، يمكن أن تكون مسور HLADR إيجابية CD11c الخلايا التشعب إيجابية، وفقا لC1D بهم وDed1 coexpression. السيطرة على الخلايا التشعبية غير المكشوفة تظهر الحد الأدنى CD1d و Lamp1 بروتين التكلس, مما يدل على مستوى القاعدي للاتجار بـ CD1d endocytic, ومستوى عال من التعبير السطحي في ظل الظروف الفسيولوجية. في حين يتم الاحتفاظ CD1d في الأجزاء المتأخرة من الخلايا التشعبية المعرضة للملوثات، مما يؤكد تغيير ملفات الجينات endocytic في هذه الخلايا التجريبية.بعد دمج الصور الخلوية الفردية في ملف صورة واحدة ، يمكن تقسيم الصور الفردية وفقًا لتعبير الفلوروفور ، ويمكن تصور التكلس من كثافة البكسل بين القناتين في مؤامرة مبعثرة. ويمكن بعد ذلك تحديد درجة التكلس بين بروتينات CD1d وDed1 في مجموعتي المعالجة، وذلك باستخدام معاملات ماندر. إذا كانت كثافة البروتين هي هيسترجينيوس بين المناطق الضخمة وغير الضخمة، فإن الكثافة الهائلة لن تكون موازية للمناطق ذات التكلس، ولذلك من المهم أيضًا إجراء تقييم إضافي لتكلس البروتينين، استنادًا إلى كثافة البكسل.بمجرد اتقانها، يمكن إكمال تحليل الصورة في ساعتين، ويمكن إكمال إعداد تسلسل الحمض النووي الريبي في ثلاث ساعات، إذا تم تنفيذ كل تقنية بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر للتأكد من أن يتم تحميل جميع الكواشف بشكل صحيح في المواضع الصحيحة، وأنه لا يوجد تسرب في المنظم. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى، مثل الحمض النووي الريبي الصغير، إكسوم، أو تسلسل الخلايا الصاري للإجابة على أسئلة إضافية حول التعبير العالمي للرنا الصغير، أو الطفرة الجينية، أو ميثيل الحمض النووي، على التوالي.لذلك بعد تطورها ، ستساعد هذه التقنية الباحثين في مجال تحليل التصوير الخلوي ، وتسلسل الجيل التالي لاستكشاف تأثير الملوثات البيئية على التعبير الجيني ووظيفة البروتين. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد تسلسل الجيل القادم ، وتحليل التصوير لتكلس البروتين. لا تنس أن العمل مع المواد الكيميائية الملوثة السامة في عينات الدم البشري يمكن أن تكون خطرة للغاية.الاحتياطات مثل استخدام غطاء الدخان الكيميائي، ومعدات الحماية الشخصية، ينبغي دائماً اتخاذها عند تنفيذ هذه الإجراءات.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

تحليل التدفق الخلوي للخلايا المناعية وفي الفئران Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

الإنسان في المختبر قمع وأداة الكشف عن الاعتراف للدولة في وقت مبكر من الخلل المناعي

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

الصورة القائمة على التدفق الخلوي وتقنيات لتقييم التغيرات في الحبيبية وظيفة<em&gt; في المختبر</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

بروتوكول بسيطة وسريعة لغير إنزيمي فصل الطازجة الأنسجة البشرية لتحليل التسلل اللمفاويات

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

مضان تنشيط الفرز الخليوي لتنقية الخلايا الجذعية بلازماوية الشكل من الفأر نخاع العظم

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

الفئران اللمفاويات وسمها من قبل<sup&gt; 64</sup&gt; النحاس والأجسام المضادة مستقبلات استهداف ل<em&gt; في فيفو</em&gt; الاتجار خلية بواسطة PET / ط م

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

قياس T خلية Alloreactivity عن طريق التصوير التدفق الخلوي

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

تحليل نوعي وكمي المشبك محصنة في النظام البشري باستخدام التصوير التدفق الخلوي

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

تصور داخل الخلايا المطوقة الاتجار بواسطة عمر Fluorescence التصوير المجهري

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...