Name: integrate imaging flow cytometry and transcriptomic profiling to evaluate altered endocytic cd1d trafficking
Uploaded: 2018-10-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking at JoVE.com

המחברים, רוברט Giulitto (Hoxworth דם מרכז) תודה דגימות דם אדם וקורא ד ר Niu ליאנג על נירמול של ביטוי גנים. אנו מודים גם מענק תמיכה מ נבחרת המכון למדעי בריאות הסביבה (ES006096), המרכז גנטיקה סביבתיים (CEG) הפרויקט טייס (תרגום), המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (AI115358) (תרגום), אוניברסיטת פרס המועצה למחקר של אוניברסיטת סינסינטי (תרגום), האוניברסיטה של סינסינטי המכללה של רפואה הליבה שיפור המימון (אקס Z.).

פרוטוקולים האנושי במחקר זה אושרו על-ידי ועדת הבדיקה המוסדי באוניברסיטת סינסינטי, כל השיטות בוצעו בהתאם ההנחיות הרלוונטיות והתקנות. דגימות דם מתורמים בריאים התקבלו ממרכז דם Hoxworth במרכז הרפואי של אוניברסיטת סינסינטי.
1. Transcriptomic פרופיל החשופים מזהמים בדרור נגזר מונוציט אנושי</p...

<ol>
	<li>Roche, P. A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+Processing+and+Presentation+Mechanisms+in+Myeloid+Cells.">Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells.</a> Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MR1+uses+an+endocytic+pathway+to+activate+mucosal-associated+invariant+T+cells.">MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells.</a> The Journal of experimental medicine. 205 (5), 1201-1211 (2008).</li><li>Nakamura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomes+are+specialized+platforms+for+bacterial+sensing+and+NOD2+signalling.">Endosomes are specialized platforms for bacterial sensing and NOD2 signalling.</a> Nature. 509 (7499), 240-244 (2014).</li><li>Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+antigen+processing.">Pathways of antigen processing.</a> Annual review of immunology. 31, 443-473 (2013).</li><li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+natural+killer+T+cells:+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions.">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li><li>Zajonc, D. M., Kronenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1+mediated+T+cell+recognition+of+glycolipids.">CD1 mediated T cell recognition of glycolipids.</a> Current opinion in structural biology. 17 (5), 521-529 (2007).</li><li>Cox, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+cellular+lipids+bound+to+human+CD1d+molecules.">Determination of cellular lipids bound to human CD1d molecules.</a> PloS one. 4 (5), e5325 (2009).</li><li>Yuan, W., Kang, S. J., Evans, J. E., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+lipid+ligands+associated+with+human+CD1d+targeted+to+different+subcellular+compartments.">Natural lipid ligands associated with human CD1d targeted to different subcellular compartments.</a> Journal of immunology. 182 (8), 4784-4791 (2009).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+deoxyceramides+and+diacylglycerols+as+CD1b+scaffold+lipids+among+diverse+groove-blocking+lipids+of+the+human+CD1+system.">Discovery of deoxyceramides and diacylglycerols as CD1b scaffold lipids among diverse groove-blocking lipids of the human CD1 system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19335-19340 (2011).</li><li>de Jong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1a-autoreactive+T+cells+recognize+natural+skin+oils+that+function+as+headless+antigens.">CD1a-autoreactive T cells recognize natural skin oils that function as headless antigens.</a> Nature. 15 (2), 177-185 (2014).</li><li>Trombetta, E. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+antigen+processing+in+vitro+and+in+vivo.">Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo.</a> Annual review of immunology. 23, 975-1028 (2005).</li><li>Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+immunophenotyping+for+the+Human+Immunology+Project.">Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project.</a> Nature reviews. Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).</li><li>Sharma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+endocytic+lipid+antigen+presentation+by+common+lipophilic+environmental+pollutants.">Inhibition of endocytic lipid antigen presentation by common lipophilic environmental pollutants.</a> Science Reports. 7 (1), 2085 (2017).</li><li>Boom, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids.">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> Journal of clinical microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).</li><li>Nachamkin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agilent+2100+bioanalyzer+for+restriction+fragment+length+polymorphism+analysis+of+the+Campylobacter+jejuni+flagellin+gene.">Agilent 2100 bioanalyzer for restriction fragment length polymorphism analysis of the Campylobacter jejuni flagellin gene.</a> Journal of clinical microbiology. 39 (2), 754-757 (2001).</li><li>Kaimal, V., Bardes, E. E., Tabar, S. C., Jegga, A. G., Aronow, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToppCluster:+a+multiple+gene+list+feature+analyzer+for+comparative+enrichment+clustering+and+network-based+dissection+of+biological+systems.">ToppCluster: a multiple gene list feature analyzer for comparative enrichment clustering and network-based dissection of biological systems.</a> Nucleic acids research. 38 (Web Server issue), W96-W102 (2010).</li><li>Bauer-Mehren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+genomic+information+with+biological+networks+using+Cytoscape).">Integration of genomic information with biological networks using Cytoscape).</a> Methods in molecular biology. 1021, 37-61 (2013).</li><li>Cline, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+biological+networks+and+gene+expression+data+using+Cytoscape.">Integration of biological networks and gene expression data using Cytoscape.</a> Nature protocols. 2 (10), 2366-2382 (2007).</li><li>Huang, S., Moody, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-unrestricted+T+cells+in+the+human+CD1+system.">Donor-unrestricted T cells in the human CD1 system.</a> Immunogenetics. 68 (8), 577-596 (2016).</li><li>Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Innate-Like+T+Cells+in+Tuberculosis.">Targeting Innate-Like T Cells in Tuberculosis.</a> Frontiers in immunology. 7, 594 (2016).</li><li>Moody, D. B., Porcelli, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pathways+of+CD1+antigen+presentation.">Intracellular pathways of CD1 antigen presentation.</a> Nature reviews. Immunology. 3 (1), 11-22 (2003).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Diard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+cooperative+virulence+by+the+expression+of+an+avirulent+phenotype.">Stabilization of cooperative virulence by the expression of an avirulent phenotype.</a> Nature. 494 (7437), 353-356 (2013).</li><li>Bader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proliferative+and+mature+beta-cells+in+the+islets+of+Langerhans.">Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans.</a> Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).</li><li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+imaging+software+tools.">Biological imaging software tools.</a> Nature. 9 (7), 697-710 (2012).</li><li>Costes, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+and+quantitative+measurement+of+protein-protein+colocalization+in+live+cells.">Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells.</a> Biophysical journal. 86 (6), 3993-4003 (2004).</li></ol>

אישור פונקציונלי נתיב הגנים שינו הוא מאתגר, בגלל התבטאות גנים מושפעים נרחב המערבות מספר מסלולים ואת הקושי לשלב בודדים ופעילויות הסלולר populational. אנחנו מועסקים מיכשור הדמיה במיוחד במבחן CD1d סחר בתאים endocytic. הדמיה cytometry זרימה משלבת את המדידה populational של תאים ההפגנה בודדים של colocalization subcellular של מס?...

אנטיגן המצגת כוללת בדרך כלל חלבונים תאיים סחר, אשר לעיתים קרובות נחקר באמצעות אפיון מורפולוגי, יצירת פרופילים פנוטיפי של אנטיגן הצגת תאים1,2,3 . כדי לשלב את היתרונות של דימות ופעולות phenotyping, נתאר פלטפורמה ניתוח ההדמיה על תא בודד והן רמות האוכלוסיה להפגין colocalization שינו חלבון בתאים דנדריטים אנושי (Dc). במצגת אנטיגן פפטיד, הגדולות histocompatibility מורכבים (MHC) מחלקה אני מולקולות לאגד פפטיד קצר (8-10 שאריות) ב רשתית תוך-פלזמית כדי להפעיל CD8 קונבנציונלי+ T תאים, בעוד MHC class II מולקולות לאגד ארוך יחסית של פפטיד (שאריות ~ 20) בתאים endocytic להפעלת CD4 קונבנציונלי+ T תאים1,4. לעומת זאת, תאי T ספציפי השומנים מופעלים על ידי CD1 חלבונים עם אנטיגנים השומנים נטען בעיקר בתוך תאי endocytic5,6. מצגת אנטיגן השומנים דורש את האספקה של השומנים המטבוליטים המיוצר השומנים חילוף החומרים7,8,9,10 ו הטעינה של השומנים פונקציונלי מטבוליטים CD1 חלבונים ב- תאים endocytic5,6. בהקשר זה, גורמים שונים הסלולר להתכוונן המצגת אנטיגן השומנים, במיוחד, החשיפה הסביבתית של מזהמים lipophilic, כשל חיסוני, הם קריטיים כדי להיות מוגדר. במחקר זה, השתמשנו transcriptomic ניתוח תמונת פרופיל, תאית populational הדמיה וניתוח של האדם נגזר מונוציט DCs לקביעת חלבון endocytic הסחר תורם למצגת אנטיגן השומנים בחשיפה מזהמים. בהחלט, ניתן להחיל פלטפורמה משולבת זו ללמוד חלבון subcellular סחר, colocalization בתהליכים ביולוגיים שונים.
טכנית, לוקליזציה חלבון subcellular הודגם בדרך כלל באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית וניתח סטטיסטית במספר מוגבל של תאים שזוהו1,2,3,11. יתר על כן, cytometry זרימה בהרחבה הוחלה על שער תא אוכלוסיות עם אותות מוכתם משותפת של מספר חלבונים הסלולר ברמה12; עם זאת, זה חסרה ויזואליזציה מפורטת של חלבון subcellular colocalization. כדי להשיג ניתוחים סטטיסטיים ומקיף של אחוז חלבון colocalization ברמות הסלולר והן באוכלוסייה, אנו משלבים את הדמיה תיעוד וניתוח גישות כדי לקבוע את התכונות של חלבון colocalization עם ביולוגית רלוונטיות. באופן ספציפי, אנו משתמשים מיכשור הדמיה כדי לזהות את colocalization של CD1d ו חלבון ממברנלי lysosomal-הקשורים 1 (Lamp1) חלבונים במחקר זה. ניתוח כמותי של מולקולות colocalized היה בעבר קשה לביצוע בקנה מידה populational. במחקר זה, שינינו את התוכנית ImageJ-פיג'י לבחון את אחוז חלבון colocalization עם מספר גדול של תאים שותף מוכתם ברמה התאית הן populational והן בודדים. באופן ספציפי, מדדנו אזורי משותף לשפות אחרות, העוצמה וגודל populational כדי לתמוך במסקנה כי החלבון CD1d נשמר בעיקר בתאים endocytic מאוחר של בקרי תחום אנושי חשיפה benzo מזהם lipophilic [א] pyrene (BaP)13 . זה המשולבים סלולארי והאוכלוסיה הדמיה ניתוח סיפק תוצאות מאוד לשחזור מקיף, סטטיסטית CD1d-Lamp1 colocalization הרלוונטי למצגת אנטיגן השומנים עכבות.
Transcriptome החשופים BaP בדרור האנושי נתמך בחוזקה את ההשערה כי endocytic מטבולי וסחר CD1d endocytic היו ליקויי BaP בחשיפה. כדי לבדוק השערה זו, אנחנו מוחלים מיכשור הדמיה לפרופיל תמונות מאוכלוסיית DC משותפת היו מוכתמים חלבונים מרובים כולל CD1d endocytic סמנים, סמנים DC. לבסוף, תאים שותף מוכתם נותחו סטטיסטית כדי להדגים את האחוז של עוצמת ותחומי CD1d ו Lamp1 colocalization.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1340px;" width="1340">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Transcriptomics</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td style="width:417px;">HiSeq 2500 v4</td>
			<td style="width:191px;">Illumina HiSeq system</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">ImagingStream X</td>
			<td style="width:448px;">Millipore</td>
			<td>100220</td>
			<td>Imaging flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">mirVana miRNA Isolation Kit</td>
			<td style="width:448px;">Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Total RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agilent RNA 6000 Pico Kit</td>
			<td style="width:448px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Total RNA QC analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler</td>
			<td style="width:448px;">Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>PCR, enzyme reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module&#160;</td>
			<td style="width:448px;">New England Biolab</td>
			<td></td>
			<td>PolyA RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Automated SMARTer Apollo system</td>
			<td style="width:448px;">Takara</td>
			<td></td>
			<td>PolyA RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td style="width:448px;">New England Biolab</td>
			<td></td>
			<td>Library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agencourt AMPure XP magnetic beads</td>
			<td style="width:448px;">Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>DNA purification&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:448px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Library QC, size distribution analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td style="width:448px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Library QC, size distribution analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher)</td>
			<td style="width:448px;">Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Library quantification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NEBNext Library Quant Kit</td>
			<td style="width:448px;">New England Biolab</td>
			<td></td>
			<td>Library quantification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">cBot</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Library cluster generation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot &#8211; HS</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Library cluster generation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">HiSeq 1000</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">TruSeq SBS Kit v3 - HS (50-cycles)</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7)</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td style="width:417px;">L243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5)</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td align="right" style="width:417px;">3.9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Brilliant violet 421</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td style="width:417px;">L161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">PE-anti-mouse IgG2b</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td align="right" style="width:417px;">51.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Alexa Fluor 647 (AF647)</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td style="width:417px;">CD107a(H4A3)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integrate imaging flow cytometry and transcriptomic profiling to evaluate altered endocytic cd1d trafficking

ניתוח populational של שינוי מורפולוגי ופונקציונליים של חלבונים endocytic הם מאתגרים עקב הדרישה של לכידת תמונה-ניתוח תמונה ברמה וסטטיסטיים תא בודד ברמה populational. כדי להתגבר על הקושי הזה, השתמשנו הדמיה cytometry זרימה, transcriptomic פרופיל (RNA-seq) כדי לקבוע שונה לוקליזציה subcellular של האשכול של בידול 1d חלבון (CD1d) הקשורים עם ביטוי גנים endocytic לקוי-אנוש תאים דנדריטים (Dc), אשר נחשפו המשותף lipophilic אוויר מזהם benzo pyrene [א]. Colocalization של CD1d וחלבונים סמן endocytic Lamp1 מתוך אלפי תמונות תא שנתפסו עם הדמיה cytometry זרימה נותחו באמצעות רעיונות ו- ImageJ-פיג'י תוכניות. תמונות הסלולר רבים עם שותף מוכתם חלבונים CD1d ו Lamp1 היו דמיינו לאחר gating על CD1d+Lamp1+ DCs באמצעות רעיונות. Colocalization CD1d ו Lamp1 משופרת על BaP חשיפה נוספת הדגימו באמצעות thresholded scatterplots, נבדק עם המקדמים של Mander עבור עוצמת משותפת לשפות אחרות, המותווה מבוסס על האחוז של אזורי משותף לשפות אחרות באמצעות ImageJ-פיג'י. הנתונים שלנו לספק גישה פלייבקים, bioinformatic יתרון למדוד חלבון colocalization ברמות יחיד והן populational הסלולר, תומך תוצאה מליקוי תפקודי של שינוי transcriptomic של האדם חשוף מזהמים בקרי קבוצת מחשבים.

Lipophilic מזהמים BaP הפיצולים אשכולות גנים endocytic ב DCs נגזר מונוציט DCs. האדם האנושי של כל תורם (n = 3) היו מודגרות עם BaP וממוינות עבור בקרי התחום קונבנציונאלי, אשר שימשו בהמשך RNA החילוץ transcriptomic וניתוח כמתואר . על הנורמליזציה של ביטוי גנים, גנים שונה בין הקבוצות החשופים BaP, שאינו חשוף ה?...

Watch this Scientific Journal Video about Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking at JoVE.com

Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking

הדמיה cytometry זרימה מספקת גישה אידיאלי כדי לזהות את שינוי מורפולוגי ופונקציונליים של תאים ברמות הפרט והן populational. הפונקציה endocytic שיבשו למצגת אנטיגן השומנים ב החשופים מזהם את האדם תאים דנדריטים הודגם עם transcriptomic בשילוב פרופיל של ביטוי גנים, הפגנה מורפולוגי של חלבון סחר בבני אדם.

המשלבים Cytometry זרימה הדמיה Transcriptomic פרופיל כדי להעריך שינו CD1d Endocytic סחר

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single ...

שיטות אלה משלבות ניתוח דימות רצף וזרימה של הדור הבא. זה יכול לעזור לענות על שאלות מעניינות, כמו אם כמה שינויים פנוטיפיים הם מעורבים, במקום transcriptome, במיוחד בסביבת החשיפה מזהמים. היתרון העיקרי של שיטה פשוטה זו עבורנו הוא שאנחנו יכולים להשתמש בו כדי למדוד את colocalization של חלבון חשוב ביולוגית, כדי לפרש את התוצאות של ביטוי גנים דיפרנציאלי מפתח ברמה תפקודית.ההשלכות של טכניקה זו משתרעות לקראת אבחון של תוצאות פתולוגיות וטוקסיקולוגיות. כגישה תמונה נורמלית, לחזות יש את היכולת לחבר ביטוי גנים לתפקוד החלבון. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו בגלל הדרישות הטכניות הגבוהות של ההדמיה והניתוח התמלולי.כדי לרצף את ספריית התאים הדנדריטיים המופקת מהמונותה האנושית, טען תחילה את הרצף והאינדקס של הריגנטים על גבי הביוסינתזה הרציפה והאינדקס של מתלים רייגנטים, בהתאמה, והצב את המדפים באמבט מים בדרגת מעבדה למשך שעה אחת, עד שכל הקרח נמס, והריגנטים מעורבבים ביסודיות. בזמן שהרייגנטים מפשרים, הפעל את הרצף, חבר את המחשב לכונן רשת כאשר כונן אל תפלט מופיע וה הפעל את תוכנת בקרת הרצף. לאחר מכן, הוסיפו כ-100 מיליליטר של תוסף לשטיפת תחזוקה לכל אחד מהבקבוקים במתלה הריג'נטים של רצף הביוסינתזה, והברגו מכסה משפך על כל בקבוק.הוסף כ 12 מיליליטר של פתרון לשטוף תחזוקה לכל צינור חרוט 15 מיליליטר בארון הריג'נט אינדקס, ולהשליך את הכובעים. לאחר מכן טען את שני המדפים על הרצף. בחר שטיפת תחזוקה בתוכנת בקרת הרצף ובצע את ההוראות לניקוי מערכת נוזלי הרצף.השתמש בפנס כדי לבדוק באופן חזותי את תא הזרימה עבור בועות העוברות בנתיבים, כדי לוודא שאין דליפה. לאחר סיום רצף הכביסה, פתח את הכרטיסיה רצף והתחל הפעלה חדשה, כשהוא מכוון את נתוני הפלט לכונן רשת. העלה גיליון לדוגמה עבור demultiplexing והזן את מידע הריג'נט המתאים.השתמש בתא זרימה משומש כדי להפוך את המערכת לראשית, עם רייגנטים רצף. לאחר השלמת יצירת האשכול, הסר את תא הזרימה. ותרסס קלות את התא במים.נגב את תא הזרימה יבש עם נייר עדשה, ואחריו תרסיס אור עם 95% אתנול. לאחר ניגוב תא הזרימה יבש שוב, לבדוק את פני השטח של תא הזרימה נגד האור כדי לוודא שהוא נקי, ללא פסולת או שאריות מלח. בסיום השלב הראשי, טען את תא הזרימה המקובץ באשכולות והתחל ברצף.תוכנת מציג ניתוח הרצף תופעל באופן אוטומטי. כ-26 שעות לאחר מכן, נטר את איכות נתוני הרצף באמצעות תוכנת בקרת הרצף הגבוהה, ותוכנות תצוגת ניתוח רצף כדי להעריך את איכות הנתונים, וכל פתרון בעיות. לאחר מכן, כאשר הרצף הוא סיים, לשנות את אטם תא זרימה, ולבצע לשטוף תחזוקה לפני תחילת הריצה הבאה.לאחר הדמיה ציטומטרית זרימה של התאים הדנדריטיים החשופים למזהמים, פתח את ImageJ Fiji, ומזג את 100 תמונות התאים ה שנשמרו עבור קבוצות מדגמי התאים הדנדריטיים האנושיים שאינם חשופים ומזהמים לקבצים בודדים על פי קבוצת הטיפול. כדי לנתח את CD1d ואת Colocalization Lamp1 בתוך שתי האוכלוסיות, פתח את תמונת התא הממוזגת 100 שנחשפה למזהמים ובחר תמונה, צבע וערוצי פיצול כדי לפצל את התמונה לשתי תמונות בודדות באמצעות פלואורופור יחיד לכל ערוץ. ליצירת תרשים פיזור של הפיקסלים שעברו קולוקליזציה, בחרו 'נתח', 'קולוקליזציה' ו'סף קולוקליזציה' והקש 'הדפס מסך' לשמירת תרשים פיזור.לחישוב מקדם הקולוקאליזציה של מנדר עבור כל תמונה חד-תאית, השתמשו בכלי הבחירה אליפסה לבחירת תמונה של תא בודד בקובץ התמונה עם הערוצים המפוצלים, ובחרו שוב 'נתח', 'קולוקליזציה' ו'סף קולוקליזציה'. לאחר מכן בחרו ערוץ 1 מתיבת הדו-שיח של אזור העניין ולחצו על הלחצן 'אשר'. כאשר המקדם חושב עבור כל 100 תמונות התאים, יבא את התוצאות לגיליון אלקטרוני מתאים וחזור על הניתוח עבור דגימת התא הלא חשופה של הפקד. באמצעות רצף RNA וניתוחי נתונים תמלוליים, מספר אשכולות גנים גדולים שהשתנו, כולל חילוף החומרים של השומנים ופונקציות אנדוציטיות זוהו במקרי ה- DCs החשופים למזהמים.ברמת תמונת התא הבודדת, תאים דנדריטיים חיוביים של HLADR CD11c יכולים להיות מגודרים, על פי הדיכוי הדו-קומתי CD1d ו- Lamp1 שלהם. תאים דנדריטיים שאינם חשופים לשליטה מדגימים קולוקליזציה מינימלית של חלבון CD1d ו- Lamp1, המציינת רמה בסיסית של סחר אנדוציטי CD1D, ורמה גבוהה של ביטוי פני השטח בתנאים פיזיולוגיים. בעוד CD1d נשמר בתאים האנדוקטיים המאוחרים של תאים דנדריטיים חשופים מזהמים, המאשר פרופילי גנים אנדוציטיים שהשתנו באוכלוסיית תאים ניסיונית זו.לאחר מיזוג התמונות הסלולריות הבודדות לקובץ תמונה יחיד, ניתן לפצל את התמונות הבודדות בהתאם לביטוי הפלואורופור שלהן, ו ניתן לדמיין את הקולוקליזציה של עוצמת הפיקסל בין שני הערוצים בעלילת פיזור. לאחר מכן ניתן לכמת את מידת הקולוקליזציה בין החלבונים CD1d ו- Lamp1 בשתי קבוצות הטיפול באמצעות מקדמי מנדר. אם עוצמת החלבון היא הטרוגנית בין האזורים colocalized ולא colocalized, עוצמת colocalized לא יהיה מקביל לאזורים colocalized, ולכן חשוב גם להעריך עוד יותר את colocalization של שני חלבונים, בהתבסס על עוצמת הפיקסל.לאחר השליטה, ניתן להשלים את ניתוח התמונה תוך שעתיים, ואת ההתקנה רצף RNA ניתן להשלים בתוך שלוש שעות, אם כל טכניקה מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי כל reagents נטענים כראוי בעמדות הנכונות, כי אין דליפה ברצף. בעקבות הליך זה, שיטות אחרות, כמו מיקרו RNA, exome, או רצף תא התורן יכול להתבצע כדי לענות על שאלות נוספות על ביטוי מיקרו RNA גלובלי, מוטציה בגנים, או מתילציה DNA, בהתאמה.אז אחרי ההתפתחות שלה, טכניקה זו תסייע לחוקרים בתחום ניתוח ההדמיה התאית, ואת רצף הדור הבא כדי לחקור את ההשפעה של המזהם הסביבתי על ביטוי גנים ותפקוד החלבון. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך להגדיר את רצף הדור הבא, ואת ניתוח imager של קולוקליזציה חלבון. אל תשכח שעבודה עם כימיקלים מזהמים רעילים בדגימות דם אנושיות יכולה להיות מסוכנת ביותר.אמצעי זהירות כגון שימוש ברדס אדים כימיים, וציוד מגן אישי, תמיד יש לנקוט בעת ביצוע הליכים אלה.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

ניתוח תזרים cytometry של תאים חיסוניים בתוך Aortas Murine

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

אנושי במבחנה דיכוי ככלי מיון עבור הכרה של מדינת מוקדם של חוסר איזון החיסון

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

טכניקת cytometry הזרימה מבוססת תמונה כדי להעריך את השינויים בפונקצית granulocyte<em&gt; במבחנה</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

פרוטוקול פשוט ומהיר לללא אנזימי רקמות אנושיות טריות לנתק לניתוח להחדרה לימפוציטים

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

מיון תא מופעל קרינה עבור טיהור של תאי דנדריטים Plasmacytoid ממח עצם העכבר

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Murine לימפוציטים תיוג ידי<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-נוגדן קולטן מיקוד עבור<em&gt; In vivo</em&gt; סחר Cell על ידי PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

מדידת T Cell Alloreactivity שימוש cytometry זרימה הדמיה

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

ניתוחים כמותיים של הסינפסה המערכת החיסונית בגוף האדם באמצעות הדמיה Cytometry זרימה

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

להמחיש מוקש תאיים סחר על-ידי קרינה פלואורסצנטית שלמים הדמיה במיקרוסקופ

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...