Name: integrate imaging flow cytometry and transcriptomic profiling to evaluate altered endocytic cd1d trafficking
Uploaded: 2018-10-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking at JoVE.com

Forfatterne takke Robert Giulitto (Hoxworth blod center) for menneskelige blodprøver og Dr. Liang Niu til normalisering af genekspression læser. Vi takker også tilskud fra nationale Institute of Environmental Health Sciences (ES006096), Center for miljømæssige genetik (CEG) pilot projekt (S.H.), National Institute for allergi og smitsomme sygdomme (AI115358) (S.H.), University of Cincinnati University Research Council award (S.H.), og University af Cincinnati College af medicin Enhancement kernefinansiering (X. Z.).

Menneskelige protokoller i denne undersøgelse blev godkendt af det institutionelle Review Board af University of Cincinnati og alle metoder blev udført i overensstemmelse med de relevante retningslinjer og forordninger. Blodprøver fra raske donorer blev indhentet fra Hoxworth blod Center ved University of Cincinnati Medical Center.
1. transkriptom profilering af forurenende stof-eksponerede humane monocyt-afledte DCs
<ol><li>Total RNA udvinding af BaP-eksponerede DCs<ol>
<li>Skelne mennes...

<ol>
	<li>Roche, P. A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+Processing+and+Presentation+Mechanisms+in+Myeloid+Cells.">Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells.</a> Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MR1+uses+an+endocytic+pathway+to+activate+mucosal-associated+invariant+T+cells.">MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells.</a> The Journal of experimental medicine. 205 (5), 1201-1211 (2008).</li><li>Nakamura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomes+are+specialized+platforms+for+bacterial+sensing+and+NOD2+signalling.">Endosomes are specialized platforms for bacterial sensing and NOD2 signalling.</a> Nature. 509 (7499), 240-244 (2014).</li><li>Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+antigen+processing.">Pathways of antigen processing.</a> Annual review of immunology. 31, 443-473 (2013).</li><li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+natural+killer+T+cells:+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions.">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li><li>Zajonc, D. M., Kronenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1+mediated+T+cell+recognition+of+glycolipids.">CD1 mediated T cell recognition of glycolipids.</a> Current opinion in structural biology. 17 (5), 521-529 (2007).</li><li>Cox, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+cellular+lipids+bound+to+human+CD1d+molecules.">Determination of cellular lipids bound to human CD1d molecules.</a> PloS one. 4 (5), e5325 (2009).</li><li>Yuan, W., Kang, S. J., Evans, J. E., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+lipid+ligands+associated+with+human+CD1d+targeted+to+different+subcellular+compartments.">Natural lipid ligands associated with human CD1d targeted to different subcellular compartments.</a> Journal of immunology. 182 (8), 4784-4791 (2009).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+deoxyceramides+and+diacylglycerols+as+CD1b+scaffold+lipids+among+diverse+groove-blocking+lipids+of+the+human+CD1+system.">Discovery of deoxyceramides and diacylglycerols as CD1b scaffold lipids among diverse groove-blocking lipids of the human CD1 system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19335-19340 (2011).</li><li>de Jong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1a-autoreactive+T+cells+recognize+natural+skin+oils+that+function+as+headless+antigens.">CD1a-autoreactive T cells recognize natural skin oils that function as headless antigens.</a> Nature. 15 (2), 177-185 (2014).</li><li>Trombetta, E. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+antigen+processing+in+vitro+and+in+vivo.">Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo.</a> Annual review of immunology. 23, 975-1028 (2005).</li><li>Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+immunophenotyping+for+the+Human+Immunology+Project.">Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project.</a> Nature reviews. Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).</li><li>Sharma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+endocytic+lipid+antigen+presentation+by+common+lipophilic+environmental+pollutants.">Inhibition of endocytic lipid antigen presentation by common lipophilic environmental pollutants.</a> Science Reports. 7 (1), 2085 (2017).</li><li>Boom, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids.">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> Journal of clinical microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).</li><li>Nachamkin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agilent+2100+bioanalyzer+for+restriction+fragment+length+polymorphism+analysis+of+the+Campylobacter+jejuni+flagellin+gene.">Agilent 2100 bioanalyzer for restriction fragment length polymorphism analysis of the Campylobacter jejuni flagellin gene.</a> Journal of clinical microbiology. 39 (2), 754-757 (2001).</li><li>Kaimal, V., Bardes, E. E., Tabar, S. C., Jegga, A. G., Aronow, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToppCluster:+a+multiple+gene+list+feature+analyzer+for+comparative+enrichment+clustering+and+network-based+dissection+of+biological+systems.">ToppCluster: a multiple gene list feature analyzer for comparative enrichment clustering and network-based dissection of biological systems.</a> Nucleic acids research. 38 (Web Server issue), W96-W102 (2010).</li><li>Bauer-Mehren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+genomic+information+with+biological+networks+using+Cytoscape).">Integration of genomic information with biological networks using Cytoscape).</a> Methods in molecular biology. 1021, 37-61 (2013).</li><li>Cline, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+biological+networks+and+gene+expression+data+using+Cytoscape.">Integration of biological networks and gene expression data using Cytoscape.</a> Nature protocols. 2 (10), 2366-2382 (2007).</li><li>Huang, S., Moody, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-unrestricted+T+cells+in+the+human+CD1+system.">Donor-unrestricted T cells in the human CD1 system.</a> Immunogenetics. 68 (8), 577-596 (2016).</li><li>Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Innate-Like+T+Cells+in+Tuberculosis.">Targeting Innate-Like T Cells in Tuberculosis.</a> Frontiers in immunology. 7, 594 (2016).</li><li>Moody, D. B., Porcelli, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pathways+of+CD1+antigen+presentation.">Intracellular pathways of CD1 antigen presentation.</a> Nature reviews. Immunology. 3 (1), 11-22 (2003).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Diard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+cooperative+virulence+by+the+expression+of+an+avirulent+phenotype.">Stabilization of cooperative virulence by the expression of an avirulent phenotype.</a> Nature. 494 (7437), 353-356 (2013).</li><li>Bader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proliferative+and+mature+beta-cells+in+the+islets+of+Langerhans.">Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans.</a> Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).</li><li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+imaging+software+tools.">Biological imaging software tools.</a> Nature. 9 (7), 697-710 (2012).</li><li>Costes, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+and+quantitative+measurement+of+protein-protein+colocalization+in+live+cells.">Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells.</a> Biophysical journal. 86 (6), 3993-4003 (2004).</li></ol>

Funktionelle bekræftelse af en ændret gen pathway udfordrende, på grund af almindeligt påvirket genekspression, der involverer flere veje og er vanskeligheden at integrere individuelle og befolkningsmæssige cellulære aktiviteter. Vi ansat imaging flowcytometri specifikt prøve CD1d menneskehandel i endocytic rum. Imaging flowcytometri integrerer den befolkningsmæssige måling af celler og individuelle demonstration af subcellulært colocalization af flere proteiner. Konfokal mikroskopi har tidligere givet høj opl...

Antigen præsentation involverer typisk intracellulær protein menneskehandel, som ofte blev undersøgt ved hjælp af morfologiske karakteristika og fænotypiske profilering af antigen præsentere celler1,2,3 . For at integrere fordelene af billedbehandling og fænotyper metoder, beskriver vi en billeddannelse analyse platform på både enkelt celle og befolkning niveauer til at vise en ændret protein colocalization i menneskelige dendritiske celler (DCs). I peptid antigen præsentation, store histocompatibility complex (MHC) klasse I molekyler binder en kort peptid (8-10 restkoncentrationer) i det endoplasmatiske reticulum at aktivere konventionelle CD8+ T celler, mens MHC klasse II molekyler binder en forholdsvis længere peptid (~ 20 restkoncentrationer) i endocytic rum at aktivere konventionelle CD4+ T-celler1,4. Derimod aktiveres lipid-specifikke T-celler ved CD1 proteiner med lipid antigener indlæst hovedsagelig i endocytic rum5,6. Lipid antigen præsentation kræver levering af lipid metabolitter produceret i lipid metabolisme7,8,9,10 og lastning af funktionelle lipid metabolitter til CD1 proteiner i endocytic rum5,6. I denne forbindelse er forskellige cellulære faktorer modulerende lipid antigen præsentation, især i miljømæssig eksponering af lipofile stoffer og immune lidelser, kritisk skal defineres. I denne undersøgelse brugte vi transkriptom analyse, billede profilering og cellulære og befolkningsmæssige imaging analyse af humane monocyt-afledte DCs for at bestemme endocytic protein handel bidrager til lipid antigen præsentation i forurenende eksponering. Bestemt, denne kombinerede platform kan anvendes til at studere subcellulært protein handel og colocalization i forskellige biologiske processer.
Teknisk, subcellulært protein lokalisering viste normalt bruger Konfokal mikroskopi og statistisk analyseres i et begrænset antal fundne celler1,2,3,11. Derudover er flowcytometri blevet bredt anvendt til gate cellepopulationer med co farves signaler af flere proteiner på en cellulært niveau12; dette mangler imidlertid en detaljeret visualisering af subcellulært protein colocalization. For at opnå en omfattende og statistiske analyser af procentdel protein colocalization på både cellulære og befolkning niveauer, vil vi indarbejde imaging profilering og analyse med henblik på at bestemme funktionerne i protein colocalization med biologiske relevans. Specifikt, vi bruger imaging flowcytometri til at registrere colocalization af CD1d og lysosomale-associerede membranen protein 1 (Lamp1) proteiner i denne undersøgelse. Kvantitativ analyse af colocalized molekyler var tidligere vanskeligt skal udføres på en befolkningsmæssige skala. I denne undersøgelse tilpasset vi ImageJ-Fiji program til at undersøge procentdelen af protein colocalization med et stort antal Co farvede celler både befolkningsmæssige og individuelle cellulære niveau. Specifikt, målte vi Co lokaliserede områder, intensitet og befolkningsmæssige størrelse til støtte for den konklusion, at CD1d proteinet i vid udstrækning blev bibeholdt i slutningen endocytic rum af menneskelige DCs i eksponering for en lipofile forurenende benzo [a] pyren (BaP)13 . Denne kombinerede cellulære og befolkningen imaging analyse fastsat meget reproducerbar, omfattende og statistisk signifikante resultater af CD1d-Lamp1 colocalization relevant for hæmmet lipid antigen præsentation.
Transkriptom af BaP-eksponerede menneskelige DCs støttet kraftigt den hypotese, at endocytic lipid metabolisme og CD1d endocytic menneskehandel blev nedsat i BaP eksponering. For at teste denne hypotese, anvendte vi imaging flowcytometri for at profilere de billeder af DC befolkning, der var Co farves med flere proteiner, herunder CD1d, endocytic markører og DC markører. Endelig var Co farvede celler statistisk analyseres for at påvise procentdelen af intensitet og områder af CD1d og Lamp1 colocalization.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1340px;" width="1340">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Transcriptomics</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td style="width:417px;">HiSeq 2500 v4</td>
			<td style="width:191px;">Illumina HiSeq system</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">ImagingStream X</td>
			<td style="width:448px;">Millipore</td>
			<td>100220</td>
			<td>Imaging flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">mirVana miRNA Isolation Kit</td>
			<td style="width:448px;">Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Total RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agilent RNA 6000 Pico Kit</td>
			<td style="width:448px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Total RNA QC analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler</td>
			<td style="width:448px;">Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>PCR, enzyme reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module&#160;</td>
			<td style="width:448px;">New England Biolab</td>
			<td></td>
			<td>PolyA RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Automated SMARTer Apollo system</td>
			<td style="width:448px;">Takara</td>
			<td></td>
			<td>PolyA RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td style="width:448px;">New England Biolab</td>
			<td></td>
			<td>Library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agencourt AMPure XP magnetic beads</td>
			<td style="width:448px;">Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>DNA purification&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:448px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Library QC, size distribution analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td style="width:448px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Library QC, size distribution analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher)</td>
			<td style="width:448px;">Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Library quantification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NEBNext Library Quant Kit</td>
			<td style="width:448px;">New England Biolab</td>
			<td></td>
			<td>Library quantification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">cBot</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Library cluster generation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot &#8211; HS</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Library cluster generation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">HiSeq 1000</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">TruSeq SBS Kit v3 - HS (50-cycles)</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7)</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td style="width:417px;">L243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5)</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td align="right" style="width:417px;">3.9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Brilliant violet 421</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td style="width:417px;">L161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">PE-anti-mouse IgG2b</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td align="right" style="width:417px;">51.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Alexa Fluor 647 (AF647)</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td style="width:417px;">CD107a(H4A3)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integrate imaging flow cytometry and transcriptomic profiling to evaluate altered endocytic cd1d trafficking

Befolkningsmæssige analyser af de morfologiske og funktionelle ændringer i endocytic proteiner er udfordrende på grund af efterspørgsel af billedoptagelse på en enkelt celle niveau og statistiske billedanalyse på befolkningsmæssige plan. For at overvinde denne vanskelighed, brugte vi imaging flowcytometri og transkriptom profilering (RNA-seq) til at bestemme ændrede subcellulært lokalisering af klyngen af differentiering 1d protein (CD1d) forbundet med nedsat endocytic genekspression i menneskelige dendritiske celler (DCs), som blev udsat for den fælles lipofile luft forurenende benzo [a] pyren. Colocalization af CD1d og endocytic markør Lamp1 proteiner fra tusindvis af celle billeder taget med imaging flowcytometri blev analyseret ved hjælp af ideer og ImageJ-Fiji programmer. Talrige cellulære billeder med co farvede CD1d og Lamp1 proteiner blev visualiseret efter gating på CD1d+Lamp1+ DCs ved hjælp af ideer. Den forbedrede CD1d og Lamp1 colocalization ved BaP eksponering blev finpudset ved hjælp af thresholded scatterplots, testet med Manders koefficienter for Co lokaliserede intensitet, og afbildet baseret på andelen af co lokaliserede områder ved hjælp af ImageJ-Fiji. Vores data give en fordelagtig instrumental og bioinformatic tilgang for at måle protein colocalization på både enkelt og befolkningsmæssige cellulære niveauer, støtte en nedsat funktionel resultatet af transkriptom ændring i forurenende-eksponerede mennesker DCs.

Den lipofile forurenende BaP ændrer endocytic gen klynger i menneskelige DCs. menneskelige monocyt-afledte DCs fra hver donor (n = 3) var inkuberes med BaP og sorteret for konventionelle DCs, som blev yderligere brugt til RNA udvinding og transkriptom analyse som beskrevet . Ved normalisering af genekspression, var ændrede gener mellem BaP-eksponerede og ikke-eksponerede grupper grupperet efter den funktionelle sammenhæng af varierende udtrykte gener. Vi input listen ændrede gen-Toppc...

Watch this Scientific Journal Video about Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking at JoVE.com

Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking

Imaging flowcytometri giver en ideel metode til påvisning af de morfologiske og funktionelt ændring af celler på individuelle og befolkningsmæssige niveauer. Forstyrret endocytic funktion for lipid antigen præsentation i forurenende-eksponerede menneskelige dendritiske celler blev demonstreret med et kombineret transkriptom profilering af genekspression og morfologiske demonstration af protein handel.

Integrere Imaging flowcytometri og transkriptom profilering for at vurdere ændrede Endocytic CD1d handel

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single ...

Disse metoder integrerer næste generations sekventering og flow cytometri billeddannelse analyse. Det kan hjælpe med at besvare interessante spørgsmål, som om nogle fænokomypiske ændringer er implicere, i stedet for transcriptome, især i den forurenende eksponering miljø. Den største fordel ved denne enkle metode for os er, at vi kan bruge den til at måle colocalization af biologisk vigtigt protein, til at fortolke resultaterne af centrale differentiale genekspression på et funktionelt niveau.Konsekvenserne af denne teknik strækker sig mod diagnosticering af patologiske og toksikologiske resultater. Som en normal imager tilgang,see har evnen til at forbinde genekspression til protein funktion. Generelt, personer nye til denne metode vil kæmpe på grund af de høje tekniske krav i billeddannelse og transskriptionomic analyse.For at sekvensere det humane monocyt afledte dendritiske cellebibliotek skal du først lægge sekventerings- og indekseringsgenskaberne på henholdsvis sekvenseringsbiosyntesen og indekseringsreagegenerne og placere stativerne i et laboratorievandbad i en time, indtil al isen er smeltet, og reagenserne blandes grundigt. Mens reagenserne optøer, skal du køre på sequenceren og slutte computeren til et netværksdrev, når drevet Skub ikke vises, og starte sequencerkontrolsoftwaren. Dernæst tilsættes omkring 100 milliliter vedligeholdelsesvaskopløsning til hver af flaskerne i sekvensering af biosyntesegenreolen, og skru en tragthætte på hver flaske.Der tilsættes ca. 12 milliliter vedligeholdelsesvaskopløsning til hvert 15 milliliterkonisk rør i indekseringsreagegengøret, og hætterne kasseres. Læg derefter begge stativer på sequenceren. Vælg Vedligeholdelsesvask i sequencerstyringssoftwaren, og følg vejledningen for rengøring af sequencervæskesystemet.Brug en lommelygte til visuelt at inspicere flowcellen for bobler, der passerer gennem banerne, for at sikre, at der ikke er lækage. Når vaskesekvensen er færdig, skal du åbne fanen Sekvens og starte en ny kørsel og dirigere outputdataene til et netværksdrev. Overfør et eksempelark til demultiplexing, og angiv de relevante reagensoplysninger.Brug en brugt flowcelle til at prime systemet med sekventeringsgenerne. Når klyngegenereringen er fuldført, skal du fjerne flowcellen. Og spray cellen let med vand.Tør flowcellen tør med linsepapir efterfulgt af en let spray med 95% ethanol. Efter aftørring af flowcellen tør igen, skal du kontrollere flowcellens overflade mod lyset for at sikre, at den er ren uden snavs eller saltrester. Når det primære trin er færdigt, skal du indlæse den klyngerede flowcelle og starte sekvenseringen.Sekvensanalysefremvisersoftwaren startes automatisk. Ca. 26 timer senere skal du overvåge datakvaliteten via højsekvensstyringssoftwaren og sekvenseringsanalysevisningssoftwaren for at vurdere datakvaliteten og for enhver fejlfinding. Når sekvensen er færdig, skal du derefter ændre flowcellepakningen og udføre en vedligeholdelsesvask, før du begynder næste kørsel.Efter flow cytometrisk billeddannelse af de forurenende eksponerede dendritiske celler, åbne ImageJ Fiji, og fusionere de 100 gemte cellebilleder for ikke-eksponerede og forurenende eksponerede menneskelige dendritiske celle prøvegrupper i individuelle filer i henhold til behandlingsgruppen. Hvis du vil analysere cd1d- og lampe1-colokalkning inden for de to populationer, skal du åbne det forurenende 100 flettede cellebillede og vælge Billed- og farve- og splitkanaler for at opdele billedet i to individuelle billeder med en enkelt fluorophore pr. kanal. Hvis du vil oprette et punktplot af de colocaliserede pixel, skal du vælge Analysér, Farvefaren og Colocalization Threshold og trykke på Print Screen for at gemme punktafbildning.Hvis du vil beregne Manders colocalization-koefficient for hvert enkelt mobilbillede, skal du bruge det ovale markeringsværktøj til at markere et enkeltcellebillede på billedfilen med de opdelte kanaler og vælge Analysér, Colocalization og Colocalization Threshold igen. Vælg derefter Kanal 1 i dialogboksen for området af interesse, og klik på OK. Når koefficienten er beregnet for alle 100 cellebilleder, skal resultaterne importeres til et passende regneark, og analysen for kontrolprøven uden for kontrolelementet gentages. Ved hjælp af RNA-sekventering og transskriptions-baserede dataanalyser blev flere større ændrede genklynger, herunder lipidmetabolisme og endocytiske funktioner, identificeret i de forurenende eksponerede DC'er.På det individuelle cellebillede niveau, HLADR positive CD11c positive dendritiske celler kan gated, i henhold til deres CD1d og Lamp1 samekspression. Kontrol ikke-eksponerede dendritiske celler demonstrere minimal CD1d og Lamp1 protein colocalization, hvilket indikerer et basalt niveau af CD1d endocytisk handel, og et højt niveau af overfladeudtryk under fysiologiske forhold. Der henviser til, at CD1d bevares i de sene endocytiske rum af forurenende eksponerede dendritiske celler, hvilket bekræfter ændrede endocytiske genprofiler i denne eksperimentelle cellepopulation.Når de enkelte mobilbilleder er flettet sammen til en enkelt billedfil, kan de enkelte billeder opdeles i henhold til deres fluorophoreudtryk, og farvefariseringen af pixelintensiteten mellem de to kanaler kan visualiseres i et punktafbildning. Graden af colocalization mellem CD1d og Lamp1 proteiner i de to behandlingsgrupper kan derefter kvantificeres ved hjælp af Mander's koefficienter. Hvis proteinintensiteten er hetergene mellem de afkalkalaliserede og ikke-colocaliserede områder, vil den afkalkningsintensitet ikke være parallel med de afkalkalaliserede områder, derfor er det også vigtigt yderligere at vurdere farvefariseringen af de to proteiner baseret på pixelintensiteten.Når billedanalysen er styr på master, kan den udføres på to timer, og RNA-sekvenseringsopsætningen kan fuldføres på tre timer, hvis hver teknik udføres korrekt. Under forsøget på denne procedure, er det vigtigt at huske at sikre, at alle reagenser er korrekt indlæst i de korrekte positioner, og at der ikke er lækage i sequenceren. Efter denne procedure kan andre metoder, som mikroRNA, exome eller mastcellesekvensering, udføres for at besvare yderligere spørgsmål om henholdsvis globalt mikro-RNA-udtryk, genmutation eller DNA-methylering.Så efter det udvikling, vil denne teknik hjælpe forskere inden for cellulære billeddannelse analyse, og næste generation sekventering at undersøge effekten af de miljømæssige forurenende på genekspression og protein funktion. Efter at have set denne video, bør du have en god forståelse af, hvordan du opretter den næste generation sekventering, og imager analyse af protein colocalization. Glem ikke, at arbejde med et giftigt forurenende kemikalie i menneskelige blodprøver kan være yderst farligt.Forholdsregler såsom brug af en kemisk røghætte og personlige værnemidler bør altid tages, når disse procedurer udføres.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cell-baserede Flowcytometri Assay til måling cytotoksisk aktivitet

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Image-baserede Flowcytometri Teknik at vurdere ændringer i granulocyt Function<em&gt; In vitro</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

En enkel og hurtig protokol til ikke-enzymatisk dissociere frisk humant væv til analyse af lymfocytter

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescens-aktiveret cellesortering til oprensning af Plasmacytoide dendritiske celler fra knoglemarven i mus

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Muse lymfocyt Mærkning af<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-antistofreceptor Målretning for<em&gt; In vivo</em&gt; Cell Trafficking af PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Måling af T-celle alloreaktivitet Brug Imaging flowcytometri

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Kvalitativ og kvantitativ analyse af den immun Synapse i det menneskelige System, ved hjælp af Imaging flowcytometri

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Visualisere intracellulære SNARE handel af fluorescens levetid Imaging mikroskopi

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...