Name: integrate imaging flow cytometry and transcriptomic profiling to evaluate altered endocytic cd1d trafficking
Uploaded: 2018-10-29T13:00:00
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Die Autoren danken Robert Giulitto (Hoxworth Blutzentrale) für menschlichen Blutproben und Dr. Liang Niu für die Normalisierung der Genexpression liest. Wir danken auch Zuschüsse aus dem National Institute of Environmental Health Sciences (ES006096), Zentrum für ökologische Genetik (CEG) Pilotprojekt (SH), National Institute of Allergy and Infectious Diseases (AI115358) (s.h.), Universität Cincinnati University Research Council Award (SH) und Universität von Cincinnati College of Medizin Enhancement Grundfinanzierung (X. Z.).

Menschlichen Protokolle in dieser Studie wurden von der Institutional Review Board von der University of Cincinnati genehmigt und alle Methoden wurden gemäß den einschlägigen Richtlinien und Verordnungen durchgeführt. Die Hoxworth Blutzentrale am Medical Center University of Cincinnati wurden Blutproben von gesunden Spendern entnommen.
1. transkriptomischen Profilierung der Schadstoff ausgesetzt menschliche Monocyte abgeleitet DCs
<ol><li>Insgesamt RNA-Extraktion von BaP-exponierten DCs<...

<ol>
	<li>Roche, P. A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+Processing+and+Presentation+Mechanisms+in+Myeloid+Cells.">Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells.</a> Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MR1+uses+an+endocytic+pathway+to+activate+mucosal-associated+invariant+T+cells.">MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells.</a> The Journal of experimental medicine. 205 (5), 1201-1211 (2008).</li><li>Nakamura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomes+are+specialized+platforms+for+bacterial+sensing+and+NOD2+signalling.">Endosomes are specialized platforms for bacterial sensing and NOD2 signalling.</a> Nature. 509 (7499), 240-244 (2014).</li><li>Blum, J. 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Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).</li><li>Sharma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+endocytic+lipid+antigen+presentation+by+common+lipophilic+environmental+pollutants.">Inhibition of endocytic lipid antigen presentation by common lipophilic environmental pollutants.</a> Science Reports. 7 (1), 2085 (2017).</li><li>Boom, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids.">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> Journal of clinical microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).</li><li>Nachamkin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agilent+2100+bioanalyzer+for+restriction+fragment+length+polymorphism+analysis+of+the+Campylobacter+jejuni+flagellin+gene.">Agilent 2100 bioanalyzer for restriction fragment length polymorphism analysis of the Campylobacter jejuni flagellin gene.</a> Journal of clinical microbiology. 39 (2), 754-757 (2001).</li><li>Kaimal, V., Bardes, E. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+imaging+software+tools.">Biological imaging software tools.</a> Nature. 9 (7), 697-710 (2012).</li><li>Costes, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+and+quantitative+measurement+of+protein-protein+colocalization+in+live+cells.">Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells.</a> Biophysical journal. 86 (6), 3993-4003 (2004).</li></ol>

Funktionale Bestätigung über eine veränderte Gen Weg ist anspruchsvoll, wegen der stark belasteten Genexpression, an denen mehrere Wege und die Schwierigkeit, individuelle und populational Zellaktivitäten zu integrieren. Wir beschäftigten bildgebenden Durchflusszytometrie, speziell Test CD1d Handel in endocytic Fächern. Imaging Durchflusszytometrie integriert die populational Messung der Zellen und die individuelle Demonstration der subzellulären NS1 mehrere Proteine. Konfokale Mikroskopie hat zuvor hohen Auflösu...

Antigenpräsentation umfasst in der Regel intrazelluläre Protein Menschenhandel, die oft mit Morphologische Charakterisierung und phänotypischen Profilierung der antigenpräsentierende Zellen1,2,3 untersucht wurden . Um die Vorteile der Bildgebung und Phänotypisierung Methoden zu integrieren, beschreiben wir eine bildgebende Analyseplattform auf Einzelzelle und Einwohnerzahlen zu einem veränderten Protein NS1 in menschlichen dendritischen Zellen (DCs) zeigen. Im Peptid Antigenpräsentation große Histocompatibility complex (MHC) Klasse I Moleküle binden eine kurze Peptid (8-10 Rückstände) in das endoplasmatische Retikulum konventionellen CD8 aktivieren+ T-Zellen, während MHC-Klasse-II-Moleküle relativ länger binden Peptid (~ 20 Rückstände) in endocytic Fächern für konventionelle CD4 aktivieren+ T Zellen1,4. Im Gegensatz dazu werden Lipid-spezifischen T-Zellen durch CD1 Proteine mit Lipid-Antigenen, die vor allem in endocytic Fächern5,6geladen aktiviert. Lipid Antigenpräsentation erfordert die Versorgung von Lipid-Metaboliten in Lipid Metabolismus7,8,9,10 und das Laden von funktionalen Lipid-Metaboliten auf CD1 Proteine in produziert endocytic Fächer5,6. In diesem Zusammenhang kritisieren verschiedene zelluläre Faktoren modulieren Lipid Antigenpräsentation, vor allem in Umweltexposition von lipophilen Schadstoffen und Erkrankungen des Immunsystems, definiert werden. In dieser Studie verwendeten wir transkriptomischen Analyse, Bild Profilierung und zellulären und populational bildgebende Analyse der menschlichen Monocyte abgeleitet DCs bestimmen das endocytic Protein Menschenhandel zur Lipid Antigenpräsentation in Schadstoff-Exposition. Natürlich kann diese kombinierte Plattform genutzt werden, um Studium der subzellulären Protein Menschenhandel und NS1 in verschiedenen biologischen Prozessen.
Technisch, zeigte Protein subzelluläre Lokalisation in der Regel mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie und statistisch analysiert in einer begrenzten Anzahl von gefundenen Zellen1,2,3,11. Darüber hinaus wurde Durchflusszytometrie weitgehend auf Tor Zell-Populationen mit Co gefärbten Signale von mehreren Proteinen auf einem zellularen Niveau12angewendet; Das fehlen jedoch einer detaillierte Visualisierung der subzellulären Protein NS1. Um umfassende und statistische Analysen der Prozentsatz Protein NS1 Ebene Mobilfunk und der Bevölkerung zu erreichen, integrieren wir imaging Profilierung und Analyse Ansätze bestimmen die Eigenschaften des Proteins NS1 mit biologischen Relevanz. Insbesondere verwenden wir bildgebende Durchflusszytometrie NS1 CD1d und lysosomale verbundenen Membranprotein 1 (Lamp1) erkennen Proteine in dieser Studie. Quantitative Analyse der colocalized Moleküle war bisher schwierig, in einem populational Maßstab durchgeführt werden. In dieser Studie haben wir die ImageJ-Fidschi-Programm, den Anteil an Protein NS1 mit einer großen Anzahl von Co gefärbten Zellen populational und einzelner zellulärer Ebene untersuchen angepasst. Insbesondere haben wir gemessen Co lokalisierten Bereichen, Intensität und populational Größe zu der Schlussfolgerung, dass das CD1d-Protein weitgehend in späten endocytic Abteilen des menschlichen DCs in Exposition gegenüber einem lipophilen Schadstoffen Benzo [a] pyren (BaP)13 beibehalten wurde . Diese kombinierte zelluläre und Bevölkerung bildgebende Analyse zur Verfügung gestellt hoch reproduzierbare, umfassende und statistisch signifikante Ergebnisse der CD1d-Lamp1 NS1 für gehemmt Lipid Antigenpräsentation relevant.
Das Transkriptom des BaP-exponierten menschlichen DCs unterstützt nachdrücklich die Hypothese, dass endocytic Lipidstoffwechsel und CD1d endocytic Menschenhandel in BaP-Exposition beeinträchtigt wurden. Um diese Hypothese zu testen, haben wir bildgebende Durchflusszytometrie um die Bilder der DC Bevölkerung Profil, die mit mehreren Proteinen einschließlich CD1d, endocytic Markierungen und DC-Marker Co gebeizt wurden angewandt. Schließlich wurden Co gefärbten Zellen statistisch analysiert, um den Prozentsatz der Intensität und Bereiche der CD1d und Lamp1 NS1 zu demonstrieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1340px;" width="1340">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Transcriptomics</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td style="width:417px;">HiSeq 2500 v4</td>
			<td style="width:191px;">Illumina HiSeq system</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">ImagingStream X</td>
			<td style="width:448px;">Millipore</td>
			<td>100220</td>
			<td>Imaging flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">mirVana miRNA Isolation Kit</td>
			<td style="width:448px;">Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Total RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agilent RNA 6000 Pico Kit</td>
			<td style="width:448px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Total RNA QC analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler</td>
			<td style="width:448px;">Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>PCR, enzyme reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module&#160;</td>
			<td style="width:448px;">New England Biolab</td>
			<td></td>
			<td>PolyA RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Automated SMARTer Apollo system</td>
			<td style="width:448px;">Takara</td>
			<td></td>
			<td>PolyA RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td style="width:448px;">New England Biolab</td>
			<td></td>
			<td>Library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agencourt AMPure XP magnetic beads</td>
			<td style="width:448px;">Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>DNA purification&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:448px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Library QC, size distribution analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td style="width:448px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Library QC, size distribution analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher)</td>
			<td style="width:448px;">Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Library quantification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NEBNext Library Quant Kit</td>
			<td style="width:448px;">New England Biolab</td>
			<td></td>
			<td>Library quantification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">cBot</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Library cluster generation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot &#8211; HS</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Library cluster generation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">HiSeq 1000</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">TruSeq SBS Kit v3 - HS (50-cycles)</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7)</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td style="width:417px;">L243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5)</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td align="right" style="width:417px;">3.9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Brilliant violet 421</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td style="width:417px;">L161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">PE-anti-mouse IgG2b</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td align="right" style="width:417px;">51.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Alexa Fluor 647 (AF647)</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td style="width:417px;">CD107a(H4A3)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integrate imaging flow cytometry and transcriptomic profiling to evaluate altered endocytic cd1d trafficking

Populational Analysen der morphologischen und funktionellen Veränderung der endocytic Proteine sind aufgrund der Nachfrage der Bilderfassung in einer Einzelzelle Ebene und statistische Bildanalyse auf einem populational Niveau anspruchsvoll. Um diese Schwierigkeit zu überwinden, zum wir bildgebende Durchflusszytometrie und transkriptomischen profiling (RNA-Seq) veränderten subzelluläre Lokalisation des Clusters Differenzierung 1D Protein (CD1d) verbundenen bestimmen mit eingeschränkter endocytic Genexpression in menschlichen Dendritische Zellen (DCs), die die gemeinsame lipophilen ausgesetzt wurden Luft Schadstoff Benzo [a] pyren. Die NS1 CD1d und endocytic Marker Lamp1-Proteine aus Tausenden von Zelle Bilder mit imaging-Durchflusszytometrie wurde mit Ideen und ImageJ-Fidschi analysiert Programme. Zahlreiche zelluläre Bilder mit Co gefärbten CD1d und Lamp1 Proteine wurden nach Anspritzung auf CD1d visualisiert+Lamp1+ DCs mit Ideen. Die verbesserte CD1d und Lamp1 NS1 auf BaP Exposition weiter demonstriert wurde, mit thresholded Scatterplots, getestet mit Mander des Koeffizienten für Co lokalisierte Intensität und geplottet basierend auf dem Prozentsatz von Co lokalisierten Bereichen mit ImageJ-Fidschi. Unsere Daten bieten einen vorteilhaften Instrumental- und bioinformatische Ansatz zur Messung von Protein NS1 auf Einzel- und populational zellulären Ebenen beeinträchtigtes funktionelle Ergebnis transkriptomischen Änderung in Schadstoff-exponierten Menschen unterstützen DCs.

Die lipophile Schadstoff BaP verändert endocytic gen-Cluster in menschlichen DCs. Human Monocyte abgeleitet DCs von jedem Spender (n = 3) wurden mit BaP inkubiert und sortiert für konventionelle DCs, die weiter für RNA-Extraktion und transkriptomischen Analyse wie beschrieben verwendet wurden . Nach der Normalisierung der Genexpression wurden veränderte Gene zwischen BaP-exponierten und nicht-exponierten Gruppen entsprechend der funktionalen Zusammenhang differentiell exprimierten Gen...

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Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking

Durchflusszytometrie Imaging bietet einen idealen Ansatz um die morphologische und funktionelle Veränderung der Zellen auf individuelle und populational Ebene zu erkennen. Gestörten endocytic Funktion für Lipid Antigenpräsentation in Schadstoff-exponierten menschlichen dendritischen Zellen wurde mit einem kombinierten transkriptomischen Profilierung der Genexpression und morphologischen Demonstration des Handels mit Protein nachgewiesen.

Integration von Imaging Durchflusszytometrie und transkriptomischen Profilierung zu veränderten Endocytic CD1d Handel bewerten

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single ...

Diese Methoden integrieren die Sequenzierung der nächsten Generation und die Bildgebungsanalyse der Durchflusszytometrie. Es kann helfen, interessante Fragen zu beantworten, wie z. B. ob einige phänotypische Veränderungen impliziert sind, anstelle des Transkriptoms, vor allem in der Umwelt der Schadstoffbelastung. Der Hauptvorteil dieser einfachen Methode für uns ist, dass wir sie verwenden können, um die Kolokalisierung von biologisch wichtigem Protein zu messen, um die Ergebnisse der wichtigsten Differentialgenexpression auf funktioneller Ebene zu interpretieren.Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Diagnose pathologischer und toxikologischer Ergebnisse. Als normaler Imager-Ansatz hat Forsee die Fähigkeit, genexpression mit der Proteinfunktion zu verbinden. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, aufgrund der hohen technischen Anforderungen der bildgebenden und transkriptomischen Analyse Schwierigkeiten haben.Um die menschliche Monozyten-abgeleitete dendritische Zellbibliothek zu sequenzieren, laden Sie zunächst die Sequenzierungs- und Indexierungsreagenzien auf die Sequenzierungsbiosynthese- bzw. Indexierungsreagenz-Racks und legen Sie die Regale für eine Stunde in ein Laborwasserbad, bis das gesamte Eis geschmolzen ist und die Reagenzien gründlich gemischt werden. Während die Reagenzien auftauen, schalten Sie den Sequenzer ein, schließen Sie den Computer an ein Netzlaufwerk an, wenn das Laufwerk Nicht auswerfen, und starten Sie die Sequenzersteuerungssoftware. Als nächstes fügen Sie etwa 100 Milliliter Wartungswaschlösung zu jeder der Flaschen in der Sequenzierung Biosynthese Reagenz Rack, und schrauben Sie eine Trichterkappe auf jede Flasche.Fügen Sie etwa 12 Milliliter Wartungswaschlösung zu jedem 15 Milliliter konischen Rohr im Indexierungsreagenzgestell hinzu, und entsorgen Sie die Kappen. Dann laden Sie beide Racks auf den Sequenzer. Wählen Sie Maintenance Wash in der Sequenzersteuerungssoftware aus, und befolgen Sie die Anweisungen zur Reinigung des Sequenzerflüssigkeitssystems.Verwenden Sie eine Taschenlampe, um die Durchflusszelle visuell auf Blasen zu untersuchen, die durch die Fahrspuren gehen, um sicherzustellen, dass es keine Leckagen gibt. Wenn die Waschsequenz abgeschlossen ist, öffnen Sie die Registerkarte Sequenz, und starten Sie eine neue Ausführung, um die Ausgabedaten an ein Netzlaufwerk weiterzuleiten. Laden Sie ein Beispielblatt zum Entmultiplexing hoch, und geben Sie die entsprechenden Reagenzinformationen ein.Verwenden Sie eine verwendete Durchflusszelle, um das System mit den Sequenzierungsreagenzien zu grundieren. Sobald die Clustergenerierung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Durchflusszelle. Und die Zelle leicht mit Wasser besprühen.Wischen Sie die Durchflusszelle trocken mit Linsenpapier ab, gefolgt von einem Lichtspray mit 95% Ethanol. Nachdem Sie die Durchflusszelle wieder trocken gewischt haben, überprüfen Sie die Oberfläche der Durchflusszelle mit dem Licht, um sicherzustellen, dass sie sauber ist, ohne Schmutz oder Salzrückstände. Wenn der Hauptschritt abgeschlossen ist, laden Sie die gruppierte Durchflusszelle, und beginnen Sie mit der Sequenzierung.Die Sequenzanalyse-Viewer-Software wird automatisch gestartet. Überwachen Sie etwa 26 Stunden später die Datenqualität der Sequenzierung über die Software für die hohe Sequenzsteuerung und die Analyseansichtssoftware, um die Datenqualität zu bewerten und die Fehlerbehebung zu beheben. Wenn die Sequenz abgeschlossen ist, ändern Sie dann die Durchflusszellendichtung, und führen Sie eine Wartungswäsche durch, bevor Sie mit dem nächsten Durchlauf beginnen.Nach der zytometrischen Bildgebung der schadstoffexponierten dendritischen Zellen öffnen Sie ImageJ Fidschi und verschmelzen Die 100 gespeicherten Zellbilder für die nicht exponierten und schadstoffexponierten menschlichen dendritischen Zellprobengruppen entsprechend der Behandlungsgruppe in einzelnen Dateien. Um CD1d und Lamp1-Kolokalisierung innerhalb der beiden Populationen zu analysieren, öffnen Sie das schadstoffbelichtete 100 zusammengeführte Zellbild, und wählen Sie Bild, Farbe und Split-Kanäle aus, um das Bild in zwei einzelne Bilder mit einem einzelnen Fluorophor pro Kanal aufzuteilen. Um ein Streudiagramm der kolokalisierten Pixel zu erstellen, wählen Sie Analysieren, Kolokalisierung und Colokalisierungsschwellenwert aus, und drücken Sie Druckbildschirm, um das Streudiagramm zu speichern.Um den Kolokalisierungskoeffizienten des Manders für jedes einzelzelluläre Bild zu berechnen, verwenden Sie das ovale Auswahlwerkzeug, um ein Einzelzellenbild in der Bilddatei mit den geteilten Kanälen auszuwählen, und wählen Sie erneut Analyse, Kolokalisierung und Colokalisierungsschwellenwert aus. Wählen Sie dann Kanal 1 aus dem Dialogfeld für die Interessenregion aus, und klicken Sie auf OK. Wenn der Koeffizient für alle 100 Zellbilder berechnet wurde, importieren Sie die Ergebnisse in eine entsprechende Kalkulationstabelle, und wiederholen Sie die Analyse für die nicht verfügbar gemachte Zellenprobe. Mithilfe von RNA-Sequenzierung und transkriptomischen Datenanalysen wurden mehrere wichtige veränderte Gencluster, einschließlich Lipidstoffwechsel und endozytäre Funktionen, in den schadstoffexponierten DCs identifiziert.Auf der individuellen Zellbildebene können HLADR-positive CD11c-positive dendritische Zellen gemäß ihrer CD1d- und Lamp1-Koexpression abgezäut werden. Kontrollieren Sie nicht exponierte dendritische Zellen zeigen minimale CD1d- und Lamp1-Proteinkolokalisierung, was auf einen basalen Gehalt an CD1d-Endozytikerhandel und eine hohe Oberflächenexpression unter physiologischen Bedingungen hinweist. Während CD1d in den späten endozytischen Kompartimenten von schadstoffexponierten dendritischen Zellen aufbewahrt wird, bestätigt sich die samtytischen Genprofile in dieser experimentellen Zellpopulation.Nach dem Zusammenführen der einzelnen Zellbilder in eine einzelne Bilddatei können die einzelnen Bilder entsprechend ihrem Fluorophorausdruck aufgeteilt und die Kolokalisierung der Pixelintensität zwischen den beiden Kanälen in einem Streudiagramm visualisiert werden. Der Grad der Kolokalisierung zwischen den CD1d- und Lamp1-Proteinen in den beiden Behandlungsgruppen kann dann mit Mander-Koeffizienten quantifiziert werden. Wenn die Proteinintensität zwischen den kolokalisierten und nicht-kolokalisierten Bereichen hetergenes ist, wird die kolokalisierte Intensität nicht parallel zu den kolokalisierten Bereichen sein, daher ist es auch wichtig, die Kolokalisierung der beiden Proteine auf der Grundlage der Pixelintensität weiter zu bewerten.Nach der Beherrschung kann die Bildanalyse in zwei Stunden abgeschlossen werden, und die RNA-Sequenzierung kann in drei Stunden abgeschlossen werden, wenn jede Technik ordnungsgemäß durchgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich vorzuvergessen, dass alle Reagenzien ordnungsgemäß in den richtigen Positionen geladen sind und dass es keine Leckage im Sequenzer gibt. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Mikro-RNA, Exom oder Mastzellsequenzierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur globalen Mikro-RNA-Expression, Genmutation bzw. DNA-Methylierung zu beantworten.Nach ihrer Entwicklung wird diese Technik Forschern auf dem Gebiet der zellulären Bildgebungsanalyse und der Sequenzierung der nächsten Generation helfen, die Auswirkungen des Umweltschadstoffs auf die Genexpression und die Proteinfunktion zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Sequenzierung der nächsten Generation und die Imageranalyse der Proteinkolokalisierung einrichten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einem giftigen Schadstoff Chemikalien in menschlichen Blutproben extrem gefährlich sein kann.Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung einer chemischen Dunstabzugshaube und persönliche Schutzausrüstung sollten bei der Durchführung dieser Verfahren immer getroffen werden.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Durchflusszytometrie-Analyse von Immunzellen innerhalb Murine Aorten

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Mensch In Vitro Suppression als Screening-Tool für die Anerkennung von Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Bildbasierte Durchflusszytometrie Technik zur Veränderung der Granulozyten-Funktion auswerten<em&gt; In-vitro-</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

Eine einfache und schnelle Protokoll zum Nicht enzymatisch Dissociate Frische menschlichen Geweben zur Analyse der infiltrierenden Lymphozyten

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Reinigung von Plasmazytoide dendritischer Zellen aus dem Knochenmark der Maus

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Kennzeichnung von<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-Antikörper-Rezeptor-Targeting für<em&gt; In Vivo</em&gt; Zellhandel von PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Die Messung der T-Zell-Alloreaktivität Mit Imaging Durchflusszytometrie

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Qualitative und Quantitative Analyse der immun Synapse im menschlichen System mit Hilfe von Imaging Durchflusszytometrie

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Visualisierung von intrazellulären SNARE Menschenhandel durch Fluoreszenz Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...