Name: integrate imaging flow cytometry and transcriptomic profiling to evaluate altered endocytic cd1d trafficking
Uploaded: 2018-10-29T13:00:00
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作者感谢罗伯特 Giulitto (远见卓识血液中心) 的人血液样本和良牛医生的基因表达的规范化读。我们还感谢国家环境健康科学研究所 (ES006096)、环境遗传学中心 (CEG) 试点项目 (史绍熙)、国家过敏和传染性疾病研究所 (AI115358) (史绍熙) 的赠款支持, 大学辛辛那提大学研究委员会奖 (史绍熙) 和辛辛那提大学医学院核心增强资金 (x.z.)。

这项研究中的人类协议得到了辛辛那提大学机构审查委员会的批准, 所有方法都按照相关的指导方针和条例进行。来自辛辛那提大学医疗中心远见卓识血液中心的健康捐献者的血液样本获得。
1. 污染物暴露的人单核细胞源 DCs 的转录组分析
<ol><li>BaP 暴露 DCs 的总 RNA 提取<ol>
<li>使用细胞因子 GM 脑脊液和 IL-4 区分人 dcs, 并将 dcs 暴露在 BaP 中4天13。</li>
		<li>使?...

<ol>
	<li>Roche, P. A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+Processing+and+Presentation+Mechanisms+in+Myeloid+Cells.">Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells.</a> Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MR1+uses+an+endocytic+pathway+to+activate+mucosal-associated+invariant+T+cells.">MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells.</a> The Journal of experimental medicine. 205 (5), 1201-1211 (2008).</li><li>Nakamura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomes+are+specialized+platforms+for+bacterial+sensing+and+NOD2+signalling.">Endosomes are specialized platforms for bacterial sensing and NOD2 signalling.</a> Nature. 509 (7499), 240-244 (2014).</li><li>Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+antigen+processing.">Pathways of antigen processing.</a> Annual review of immunology. 31, 443-473 (2013).</li><li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+natural+killer+T+cells:+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions.">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li><li>Zajonc, D. 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E., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+lipid+ligands+associated+with+human+CD1d+targeted+to+different+subcellular+compartments.">Natural lipid ligands associated with human CD1d targeted to different subcellular compartments.</a> Journal of immunology. 182 (8), 4784-4791 (2009).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+deoxyceramides+and+diacylglycerols+as+CD1b+scaffold+lipids+among+diverse+groove-blocking+lipids+of+the+human+CD1+system.">Discovery of deoxyceramides and diacylglycerols as CD1b scaffold lipids among diverse groove-blocking lipids of the human CD1 system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19335-19340 (2011).</li><li>de Jong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1a-autoreactive+T+cells+recognize+natural+skin+oils+that+function+as+headless+antigens.">CD1a-autoreactive T cells recognize natural skin oils that function as headless antigens.</a> Nature. 15 (2), 177-185 (2014).</li><li>Trombetta, E. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+antigen+processing+in+vitro+and+in+vivo.">Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo.</a> Annual review of immunology. 23, 975-1028 (2005).</li><li>Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+immunophenotyping+for+the+Human+Immunology+Project.">Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project.</a> Nature reviews. Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).</li><li>Sharma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+endocytic+lipid+antigen+presentation+by+common+lipophilic+environmental+pollutants.">Inhibition of endocytic lipid antigen presentation by common lipophilic environmental pollutants.</a> Science Reports. 7 (1), 2085 (2017).</li><li>Boom, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids.">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> Journal of clinical microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).</li><li>Nachamkin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agilent+2100+bioanalyzer+for+restriction+fragment+length+polymorphism+analysis+of+the+Campylobacter+jejuni+flagellin+gene.">Agilent 2100 bioanalyzer for restriction fragment length polymorphism analysis of the Campylobacter jejuni flagellin gene.</a> Journal of clinical microbiology. 39 (2), 754-757 (2001).</li><li>Kaimal, V., Bardes, E. E., Tabar, S. C., Jegga, A. G., Aronow, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToppCluster:+a+multiple+gene+list+feature+analyzer+for+comparative+enrichment+clustering+and+network-based+dissection+of+biological+systems.">ToppCluster: a multiple gene list feature analyzer for comparative enrichment clustering and network-based dissection of biological systems.</a> Nucleic acids research. 38 (Web Server issue), W96-W102 (2010).</li><li>Bauer-Mehren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+genomic+information+with+biological+networks+using+Cytoscape).">Integration of genomic information with biological networks using Cytoscape).</a> Methods in molecular biology. 1021, 37-61 (2013).</li><li>Cline, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+biological+networks+and+gene+expression+data+using+Cytoscape.">Integration of biological networks and gene expression data using Cytoscape.</a> Nature protocols. 2 (10), 2366-2382 (2007).</li><li>Huang, S., Moody, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-unrestricted+T+cells+in+the+human+CD1+system.">Donor-unrestricted T cells in the human CD1 system.</a> Immunogenetics. 68 (8), 577-596 (2016).</li><li>Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Innate-Like+T+Cells+in+Tuberculosis.">Targeting Innate-Like T Cells in Tuberculosis.</a> Frontiers in immunology. 7, 594 (2016).</li><li>Moody, D. B., Porcelli, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pathways+of+CD1+antigen+presentation.">Intracellular pathways of CD1 antigen presentation.</a> Nature reviews. Immunology. 3 (1), 11-22 (2003).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Diard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+cooperative+virulence+by+the+expression+of+an+avirulent+phenotype.">Stabilization of cooperative virulence by the expression of an avirulent phenotype.</a> Nature. 494 (7437), 353-356 (2013).</li><li>Bader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proliferative+and+mature+beta-cells+in+the+islets+of+Langerhans.">Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans.</a> Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).</li><li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+imaging+software+tools.">Biological imaging software tools.</a> Nature. 9 (7), 697-710 (2012).</li><li>Costes, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+and+quantitative+measurement+of+protein-protein+colocalization+in+live+cells.">Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells.</a> Biophysical journal. 86 (6), 3993-4003 (2004).</li></ol>

改变基因通路的功能确认是有挑战性的, 因为广泛影响的基因表达涉及多个途径和困难, 以整合个人和种群细胞活动。我们使用影像流式细胞仪专门测试 CD1d 在内吞隔间的贩运。影像流式细胞仪集成了细胞的种群测量和多蛋白亚细胞共定位的个体演示。共聚焦显微镜在测量蛋白质共定位时提供了高分辨率, 流式细胞仪能够为不同的细胞群提供全面的分型。成像流式细胞仪将共聚焦显微镜和流式细胞?...

抗原呈现通常涉及细胞内蛋白的贩运, 这是经常调查使用的形态学表征和表型分析的抗原呈现细胞1,2,3.为了整合成像和分型方法的优点, 我们描述了在单细胞和种群水平的成像分析平台, 以演示在人类树突状细胞 (DCs) 中改变的蛋白质共定位。在多肽抗原表达中, 主要的组织相容复合物 (MHC) I 类分子结合在内质网中的短肽 (8-10 残留物) 激活传统的 CD8+ T 细胞, 而 MHC II 类分子结合一个相对较长的内吞中的肽 (约20个残留物) 激活常规 CD4+ T 细胞1,4。相比之下, 脂质特异性 T 细胞是由 CD1 蛋白激活的, 脂质抗原主要载于内吞夹层5,6。脂质抗原的表现需要提供脂代谢产物在脂质新陈代谢7,8,9,10和负载的功能性脂代谢物 CD1 蛋白质内吞隔间5,6。在这种情况下, 各种细胞因子调节脂质抗原的表现, 特别是在环境暴露的亲脂性污染物和免疫紊乱, 是至关重要的定义。在本研究中, 我们使用转录组分析, 图像分析, 和细胞和种群成像分析的人单核细胞衍生的 DCs, 以确定内吞蛋白的贩运导致在污染物暴露的脂质抗原呈现。当然, 该组合平台可用于研究不同生物过程中亚细胞蛋白的贩运和共定位。
从技术上讲, 亚细胞蛋白的定位通常使用共聚焦显微镜进行演示, 并在数量有限的检测到的细胞1、2、3、11中进行统计分析。此外, 流式细胞仪已广泛应用于细胞12级多蛋白共染色信号的门细胞种群;然而, 这缺乏亚细胞蛋白共定位的详细可视化。为了在细胞和种群水平上实现对蛋白质共定位百分比的综合和统计分析, 我们结合了成像分析和分析方法, 以确定蛋白质共定位的特征与生物关联。具体来说, 我们使用影像流式细胞仪检测 CD1d 和溶酶相关膜蛋白 1 (Lamp1) 蛋白的共定位。增强分子的定量分析以前很难在种群尺度上进行。在这项研究中, 我们调整了 ImageJ-斐济计划, 在种群和个体细胞水平上, 研究大量共染色细胞的蛋白质共定位的百分比。具体而言, 我们测量了共局部面积、强度和种群大小, 以支持结论: CD1d 蛋白主要保留在人类 DCs 的晚期内吞夹层中, 接触到一种亲脂性污染物 (苯并) 芘 (BaP)13.这种结合细胞和人口成像分析提供了高度可重复性, 全面和统计学上显著的结果 CD1d-Lamp1 共定位相关的抑制脂质抗原呈现。
bap 暴露的人类 DCs 的转录组强烈支持内吞脂代谢和 CD1d 内吞贩运在 BaP 暴露中受损的假说。为了测试这个假说, 我们应用影像流式细胞仪来分析与多种蛋白质共染色的 DC 种群的图像, 包括 CD1d、内吞标记和直流标记。最后, 对共染色细胞进行统计分析, 以证明 CD1d 和 Lamp1 共定位的强度和面积的百分比。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1340px;" width="1340">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Transcriptomics</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td style="width:417px;">HiSeq 2500 v4</td>
			<td style="width:191px;">Illumina HiSeq system</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">ImagingStream X</td>
			<td style="width:448px;">Millipore</td>
			<td>100220</td>
			<td>Imaging flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">mirVana miRNA Isolation Kit</td>
			<td style="width:448px;">Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Total RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agilent RNA 6000 Pico Kit</td>
			<td style="width:448px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Total RNA QC analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler</td>
			<td style="width:448px;">Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>PCR, enzyme reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module&#160;</td>
			<td style="width:448px;">New England Biolab</td>
			<td></td>
			<td>PolyA RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Automated SMARTer Apollo system</td>
			<td style="width:448px;">Takara</td>
			<td></td>
			<td>PolyA RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td style="width:448px;">New England Biolab</td>
			<td></td>
			<td>Library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agencourt AMPure XP magnetic beads</td>
			<td style="width:448px;">Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>DNA purification&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:448px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Library QC, size distribution analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td style="width:448px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Library QC, size distribution analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher)</td>
			<td style="width:448px;">Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Library quantification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NEBNext Library Quant Kit</td>
			<td style="width:448px;">New England Biolab</td>
			<td></td>
			<td>Library quantification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">cBot</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Library cluster generation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot &#8211; HS</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Library cluster generation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">HiSeq 1000</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">TruSeq SBS Kit v3 - HS (50-cycles)</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7)</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td style="width:417px;">L243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5)</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td align="right" style="width:417px;">3.9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Brilliant violet 421</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td style="width:417px;">L161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">PE-anti-mouse IgG2b</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td align="right" style="width:417px;">51.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Alexa Fluor 647 (AF647)</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td style="width:417px;">CD107a(H4A3)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integrate imaging flow cytometry and transcriptomic profiling to evaluate altered endocytic cd1d trafficking

种群分析内吞蛋白的形态和功能变化, 是由于单细胞水平的图像采集需求和种群水平的统计图像分析所带来的挑战。为了克服这一困难, 我们使用了成像流式细胞仪和转录组分析 (RNA 序列) 来确定分化1d 蛋白 (CD1d) 与人内吞基因表达受损相关的亚细胞定位树突状细胞 (DCs), 暴露于常见的亲油性空气污染物苯并 (a) 芘。用想法和 ImageJ-斐济方案分析了数以千计的细胞图像采集的 CD1d 和内吞标记 Lamp1 蛋白的共定位。在 CD1d+Lamp1+ DCs 的控制下, 使用 CD1d 和 Lamp1 蛋白的多种蜂窝图像进行了可视化处理。在 BaP 曝光时增强的 CD1d 和 Lamp1 共定位进一步证明使用阈值散点图, 用 Mander 的系数进行共局部强度测试, 并根据使用 ImageJ-斐济的共同本地化区域的百分比进行绘制。我们的数据提供了一种有利的工具和生物信息学方法, 用于测量单个和种群细胞水平的蛋白质共定位, 支持在污染物暴露的人类中转录组变化的功能性结果受损。Dcs。

脂溶性污染物 BaP 改变了人类 DCs 中的内吞基因簇. 从每个捐献者 (n=3) 的人单核细胞衍生的 dcs 被孵化和排序为常规 DCs, 进一步用于 RNA 提取和转录组分析, 如所述.在基因表达正常化的基础上, 根据差异表达基因的功能相关性, 对 BaP 暴露和非暴露群体之间的改变基因进行聚类。我们将更改后的基因列表输入 Toppcluster 计划16 , 用于分析相关的细胞通路, 并使用...

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Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking

成像流式细胞术提供了一种理想的方法来检测细胞在个体和种群水平的形态学和功能改变。对污染物暴露的人树突状细胞中脂质抗原表达的破坏内吞功能进行了转录组基因表达和蛋白质贩运形态表现的综合分析。

整合影像流式细胞仪和转录组分析, 评估改变的内吞 CD1d 贩运

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single ...

这些方法集成了下一代测序和流式细胞学成像分析。它可以帮助回答有趣的问题，如一些表型的改变是否涉及，而不是转录组，特别是在污染物暴露环境中。对于我们来说，这种简单方法的主要优点是，我们可以用它来测量具有生物重要作用的蛋白质的结肠化，在功能层面上解释关键微分基因表达的结果。该技术的含义延伸到病理和毒理学结果的诊断。作为一种正常的成像方法，前向具有将基因表达与蛋白质功能连接的能力。一般来说，由于成像和转录分析的技术要求很高，对这种方法的技术人员将难以为之奋斗。要对人类单核细胞衍生树突细胞库进行测序，首先将测序和索引试剂分别加载到测序生物合成和索引试剂架上，将机架放在实验室级水浴中一小时，直到所有冰都融化，然后将试剂彻底混合。当试剂解冻时，打开音序器电源，在"不弹出"驱动器出现时将计算机连接到网络驱动器，然后启动音序器控制软件。接下来，在测序生物合成试剂架的每个瓶子中加入约 100 毫升的维护洗涤液，并将漏斗盖拧到每个瓶子上。在索引试剂架中的每 15 毫升锥形管中加入大约 12 毫升的维护洗涤液，然后丢弃盖。然后将两个机架加载到音序器上。选择音序器控制软件中的维护清洗，然后按照清洁音序器流体系统的说明进行操作。使用手电筒目视检查流水单元是否有气泡通过车道，以确保没有泄漏。洗涤序列完成后，打开"序列"选项卡，然后开始新的运行，将输出数据定向到网络驱动器。上传样品表进行脱皮处理，并输入相应的试剂信息。使用用过的流细胞为系统提供测序试剂。群集生成完成后，删除流单元。轻轻喷水。用透镜纸擦干流动电池，然后用 95% 乙醇进行轻喷。再次擦干流动电池后，检查流动细胞表面对光，以确保它是干净的，没有碎屑或盐残留物。完成主要步骤后，加载聚类流单元，然后开始排序。序列分析查看器软件将自动启动。大约 26 小时后，通过高序列控制软件监控测序数据质量，并测序分析视图软件以评估数据质量，并进行任何故障排除。然后，当序列完成时，更改流量单元垫片，并在开始下一次运行之前执行维护清洗。在污染物暴露的树突细胞流式细胞测量后，打开 ImageJ Fiji，根据处理组将非暴露和污染物暴露人类树突状细胞样本组的 100 个保存的细胞图像合并到单独的文件中。要分析两个群体中的 CD1d 和 Lamp1 合并，请打开污染物暴露的 100 个合并单元格图像，然后选择"图像、颜色"和"分割通道"，将图像拆分为两个单独的图像，每个通道具有一个荧光量。要创建全分像素的散点图，请选择"分析、同化和全分阈值"，然后按"打印屏幕"保存散点图。要计算每个单蜂窝图像的曼德结肠化系数，请使用椭圆形选择工具选择具有分割通道的图像文件上的单细胞图像，然后再次选择"分析、结肠化和结肠化阈值"。然后从"感兴趣区域"对话框中选择"通道 1"，然后单击"确定"。计算所有 100 个单元格图像的系数后，将结果导入适当的电子表格，然后对控制非公开单元格样本重复分析。利用RNA测序和转录数据分析，在污染物暴露的DC中确定了几个主要改变的基因簇，包括脂质代谢和内分泌功能。在单个细胞图像级别，HLADR阳性CD11c阳性树突状细胞可以根据其CD1d和Lamt1共表达进行封闭。控制非暴露的树突状细胞表现出最小的CD1d和Lamt1蛋白共钙化，表明CD1d内分泌贩运的基础水平，以及生理条件下的高水平表面表达。而CD1d则保留在污染物暴露的树突状细胞的晚期内分泌物中，确认了该实验细胞群体内膜基因轮廓的改变。将单个蜂窝图像合并到单个图像文件中后，可以根据其荧光表达拆分单个图像，并且两个通道之间的像素强度的合并可以在散点图中可视化。然后，可以使用曼德系数对两个治疗组中的 CD1d 和 Lamp1 蛋白质之间的结肠化程度进行量化。如果蛋白质强度在同化区和非同化区域之间是异质的，则同化强度不会与同化区域平行，因此，根据像素强度进一步评估两种蛋白质的结肠化也很重要。一旦掌握，图像分析可以在两个小时内完成，如果每项技术都执行得当，RNA测序设置可以在三小时内完成。在尝试此过程时，请务必记住确保所有试剂正确加载到正确的位置，并且音序器中没有泄漏。按照这个程序，可以执行其他方法，如微RNA、外显体或乳腺细胞测序，分别回答有关全球微RNA表达、基因突变或DNA甲基化的其他问题。因此，该技术在开发后，将有助于细胞成像分析和下一代测序领域的研究人员探索环境污染物对基因表达和蛋白质功能的影响。看完这段视频后，您应该对如何设置下一代测序以及蛋白质结肠化成像器分析有一个良好的理解。不要忘记，在人体血液样本中使用有毒污染物化学品可能极其危险。执行这些程序时，应始终采取预防措施，如使用化学烟罩和个人防护设备。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

流式细胞仪分析小鼠主动脉内流的免疫细胞

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

科研

免疫与感染

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

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人类<em在体外承认免疫失衡的早期国家禁止作为筛检工具

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

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Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

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基于图像的流式细胞仪技术来评估变化粒细胞功能<em&gt;在体外</em

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小鼠淋巴细胞通过标签<sup&gt; 64</sup&gt;的Cu-抗体受体靶向用于<em&gt;体内</em&gt;由PET / CT细胞运输

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

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荧光寿命成像显微镜观察细胞内圈套的贩运

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