Name: integrate imaging flow cytometry and transcriptomic profiling to evaluate altered endocytic cd1d trafficking
Uploaded: 2018-10-29T13:00:00
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Gli autori ringraziano Robert Giulitto (centro di sangue Hoxworth) per campioni di sangue umano e legge Dr. Liang Niu per la normalizzazione dell'espressione genica. Ringraziamo anche sovvenzioni dal National Institute of Environmental Health Sciences (ES006096), Center for progetto pilota ambientale genetica (CEG) (S.H.), Istituto nazionale di allergie e malattie infettive (AI115358) (S.H.), Università di Cincinnati University Research Council award (S.H.) e Università di Cincinnati College di medicina Enhancement finanziamento di base (X. Z.).

Protocolli di umani in questo studio sono stati approvati dalla Institutional Review Board dell'Università di Cincinnati e tutti i metodi sono stati eseguiti in conformità con le direttive e i regolamenti. I campioni di sangue da donatori sani sono stati ottenuti dal centro di sangue Hoxworth presso l'Università di Cincinnati Medical Center.
1. Transcrittomica profilatura di esposti a inquinanti umano DCs monocito-derivato
<ol><li>Estrazione di RNA totale dei DCs BaP-esposti<ol>
<li>Diffe...

<ol>
	<li>Roche, P. A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+Processing+and+Presentation+Mechanisms+in+Myeloid+Cells.">Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells.</a> Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MR1+uses+an+endocytic+pathway+to+activate+mucosal-associated+invariant+T+cells.">MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells.</a> The Journal of experimental medicine. 205 (5), 1201-1211 (2008).</li><li>Nakamura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomes+are+specialized+platforms+for+bacterial+sensing+and+NOD2+signalling.">Endosomes are specialized platforms for bacterial sensing and NOD2 signalling.</a> Nature. 509 (7499), 240-244 (2014).</li><li>Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+antigen+processing.">Pathways of antigen processing.</a> Annual review of immunology. 31, 443-473 (2013).</li><li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+natural+killer+T+cells:+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions.">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li><li>Zajonc, D. M., Kronenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1+mediated+T+cell+recognition+of+glycolipids.">CD1 mediated T cell recognition of glycolipids.</a> Current opinion in structural biology. 17 (5), 521-529 (2007).</li><li>Cox, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+cellular+lipids+bound+to+human+CD1d+molecules.">Determination of cellular lipids bound to human CD1d molecules.</a> PloS one. 4 (5), e5325 (2009).</li><li>Yuan, W., Kang, S. J., Evans, J. E., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+lipid+ligands+associated+with+human+CD1d+targeted+to+different+subcellular+compartments.">Natural lipid ligands associated with human CD1d targeted to different subcellular compartments.</a> Journal of immunology. 182 (8), 4784-4791 (2009).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+deoxyceramides+and+diacylglycerols+as+CD1b+scaffold+lipids+among+diverse+groove-blocking+lipids+of+the+human+CD1+system.">Discovery of deoxyceramides and diacylglycerols as CD1b scaffold lipids among diverse groove-blocking lipids of the human CD1 system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19335-19340 (2011).</li><li>de Jong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1a-autoreactive+T+cells+recognize+natural+skin+oils+that+function+as+headless+antigens.">CD1a-autoreactive T cells recognize natural skin oils that function as headless antigens.</a> Nature. 15 (2), 177-185 (2014).</li><li>Trombetta, E. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+antigen+processing+in+vitro+and+in+vivo.">Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo.</a> Annual review of immunology. 23, 975-1028 (2005).</li><li>Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+immunophenotyping+for+the+Human+Immunology+Project.">Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project.</a> Nature reviews. Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).</li><li>Sharma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+endocytic+lipid+antigen+presentation+by+common+lipophilic+environmental+pollutants.">Inhibition of endocytic lipid antigen presentation by common lipophilic environmental pollutants.</a> Science Reports. 7 (1), 2085 (2017).</li><li>Boom, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids.">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> Journal of clinical microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).</li><li>Nachamkin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agilent+2100+bioanalyzer+for+restriction+fragment+length+polymorphism+analysis+of+the+Campylobacter+jejuni+flagellin+gene.">Agilent 2100 bioanalyzer for restriction fragment length polymorphism analysis of the Campylobacter jejuni flagellin gene.</a> Journal of clinical microbiology. 39 (2), 754-757 (2001).</li><li>Kaimal, V., Bardes, E. E., Tabar, S. C., Jegga, A. G., Aronow, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToppCluster:+a+multiple+gene+list+feature+analyzer+for+comparative+enrichment+clustering+and+network-based+dissection+of+biological+systems.">ToppCluster: a multiple gene list feature analyzer for comparative enrichment clustering and network-based dissection of biological systems.</a> Nucleic acids research. 38 (Web Server issue), W96-W102 (2010).</li><li>Bauer-Mehren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+genomic+information+with+biological+networks+using+Cytoscape).">Integration of genomic information with biological networks using Cytoscape).</a> Methods in molecular biology. 1021, 37-61 (2013).</li><li>Cline, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+biological+networks+and+gene+expression+data+using+Cytoscape.">Integration of biological networks and gene expression data using Cytoscape.</a> Nature protocols. 2 (10), 2366-2382 (2007).</li><li>Huang, S., Moody, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-unrestricted+T+cells+in+the+human+CD1+system.">Donor-unrestricted T cells in the human CD1 system.</a> Immunogenetics. 68 (8), 577-596 (2016).</li><li>Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Innate-Like+T+Cells+in+Tuberculosis.">Targeting Innate-Like T Cells in Tuberculosis.</a> Frontiers in immunology. 7, 594 (2016).</li><li>Moody, D. B., Porcelli, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pathways+of+CD1+antigen+presentation.">Intracellular pathways of CD1 antigen presentation.</a> Nature reviews. Immunology. 3 (1), 11-22 (2003).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Diard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+cooperative+virulence+by+the+expression+of+an+avirulent+phenotype.">Stabilization of cooperative virulence by the expression of an avirulent phenotype.</a> Nature. 494 (7437), 353-356 (2013).</li><li>Bader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proliferative+and+mature+beta-cells+in+the+islets+of+Langerhans.">Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans.</a> Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).</li><li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+imaging+software+tools.">Biological imaging software tools.</a> Nature. 9 (7), 697-710 (2012).</li><li>Costes, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+and+quantitative+measurement+of+protein-protein+colocalization+in+live+cells.">Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells.</a> Biophysical journal. 86 (6), 3993-4003 (2004).</li></ol>

Conferma funzionale di una via di gene alterato è impegnativo, a causa di espressione genica ampiamente incastrato che coinvolgono le vie multiple e la difficoltà di integrare attività cellulari individuali e popolazionale. Abbiamo impiegato imaging flusso cytometry in particolare prova CD1d traffico endocitico scomparti. Citometria a flusso di imaging integra la misura popolazionale delle cellule e la dimostrazione individuo di colocalizzazione subcellulare delle proteine multiple. Microscopia confocale ha fornito pr...

Presentazione dell'antigene coinvolge tipicamente la proteina intracellulare di traffico, che è stato spesso studiata mediante caratterizzazione morfologica e profilatura fenotipica dell'antigene che presenta le cellule1,2,3 . Per integrare i vantaggi dell'imaging e metodi phenotyping, descriviamo una imaging piattaforma di analisi a livello di popolazione per dimostrare una colocalizzazione di proteina alterata in cellule dendritiche (DCs) e singola cella. Nella presentazione dell'antigene del peptide, complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe I molecole legare un peptide breve (8-10 residui) nel reticolo endoplasmatico per attivare CD8 convenzionale+ T cellule, mentre le molecole di MHC classe II legano una relativamente più lungo peptide (~ 20 residui) in compartimenti endocitosi per attivare convenzionale CD4 cellule+ T1,4. Al contrario, le cellule T del lipido-specifiche vengono attivate dalle proteine CD1 con antigeni lipidici caricati principalmente in compartimenti endocitico5,6. Presentazione dell'antigene del lipido richiede la fornitura dei metaboliti lipidici prodotti nel metabolismo dei lipidi7,8,9,10 e il caricamento dei metaboliti lipidici funzionale alle proteine CD1 in compartimenti endocitico5,6. In questo contesto, vari fattori cellulari modulando la presentazione dell'antigene del lipido, specialmente in esposizione ambientale delle sostanze inquinanti lipofilici e disturbi del sistema immunitario, sono fondamentali per essere definito. In questo studio, abbiamo usato analisi trascrittomica, immagine di profilatura e analisi di imaging cellulare e popolazionali di DCs monocito-derivato umano per determinare il traffico di proteine endocitiche contribuendo alla presentazione dell'antigene del lipido in esposizione della sostanza inquinante. Certamente, questa piattaforma combinata può essere applicata a studiare traffico sottocellulare della proteina e la colocalizzazione in diversi processi biologici.
Tecnicamente, la localizzazione sottocellulare della proteina solitamente è stata dimostrata usando la microscopia confocal e analizzati statisticamente in un numero limitato di cellule rilevato1,2,3,11. Inoltre, citometria a flusso è stato ampiamente applicato a popolazioni di cellule di cancello con segnali co-macchiati delle proteine multiple a un livello cellulare12; Tuttavia, questo non dispone di una visualizzazione dettagliata di colocalizzazione subcellulare della proteina. Per ottenere analisi complete e statistiche di colocalizzazione di proteina percentuale a livello cellulare e popolazione, incorporiamo approcci di profilatura e di analisi per determinare le caratteristiche di colocalizzazione di proteina con biologico di imaging rilevanza. In particolare, utilizziamo imaging citometria a flusso per rilevare la colocalizzazione di CD1d e proteine di membrana lisosomiale-collegata 1 (Lamp1) proteine in questo studio. Analisi quantitativa delle molecole colocalized era precedentemente difficile da eseguirsi alla scala popolazionale. In questo studio, abbiamo adattato il programma ImageJ-Fiji per esaminare la percentuale di colocalizzazione di proteine con un gran numero di cellule co-marcate a livello cellulare sia popolazionale e individuali. In particolare, abbiamo misurato zone co-localizzate, intensità e dimensione popolazionale a sostegno della conclusione che la proteina CD1d in gran parte è stata conservata in compartimenti tardi endocitosi di DCs umano nell'esposizione a un inquinante lipofilico benzo [a] pirene (BaP)13 . Questa popolazione analisi di imaging e combinato cellulare fornito risultati altamente riproducibili, completi e statisticamente significative di CD1d-Lamp1 colocalizzazione pertinenti alla presentazione dell'antigene lipidica inibita.
Il trascrittoma di BaP-esposti umano DCs fortemente sostenuto l'ipotesi che il metabolismo lipidico endocitosi e CD1d endocitico traffico sono stati alterati in BaP esposizione. Per verificare questa ipotesi, abbiamo applicato imaging flusso cytometry per profilare le immagini della popolazione DC che co-sono state macchiate con più proteine tra cui CD1d, endocitosi marcatori e DC. Infine, le cellule co-macchiate sono state analizzate statisticamente per dimostrare la percentuale di intensità e aree di colocalizzazione CD1d e Lamp1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1340px;" width="1340">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Transcriptomics</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td style="width:417px;">HiSeq 2500 v4</td>
			<td style="width:191px;">Illumina HiSeq system</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">ImagingStream X</td>
			<td style="width:448px;">Millipore</td>
			<td>100220</td>
			<td>Imaging flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">mirVana miRNA Isolation Kit</td>
			<td style="width:448px;">Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Total RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agilent RNA 6000 Pico Kit</td>
			<td style="width:448px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Total RNA QC analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler</td>
			<td style="width:448px;">Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>PCR, enzyme reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module&#160;</td>
			<td style="width:448px;">New England Biolab</td>
			<td></td>
			<td>PolyA RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Automated SMARTer Apollo system</td>
			<td style="width:448px;">Takara</td>
			<td></td>
			<td>PolyA RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td style="width:448px;">New England Biolab</td>
			<td></td>
			<td>Library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agencourt AMPure XP magnetic beads</td>
			<td style="width:448px;">Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>DNA purification&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:448px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Library QC, size distribution analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td style="width:448px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Library QC, size distribution analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher)</td>
			<td style="width:448px;">Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Library quantification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NEBNext Library Quant Kit</td>
			<td style="width:448px;">New England Biolab</td>
			<td></td>
			<td>Library quantification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">cBot</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Library cluster generation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot &#8211; HS</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Library cluster generation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">HiSeq 1000</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">TruSeq SBS Kit v3 - HS (50-cycles)</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7)</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td style="width:417px;">L243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5)</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td align="right" style="width:417px;">3.9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Brilliant violet 421</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td style="width:417px;">L161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">PE-anti-mouse IgG2b</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td align="right" style="width:417px;">51.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Alexa Fluor 647 (AF647)</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td style="width:417px;">CD107a(H4A3)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integrate imaging flow cytometry and transcriptomic profiling to evaluate altered endocytic cd1d trafficking

Popolazionale analisi dell'alterazione morfologica e funzionale delle proteine endocitiche sono difficili a causa della richiesta di acquisizione di immagini ad un'analisi di livello e Statistiche immagine singola cella a livello popolazionale. Per superare questa difficoltà, abbiamo usato imaging citometria a flusso e trascrittomica profilatura (RNA-seq) per determinare alterata localizzazione subcellulare del cluster di differenziazione 1d proteina (CD1d) connessa con l'espressione di gene endocitico compromessa in umani le cellule dendritiche (DCs), che sono stati esposti al comune lipofilico aria inquinante benzo pirene [a]. La colocalizzazione di CD1d e proteine endocitiche marker Lamp1 da migliaia di cellule immagini catturate con imaging citometria a flusso è stata analizzata utilizzando idee e ImageJ-Fiji programmi. Numerose immagini cellulare con co-macchiato CD1d e Lamp1 proteine sono state visualizzate dopo gating su CD1d+Lamp1+ DCs utilizzando idee. La colocalizzazione di CD1d e Lamp1 avanzata su BaP esposizione è stata ulteriormente dimostrata utilizzando con soglia scatterplot, testato con coefficienti di Mander per intensità co-localizzati e tracciati basato sulla percentuale di aree co-localizzate utilizzando ImageJ-Fiji. I nostri dati forniscono un approccio strumentale e bioinformatica vantaggioso per misurare la colocalizzazione di proteina a livello cellulare sia singolo che popolazionale, sostenendo un risultato funzionale alterato di trascrittomica alterazione in umani esposti a inquinanti Controller di dominio.

L'inquinante lipofilico BaP altera cluster genici endocitosi in umano DCs. Human monocito-derivate DCs da ciascun donatore (n = 3) sono stati incubati con BaP e ordinati per DCs convenzionali, che più ulteriormente sono stati utilizzati per l'analisi di estrazione e trascrittomica RNA come descritto . Al momento la normalizzazione dell'espressione genica, geni alterati tra gruppi BaP-esposti e non esposti sono stati raggruppati secondo la correlazione funzionale dei geni differenzialment...

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Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking

Citometria a flusso di imaging fornisce un approccio ideale per rilevare l'alterazione morfologica e funzionale delle cellule a livello individuale e popolazionale. Funzione endocitico interrotte per la presentazione dell'antigene del lipido in cellule dendritiche umane esposti a inquinanti è stata dimostrata con un' Transcrittomica combinato del profilo di espressione genica e morfologiche dimostrazione di traffico della proteina.

Integrare la citometria a flusso di Imaging e trascrittomica profilatura per valutare alterata CD1d endocitico traffico

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single ...

Questi metodi integrano il sequenziamento di nuova generazione e l'analisi dell'imaging citometrico del flusso. Può aiutare a rispondere a domande interessanti, come se alcune alterazioni fenotipiche siano implicate, invece del trascritoma, specialmente nell'ambiente di esposizione degli inquinanti. Il vantaggio principale di questo semplice metodo per noi è che possiamo usarlo per misurare la colocalizzazione di proteine biologicamente importanti, per interpretare i risultati dell'espressione genica differenziale chiave a livello funzionale.Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la diagnosi di esiti patologici e tossicologici. Come normale approccio imager, forsee ha la capacità di collegare l'espressione genica alla funzione proteica. Generalmente, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà a causa delle elevate esigenze tecniche dell'imaging e dell'analisi trascrittamica.Per sequenziare la libreria cellulare dendritica derivata dal monocita umano, caricare prima i reagenti di sequenziamento e indicizzazione sulla biosintesi di sequenziamento e indicizzare i rack dei reagenti, rispettivamente, e posizionare i rack in un bagno d'acqua di grado laboratorio per un'ora, fino a quando tutto il ghiaccio si è sciolto e i reagenti vengono mescolati accuratamente. Mentre i reagenti si stanno scongelando, accensione del sequencer, collegamento del computer a un'unità di rete quando viene visualizzata l'unità Do Not Eject e avvio del software di controllo sequencer. Successivamente, aggiungere circa 100 millilitri di soluzione di lavaggio di manutenzione a ciascuna delle bottiglie nel rack del reagente della biosintesi di sequenziamento e avvitare un tappo a imbuto su ogni bottiglia.Aggiungere circa 12 millilitri di soluzione di lavaggio di manutenzione a ciascun tubo conico da 15 millilitri nel rack del reagente di indicizzazione e scartare i tappi. Quindi caricare entrambi i rack sul sequencer. Selezionate Lavaggio manutenzione (Maintenance Wash) all'interno del software di controllo del sequencer e seguite le istruzioni per la pulizia del sistema di fluidi sequenziatore.Utilizzare una torcia elettrica per ispezionare visivamente la cella di flusso alla ricerca di bolle che attraversano le corsie, per assicurarsi che non vi siano perdite. Al termine della sequenza di lavaggio, aprire la scheda Sequenza e avviare una nuova esecuzione, indirizzando i dati di output a un'unità di rete. Caricare un foglio di esempio per la demultiplexing e immettere le informazioni di reagente appropriate.Utilizzare una cella di flusso usata per innescare il sistema, con i reagenti di sequenziamento. Una volta completata la generazione del cluster, rimuovere la cella di flusso. E spruzzare leggermente la cella con acqua.Asciugare la cella di flusso con carta lente, seguita da uno spray leggero con 95% di etanolo. Dopo aver asciugato nuovamente la cella di flusso, controllare la superficie della cella di flusso rispetto alla luce per assicurarsi che sia pulita, senza detriti o residui di sale. Al termine del passaggio principale, caricare la cella di flusso del cluster e iniziare la sequenza.Il software di visualizzazione dell'analisi delle sequenze verrà avviato automaticamente. Circa 26 ore dopo, monitorare la qualità dei dati di sequenziamento tramite il software di controllo ad alta sequenza e il software di visualizzazione dell'analisi di sequenziamento per valutare la qualità dei dati e per qualsiasi risoluzione dei problemi. Quindi, al termine della sequenza, modificare la guarnizione della cella di flusso ed eseguire un lavaggio di manutenzione prima di iniziare l'esecuzione successiva.Dopo l'imaging citometrico del flusso delle cellule dendritiche esposte agli inquinanti, apri ImageJ Fiji e unisci le 100 immagini cellulari salvate per i gruppi di campioni di cellule dendritiche umane non esposte ed esposte agli inquinanti in singoli file in base al gruppo di trattamento. Per analizzare la colocalizzazione di CD1d e Lamp1 all'interno delle due popolazioni, aprite l'immagine di cella unita 100 esposta all'inquinante e selezionate Immagine, Colore e Canali divisi per dividere l'immagine in due singole immagini con un singolo fluoroforo per canale. Per creare un grafico a dispersione dei pixel colocalizzati, selezionate Analizza, Colocalizzazione e Soglia di colocalizzazione e premete Stamp per salvare il grafico a dispersione.Per calcolare il coefficiente di colocalizzazione del Mander per ogni immagine a singolo cellulare, usate lo strumento di selezione ovale per selezionare un'immagine a cella singola nel file di immagine con i canali divisi e selezionate nuovamente Analizza, Colocalizzazione e Soglia di colocalizzazione. Quindi selezionare Canale 1 dalla finestra di dialogo per l'area di interesse e fare clic su OK. Quando il coefficiente è stato calcolato per tutte le 100 immagini di cella, importare i risultati in un foglio di calcolo appropriato e ripetere l'analisi per il campione di celle non esposte del controllo. Utilizzando il sequenziamento dell'RNA e le analisi dei dati trascriomici, diversi importanti cluster genici alterati, tra cui il metabolismo lipidico e le funzioni endocitiche, sono stati identificati nei TC esposti agli inquinanti.A livello di singola immagine cellulare, le cellule dendritiche positive CD11c HLADR possono essere gated, secondo la loro coespressione CD1d e Lamp1. Le cellule dendritiche non esposte di controllo dimostrano una colocalizzazione minima delle proteine CD1d e Lamp1, indicando un livello basale di traffico endocitico CD1d e un alto livello di espressione superficiale in condizioni fisiologiche. Mentre il CD1d viene conservato nei compartimenti endocitici tardivi delle cellule dendritiche esposte agli inquinanti, confermando profili genico endocitici alterati in questa popolazione cellulare sperimentale.Dopo aver unito le singole immagini cellulari in un singolo file di immagine, le singole immagini possono essere divise in base alla loro espressione di fluoroforo e la colocalizzazione dell'intensità dei pixel tra i due canali può essere visualizzato in un grafico a dispersione. Il grado di colocalizzazione tra le proteine CD1d e Lamp1 nei due gruppi di trattamento può quindi essere quantificato utilizzando i coefficienti di Mander. Se l'intensità proteica è eterogenea tra le aree colocalizzate e non colocalizzate, l'intensità colocalizzato non sarà parallela alle aree colocalizzate, quindi è anche importante valutare ulteriormente la colocalizzazione delle due proteine, in base all'intensità dei pixel.Una volta padroneggiata, l'analisi delle immagini può essere completata in due ore e la configurazione del sequenziamento dell'RNA può essere completata in tre ore, se ogni tecnica viene eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di assicurarsi che tutti i reagenti siano caricati correttamente nelle posizioni corrette e che non vi siano perdite nel sequencer. Seguendo questa procedura, altri metodi, come il micro RNA, l'esoma o il sequenziamento delle mastociti possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande sull'espressione globale del micro RNA, sulla mutazione genica o sulla metilazione del DNA, rispettivamente.Quindi, dopo il suo sviluppo, questa tecnica aiuterà i ricercatori nel campo dell'analisi dell'imaging cellulare, e il sequenziamento di prossima generazione per esplorare l'effetto dell'inquinante ambientale sull'espressione genica e sulla funzione proteica. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come impostare il sequenziamento di nuova generazione e l'analisi dell'imager della colocalizzazione delle proteine. Non dimenticare che lavorare con sostanze chimiche inquinanti tossiche nei campioni di sangue umano può essere estremamente pericoloso.Nell'eseguire queste procedure devono sempre essere prese precauzioni quali l'uso di una cappa aspirante chimica e di dispositivi di protezione individuale.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Analisi Citometria a flusso di cellule immunitarie all&#39;interno aorte Murine

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Ricerca

Immunologia e infezioni

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Umano In Vitro</emSoppressione> come strumento di screening per il riconoscimento di uno Stato precoce di squilibrio immunitario

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