Name: integrate imaging flow cytometry and transcriptomic profiling to evaluate altered endocytic cd1d trafficking
Uploaded: 2018-10-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking at JoVE.com

De auteurs bedanken Robert Giulitto (Hoxworth bloed midden) voor menselijke bloedmonsters en Dr. Liang Niu voor de normalisatie van de genexpressie leest. Wij danken ook financiële steun van de National Institute of Environmental Health Sciences (ES006096), centrum voor milieu genetica (CEG) proefproject (S.H.), National Institute of Allergy and Infectious Diseases (AI115358) (S.H.), Universiteit van Cincinnati University Research Council award (sh) en de Universiteit van Cincinnati College van geneeskunde Enhancement basisfinanciering (X. Z.).

Menselijke protocollen in deze studie werden goedgekeurd door de institutionele Review Board van de University of Cincinnati en alle methoden werden uitgevoerd volgens de relevante richtlijnen en verordeningen. Bloedmonsters van gezonde donoren waren van de Hoxworth bloed Center aan de University of Cincinnati Medical Center.
1. Transcriptomic profilering van verontreinigende stoffen-blootgesteld menselijke monocyt-afgeleide DCs
<ol><li>Totaal RNA extractie van BaP-blootgesteld DCs<ol>
<li>O...

<ol>
	<li>Roche, P. A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+Processing+and+Presentation+Mechanisms+in+Myeloid+Cells.">Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells.</a> Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MR1+uses+an+endocytic+pathway+to+activate+mucosal-associated+invariant+T+cells.">MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells.</a> The Journal of experimental medicine. 205 (5), 1201-1211 (2008).</li><li>Nakamura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomes+are+specialized+platforms+for+bacterial+sensing+and+NOD2+signalling.">Endosomes are specialized platforms for bacterial sensing and NOD2 signalling.</a> Nature. 509 (7499), 240-244 (2014).</li><li>Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+antigen+processing.">Pathways of antigen processing.</a> Annual review of immunology. 31, 443-473 (2013).</li><li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+natural+killer+T+cells:+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions.">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li><li>Zajonc, D. M., Kronenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1+mediated+T+cell+recognition+of+glycolipids.">CD1 mediated T cell recognition of glycolipids.</a> Current opinion in structural biology. 17 (5), 521-529 (2007).</li><li>Cox, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+cellular+lipids+bound+to+human+CD1d+molecules.">Determination of cellular lipids bound to human CD1d molecules.</a> PloS one. 4 (5), e5325 (2009).</li><li>Yuan, W., Kang, S. J., Evans, J. E., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+lipid+ligands+associated+with+human+CD1d+targeted+to+different+subcellular+compartments.">Natural lipid ligands associated with human CD1d targeted to different subcellular compartments.</a> Journal of immunology. 182 (8), 4784-4791 (2009).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+deoxyceramides+and+diacylglycerols+as+CD1b+scaffold+lipids+among+diverse+groove-blocking+lipids+of+the+human+CD1+system.">Discovery of deoxyceramides and diacylglycerols as CD1b scaffold lipids among diverse groove-blocking lipids of the human CD1 system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19335-19340 (2011).</li><li>de Jong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1a-autoreactive+T+cells+recognize+natural+skin+oils+that+function+as+headless+antigens.">CD1a-autoreactive T cells recognize natural skin oils that function as headless antigens.</a> Nature. 15 (2), 177-185 (2014).</li><li>Trombetta, E. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+antigen+processing+in+vitro+and+in+vivo.">Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo.</a> Annual review of immunology. 23, 975-1028 (2005).</li><li>Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+immunophenotyping+for+the+Human+Immunology+Project.">Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project.</a> Nature reviews. Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).</li><li>Sharma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+endocytic+lipid+antigen+presentation+by+common+lipophilic+environmental+pollutants.">Inhibition of endocytic lipid antigen presentation by common lipophilic environmental pollutants.</a> Science Reports. 7 (1), 2085 (2017).</li><li>Boom, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids.">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> Journal of clinical microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).</li><li>Nachamkin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agilent+2100+bioanalyzer+for+restriction+fragment+length+polymorphism+analysis+of+the+Campylobacter+jejuni+flagellin+gene.">Agilent 2100 bioanalyzer for restriction fragment length polymorphism analysis of the Campylobacter jejuni flagellin gene.</a> Journal of clinical microbiology. 39 (2), 754-757 (2001).</li><li>Kaimal, V., Bardes, E. E., Tabar, S. C., Jegga, A. G., Aronow, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToppCluster:+a+multiple+gene+list+feature+analyzer+for+comparative+enrichment+clustering+and+network-based+dissection+of+biological+systems.">ToppCluster: a multiple gene list feature analyzer for comparative enrichment clustering and network-based dissection of biological systems.</a> Nucleic acids research. 38 (Web Server issue), W96-W102 (2010).</li><li>Bauer-Mehren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+genomic+information+with+biological+networks+using+Cytoscape).">Integration of genomic information with biological networks using Cytoscape).</a> Methods in molecular biology. 1021, 37-61 (2013).</li><li>Cline, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+biological+networks+and+gene+expression+data+using+Cytoscape.">Integration of biological networks and gene expression data using Cytoscape.</a> Nature protocols. 2 (10), 2366-2382 (2007).</li><li>Huang, S., Moody, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-unrestricted+T+cells+in+the+human+CD1+system.">Donor-unrestricted T cells in the human CD1 system.</a> Immunogenetics. 68 (8), 577-596 (2016).</li><li>Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Innate-Like+T+Cells+in+Tuberculosis.">Targeting Innate-Like T Cells in Tuberculosis.</a> Frontiers in immunology. 7, 594 (2016).</li><li>Moody, D. B., Porcelli, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pathways+of+CD1+antigen+presentation.">Intracellular pathways of CD1 antigen presentation.</a> Nature reviews. Immunology. 3 (1), 11-22 (2003).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Diard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+cooperative+virulence+by+the+expression+of+an+avirulent+phenotype.">Stabilization of cooperative virulence by the expression of an avirulent phenotype.</a> Nature. 494 (7437), 353-356 (2013).</li><li>Bader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proliferative+and+mature+beta-cells+in+the+islets+of+Langerhans.">Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans.</a> Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).</li><li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+imaging+software+tools.">Biological imaging software tools.</a> Nature. 9 (7), 697-710 (2012).</li><li>Costes, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+and+quantitative+measurement+of+protein-protein+colocalization+in+live+cells.">Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells.</a> Biophysical journal. 86 (6), 3993-4003 (2004).</li></ol>

Functionele bevestiging van een veranderd gen-traject is uitdagend, vanwege sterk beïnvloed genexpressie waarbij meerdere trajecten en de moeilijkheid om individuele en populational cellulaire activiteiten te integreren. Wij werkzaam imaging stroom cytometry specifiek test CD1d mensenhandel endocytotische compartimenten. Stroom cytometry Imaging integreert de populational meting van cellen en de afzonderlijke demonstratie van subcellular colocalization van meerdere eiwitten. Confocale microscopie heeft eerder verstrekte...

Antigeen presentatie omvat normaliter intracellulaire eiwitten mensenhandel, die is vaak onderzocht met behulp van morfologische karakterisering en fenotypische profilering van antigeen presentatie van cellen1,2,3 . Om de voordelen van beeldvorming en fenotypering methoden te integreren, beschrijven we een imaging platform van de analyse op zowel eencellige als populatie aan te tonen een veranderd eiwit colocalization in menselijke dendritische cellen (DC's). In peptide-antigeen presentatie, grote histocompatibility complex (MHC) klasse I moleculen binden een korte peptide (8-10 residuen) in het endoplasmatisch reticulum te activeren van conventionele CD8+ T cellen, terwijl de MHC klasse II moleculen binden een relatief langere peptide (~ 20 residuen) in endocytotische compartimenten te activeren van conventionele CD4+ T cellen1,4. In tegenstelling, worden lipide-specifieke T-cellen geactiveerd door CD1 eiwitten met lipide antigenen geladen voornamelijk in endocytotische compartimenten5,6. Lipide antigeen presentatie bepaalt de levering van lipide metabolieten geproduceerd in8,9,10 , lipide metabolisme7,en het laden van functionele lipide metabolieten voor CD1 eiwitten in endocytotische compartimenten5,6. In dit verband zijn verschillende cellulaire factoren moduleren van lipide antigeen presentatie, met name in de milieublootstelling van lipofiele verontreinigende stoffen en immuun aandoeningen, cruciaal voor worden gedefinieerd. In deze studie, we gewend transcriptomic analyse, afbeelding profilering en cellulaire en populational imaging analyse van menselijke monocyt-afgeleide DCs bepalen de endocytotische eiwit mensenhandel bij te dragen aan lipide antigeen presentatie blootstelling van de verontreinigende stof. Zeker, dit gecombineerde platform kan worden toegepast op het bestuderen van eiwit subcellular mensenhandel en colocalization in verschillende biologische processen.
Eiwit subcellular localisatie bleek technisch, meestal met behulp van de confocal microscopie en statistisch geanalyseerd in een beperkt aantal gedetecteerde cellen1,,2,,3,11. Bovendien is cytometry van de stroom in grote lijnen toegepast op poort cel populaties met mede gebeitst signalen van meerdere eiwitten op een cellulair niveau12; echter, dit ontbreekt een gedetailleerde visualisatie van eiwit subcellular colocalization. Om uitgebreide en statistische analyses van percentage eiwit colocalization niveau van zowel de cellulaire en de bevolking, nemen we imaging profilering en analyse benaderingen om te bepalen van de kenmerken van eiwitten colocalization met biologische relevantie. Specifiek, we imaging stroom cytometry gebruiken voor het detecteren van de colocalization van CD1d en lysosomale-geassocieerde membraan eiwit 1 (Lamp1) eiwitten in deze studie. Kwantitatieve analyse van colocalized moleculen was eerder moeilijk op een populational schaal moet worden uitgevoerd. In deze studie aangepast we de ImageJ-Fiji-programma te onderzoeken het percentage eiwit colocalization met een groot aantal CO gekleurde cellen zowel populational als individuele cellulair niveau. Specifiek, we gemeten CO gelokaliseerde gebieden, intensiteit en populational grootte om de conclusie dat de CD1d proteïne was grotendeels bewaard in late endocytotische compartimenten van menselijke DCs blootstelling aan een lipofiele verontreinigende stof benzo [a] pyreen (BaP)13 te steunen . Deze gecombineerde cellulaire en bevolking imaging analyse zeer reproduceerbaar, uitgebreide en statistisch significante resultaten van CD1d-Lamp1 colocalization relevant zijn voor geremde lipide antigeen presentatie opgeleverd.
Transcriptome van BaP-blootgesteld menselijke DCs voorstander groot van de hypothese dat endocytotische lipide metabolisme en CD1d endocytotische handel in BaP blootstelling werden aangetast. Om te testen deze hypothese, pasten we imaging stroom cytometry om het profiel van de beelden van DC bevolking die samen met meerdere eiwitten met inbegrip van CD1d en endocytotische markeringen DC markeringen werden gekleurd. Ten slotte, mede gekleurde cellen zijn statistisch geanalyseerd om aan te tonen van het percentage van de intensiteit en gebieden van CD1d en Lamp1 colocalization.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1340px;" width="1340">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Transcriptomics</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td style="width:417px;">HiSeq 2500 v4</td>
			<td style="width:191px;">Illumina HiSeq system</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">ImagingStream X</td>
			<td style="width:448px;">Millipore</td>
			<td>100220</td>
			<td>Imaging flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">mirVana miRNA Isolation Kit</td>
			<td style="width:448px;">Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Total RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agilent RNA 6000 Pico Kit</td>
			<td style="width:448px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Total RNA QC analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler</td>
			<td style="width:448px;">Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>PCR, enzyme reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module&#160;</td>
			<td style="width:448px;">New England Biolab</td>
			<td></td>
			<td>PolyA RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Automated SMARTer Apollo system</td>
			<td style="width:448px;">Takara</td>
			<td></td>
			<td>PolyA RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td style="width:448px;">New England Biolab</td>
			<td></td>
			<td>Library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agencourt AMPure XP magnetic beads</td>
			<td style="width:448px;">Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>DNA purification&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:448px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Library QC, size distribution analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td style="width:448px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Library QC, size distribution analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher)</td>
			<td style="width:448px;">Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Library quantification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NEBNext Library Quant Kit</td>
			<td style="width:448px;">New England Biolab</td>
			<td></td>
			<td>Library quantification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">cBot</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Library cluster generation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot &#8211; HS</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Library cluster generation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">HiSeq 1000</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">TruSeq SBS Kit v3 - HS (50-cycles)</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7)</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td style="width:417px;">L243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5)</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td align="right" style="width:417px;">3.9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Brilliant violet 421</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td style="width:417px;">L161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">PE-anti-mouse IgG2b</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td align="right" style="width:417px;">51.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Alexa Fluor 647 (AF647)</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td style="width:417px;">CD107a(H4A3)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integrate imaging flow cytometry and transcriptomic profiling to evaluate altered endocytic cd1d trafficking

Populational analyses van de morfologische en functionele wijziging van endocytotische eiwitten zijn uitdagend vanwege de vraag van Fotolader op een eencellige niveau en statistische beeldanalyse op een populational niveau. Om deze moeilijkheid te overwinnen, we gewend imaging stroom cytometry en transcriptomic (RNA-seq) profilering bepalen veranderde subcellular localisatie van het cluster van differentiatie 1d eiwit (CD1d) die zijn gekoppeld met verminderde endocytotische genexpressie in mens dendritische cellen (DC's), die werden blootgesteld aan de lipofiele common air pollutant benzo [a] pyreen. De colocalization van CD1d en endocytotische marker Lamp1 eiwitten uit duizenden cel beelden met imaging stroom cytometry werd geanalyseerd met behulp van ideeën en ImageJ-Fiji programma's. Talrijke cellulaire beelden met mede gekleurd CD1d en Lamp1 eiwitten waren gevisualiseerd na gating op CD1d+Lamp1+ DCs met behulp van ideeën. De verbeterde CD1d en Lamp1 colocalization bij BaP blootstelling werd verder aangetoond met behulp van thresholded scatterplots, getest met Mander de coëfficiënten voor co gelokaliseerde intensiteit, en uitgezet op basis van het percentage van de medefinanciering gelokaliseerde gebieden met behulp van ImageJ-Fiji. Onze gegevens geven een voordelige instrumentaal en bioinformatic aanpak voor het meten van eiwit colocalization zowel één als populational cellulaire niveau, ter ondersteuning van een verminderde functionele uitkomst van transcriptomic wijziging in verontreinigende stoffen blootgesteld mens DCs.

De lipofiele verontreinigende stof BaP verandert endocytotische gene clusters in menselijke DCs. mens monocyt-afgeleide DCs van elke donor (n = 3) werden geïncubeerd met BaP en gesorteerd voor conventionele DCs, die verder voor RNA extractie en transcriptomic analyse gebruikt werden zoals beschreven . Bij de normalisatie van de genexpressie, werden veranderde genen tussen groepen BaP-blootgesteld en niet-blootgesteld geclusterd volgens de functionele correlatie van differentially uitgedr...

Watch this Scientific Journal Video about Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking at JoVE.com

Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking

Stroom cytometry Imaging biedt een ideale aanpak voor het detecteren van de morfologische en functionele wijziging van cellen op individuele en populational niveau. Verstoorde endocytotische functie voor lipide antigeen presentatie in verontreinigende stoffen blootgesteld menselijke dendritische cellen werd aangetoond met een gecombineerde transcriptomic profilering van genexpressie en morfologische demonstratie van eiwit mensenhandel.

Integreren van Imaging Stroom Cytometry en profilering te evalueren veranderde endocytotische CD1d handel Transcriptomic

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single ...

Deze methoden integreren de volgende generatie sequencing en flow cytometrie beeldvorming analyse. Het kan helpen bij het beantwoorden van interessante vragen, zoals de vraag of sommige fenotypische veranderingen zijn implicate, in plaats van de transcriptoom, vooral in de blootstelling van verontreinigende stoffen omgeving. Het belangrijkste voordeel van deze eenvoudige methode voor ons is dat we het kunnen gebruiken om de colocalisatie van biologisch belangrijke eiwitten te meten, om de resultaten van de belangrijkste differentiële genexpressie op functioneel niveau te interpreteren.De implicaties van deze techniek breiden zich uit tot de diagnose van pathologische en toxicologische uitkomsten. Als een normale imager benadering, forsee heeft de mogelijkheid om genexpressie te verbinden met eiwitfunctie. Over het algemeen, individuen nieuw op deze methode zal worstelen vanwege de hoge technische eisen van de beeldvorming en transcriptomische analyse.Om de menselijke monocyt afgeleide dendritische cel bibliotheek sequentie, eerst laden de volgorde en indexering reagentia op de sequencing biosynthese en indexering reagent racks, respectievelijk, en plaats de rekken in een laboratorium kwaliteit water bad voor een uur, totdat al het ijs is gesmolten, en de reagentia zijn grondig gemengd. Terwijl de reagentia ontdooien, de macht op de sequencer, het aansluiten van de computer op een netwerk station wanneer de Do Not Eject drive verschijnt, en start de sequencer control software. Voeg vervolgens ongeveer 100 milliliter onderhoudswasoplossing toe aan elk van de flessen in het sequencing biosynthese reagensrek en schroef een trechter op elke fles.Voeg ongeveer 12 milliliter onderhoudswasoplossing toe aan elke 15 milliliter conische buis in het indexerende reagensrek en gooi de doppen weg. Laad vervolgens beide rekken op de sequencer. Selecteer Maintenance Wash in de sequencer control software en volg de instructies voor het reinigen van het sequencer vloeistofsysteem.Gebruik een zaklamp om de stroomcel visueel te inspecteren op bellen die door de rijstroken gaan, om ervoor te zorgen dat er geen lekkage is. Wanneer de wasvolgorde is voltooid, opent u het tabblad Reeks en start u een nieuwe run, waarbij de uitvoergegevens naar een netwerkstation worden geleid. Upload een voorbeeldblad voor demultiplexing en voer de juiste reagensgegevens in.Gebruik een gebruikte stroomcel om het systeem te primen, met de sequencing reagentia. Zodra de clustergeneratie is voltooid, verwijdert u de stroomcel. En licht besproeien de cel met water.Veeg de stroomcel droog met lenspapier, gevolgd door een lichte spray met 95% ethanol. Nadat u de stroomcel weer droog hebt afgeveegd, controleert u het oppervlak van de stroomcel tegen het licht om er zeker van te zijn dat deze schoon is, zonder vuil of zoutresten. Wanneer de eerste stap is voltooid, laadt u de geclusterde stroomcel en begint u met de volgorde.De sequence analysis viewer software wordt automatisch gestart. Ongeveer 26 uur later, controleer de volgorde van gegevens kwaliteit via de hoge volgorde controle software, en sequencing analyse view software om de kwaliteit van de gegevens te beoordelen, en voor eventuele problemen oplossen. Vervolgens, wanneer de reeks klaar is, verander de stroomcelpakking en voer een onderhoudswas uit voordat de volgende run begint.Na de stroom cytometrische beeldvorming van de verontreinigende blootgestelde dendritische cellen, open ImageJ Fiji, en voeg de 100 opgeslagen celbeelden voor de niet-blootgestelde en verontreinigende blootgestelde menselijke dendritische cel monster groepen in individuele bestanden volgens de behandelingsgroep. Als u CD1d en Lamp1-colocalisatie binnen de twee populaties wilt analyseren, opent u de 100 samengevoegde celafbeelding met 100 verontreinigende stoffen en selecteert u Afbeeldings-, Kleur- en Gesplitste kanalen om de afbeelding op te splitsen in twee afzonderlijke afbeeldingen met één fluorofofoof per kanaal. Als u een spreidingsplot van de gekoloniseerde pixels wilt maken, selecteert u Analyseren, Colocaliseren en Colocalisatiedrempel en drukt u op Afdrukscherm om de spreidingsplot op te slaan.Als u de colocalisatiecoëfficiënt van de Mander voor elke ééncellulaire afbeelding wilt berekenen, gebruikt u het ovale selectiegereedschap om een afbeelding met één cel in het afbeeldingsbestand met de gesplitste kanalen te selecteren en selecteert u Opnieuw Analyseren, Colocalisatie en Colocalisatiedrempel. Selecteer vervolgens Kanaal 1 in het dialoogvenster dialoog voor het interessegebied en klik op OK. Wanneer de coëfficiënt is berekend voor alle 100 celafbeeldingen, importeert u de resultaten in een geschikte spreadsheet en herhaalt u de analyse voor het niet-belichte celmonster voor controle. Aan de hand van RNA-sequencing en transcriptomische gegevensanalyses werden verschillende belangrijke veranderde genclusters geïdentificeerd, waaronder lipidenmetabolisme en endocytische functies in de aan verontreinigende stoffen blootgestelde DC's.Op individueel celbeeldniveau kunnen HLADR-positieve CD11c-positieve dendritische cellen worden afgesloten, volgens hun CD1d- en Lamp1-coexpressie. Controle niet-blootgestelde dendritische cellen tonen minimale CD1d en Lamp1 eiwitkolonisatie, wat wijst op een basaal niveau van CD1d endocytische handel, en een hoog niveau van oppervlakte-expressie onder fysiologische omstandigheden. Terwijl CD1d wordt bewaard in de late endocytische compartimenten van aan verontreinigende stoffen blootgestelde dendritische cellen, bevestigt het veranderde endocytische genprofielen in deze experimentele celpopulatie.Na het samenvoegen van de afzonderlijke cellulaire afbeeldingen in één afbeeldingsbestand, kunnen de afzonderlijke afbeeldingen worden gesplitst op basis van hun fluorofofexpressie en kan de colocalisatie van de pixelintensiteit tussen de twee kanalen worden gevisualiseerd in een spreidingsplot. De mate van colocalisatie tussen de CD1d en Lamp1 eiwitten in de twee behandelingsgroepen kan vervolgens worden gekwantificeerd met behulp van Mander's coëfficiënten. Als de eiwitintensiteit hetergeen is tussen de gekoloniseerde en niet-gekocaliseerde gebieden, zal de gekocaliseerde intensiteit niet parallel lopen met de colocalized gebieden, daarom is het ook belangrijk om de colocalisatie van de twee eiwitten verder te beoordelen, op basis van de pixelintensiteit.Eenmaal onder de knie, kan de beeldanalyse in twee uur worden voltooid en kan de RNA-sequencing-instelling in drie uur worden voltooid, als elke techniek goed wordt uitgevoerd. Tijdens het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om ervoor te zorgen dat alle reagentia goed zijn geladen in de juiste posities, en dat er geen lekkage in de sequencer. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals micro-RNA, exoom of mastcelsequencing, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over respectievelijk globale microRNA-expressie, genmutatie of DNA-methylatie.Dus na de ontwikkeling zal deze techniek onderzoekers helpen op het gebied van cellulaire beeldanalyse, en de volgende generatie sequencing om het effect van de milieuverontreinigende stof op genexpressie en eiwitfunctie te onderzoeken. Na het bekijken van deze video, moet u een goed begrip van hoe het opzetten van de volgende generatie sequencing, en de imager analyse van eiwit colocalisatie. Vergeet niet dat het werken met een giftige chemische stof in menselijke bloedmonsters zeer gevaarlijk kan zijn.Voorzorgsmaatregelen zoals het gebruik van een chemische rookkap, en persoonlijke beschermingsmiddelen, moeten altijd worden genomen bij het uitvoeren van deze procedures.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Flowcytometrie-analyse van de immuuncellen Binnen Murine aorta

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Menselijk In Vitro Onderdrukking als Screening Tool voor de erkenning van een vroege staat van Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Image-based flowcytometrie Techniek om Veranderingen in Granulocyt Functie Evalueer<em&gt; In Vitro</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

Een eenvoudige en snelle protocol bij niet-enzymatisch distantiëren Verse menselijke weefsels voor de Analyse van Infiltrating Lymfocyten

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting voor Zuivering van plasmacytoïde dendritische cellen van de muis Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Muizen-lymfocyt Labeling door<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-Antibody Receptor targeting voor<em&gt; In Vivo</em&gt; Celverkeer PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Meting van de T-cel alloreactiviteit Met behulp van Imaging flowcytometrie

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Kwalitatieve en kwantitatieve analyse van de immuun SYNAPS in het menselijke systeem met behulp van Imaging Stroom Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Visualiseren van intracellulaire SNARE mensenhandel door fluorescentie levensduur microscopie Imaging

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...