Name: integrate imaging flow cytometry and transcriptomic profiling to evaluate altered endocytic cd1d trafficking
Uploaded: 2018-10-29T13:00:00
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著者はヒトの血液サンプルのロバート Giulitto (Hoxworth 血液センター) を感謝し、博士梁ニュウ遺伝子発現の正常化のための読み取り。また助成金サポートから、国立環境衛生研究所 (ES006096) に感謝し、環境遺伝学 (CEG) パイロット プロジェクト (件名標目等)、国立研究所のアレルギー ・感染症 (AI115358) のセンター (s. h.) の大学シンシナティ大学研究評議会賞 (件名標目等) は、大学のシンシナティ大学の医学コア強化資金 (X. Z)。

本研究では人間のプロトコルは、シンシナティ大学の制度上の審査委員会によって承認された、すべてのメソッドが関連するガイドラインと規則に従って行われました。健康なドナーから血液サンプルは、シンシナティ大学医療センターの Hoxworth の血液センターから得られました。
1. トランスクリプトームのひと単球由来の汚染物質にさらされた Dc のプロファイリング</...

<ol>
	<li>Roche, P. A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+Processing+and+Presentation+Mechanisms+in+Myeloid+Cells.">Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells.</a> Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MR1+uses+an+endocytic+pathway+to+activate+mucosal-associated+invariant+T+cells.">MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells.</a> The Journal of experimental medicine. 205 (5), 1201-1211 (2008).</li><li>Nakamura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomes+are+specialized+platforms+for+bacterial+sensing+and+NOD2+signalling.">Endosomes are specialized platforms for bacterial sensing and NOD2 signalling.</a> Nature. 509 (7499), 240-244 (2014).</li><li>Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+antigen+processing.">Pathways of antigen processing.</a> Annual review of immunology. 31, 443-473 (2013).</li><li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+natural+killer+T+cells:+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions.">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li><li>Zajonc, D. M., Kronenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1+mediated+T+cell+recognition+of+glycolipids.">CD1 mediated T cell recognition of glycolipids.</a> Current opinion in structural biology. 17 (5), 521-529 (2007).</li><li>Cox, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+cellular+lipids+bound+to+human+CD1d+molecules.">Determination of cellular lipids bound to human CD1d molecules.</a> PloS one. 4 (5), e5325 (2009).</li><li>Yuan, W., Kang, S. J., Evans, J. E., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+lipid+ligands+associated+with+human+CD1d+targeted+to+different+subcellular+compartments.">Natural lipid ligands associated with human CD1d targeted to different subcellular compartments.</a> Journal of immunology. 182 (8), 4784-4791 (2009).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+deoxyceramides+and+diacylglycerols+as+CD1b+scaffold+lipids+among+diverse+groove-blocking+lipids+of+the+human+CD1+system.">Discovery of deoxyceramides and diacylglycerols as CD1b scaffold lipids among diverse groove-blocking lipids of the human CD1 system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19335-19340 (2011).</li><li>de Jong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1a-autoreactive+T+cells+recognize+natural+skin+oils+that+function+as+headless+antigens.">CD1a-autoreactive T cells recognize natural skin oils that function as headless antigens.</a> Nature. 15 (2), 177-185 (2014).</li><li>Trombetta, E. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+antigen+processing+in+vitro+and+in+vivo.">Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo.</a> Annual review of immunology. 23, 975-1028 (2005).</li><li>Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+immunophenotyping+for+the+Human+Immunology+Project.">Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project.</a> Nature reviews. Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).</li><li>Sharma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+endocytic+lipid+antigen+presentation+by+common+lipophilic+environmental+pollutants.">Inhibition of endocytic lipid antigen presentation by common lipophilic environmental pollutants.</a> Science Reports. 7 (1), 2085 (2017).</li><li>Boom, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids.">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> Journal of clinical microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).</li><li>Nachamkin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agilent+2100+bioanalyzer+for+restriction+fragment+length+polymorphism+analysis+of+the+Campylobacter+jejuni+flagellin+gene.">Agilent 2100 bioanalyzer for restriction fragment length polymorphism analysis of the Campylobacter jejuni flagellin gene.</a> Journal of clinical microbiology. 39 (2), 754-757 (2001).</li><li>Kaimal, V., Bardes, E. E., Tabar, S. C., Jegga, A. G., Aronow, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToppCluster:+a+multiple+gene+list+feature+analyzer+for+comparative+enrichment+clustering+and+network-based+dissection+of+biological+systems.">ToppCluster: a multiple gene list feature analyzer for comparative enrichment clustering and network-based dissection of biological systems.</a> Nucleic acids research. 38 (Web Server issue), W96-W102 (2010).</li><li>Bauer-Mehren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+genomic+information+with+biological+networks+using+Cytoscape).">Integration of genomic information with biological networks using Cytoscape).</a> Methods in molecular biology. 1021, 37-61 (2013).</li><li>Cline, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+biological+networks+and+gene+expression+data+using+Cytoscape.">Integration of biological networks and gene expression data using Cytoscape.</a> Nature protocols. 2 (10), 2366-2382 (2007).</li><li>Huang, S., Moody, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-unrestricted+T+cells+in+the+human+CD1+system.">Donor-unrestricted T cells in the human CD1 system.</a> Immunogenetics. 68 (8), 577-596 (2016).</li><li>Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Innate-Like+T+Cells+in+Tuberculosis.">Targeting Innate-Like T Cells in Tuberculosis.</a> Frontiers in immunology. 7, 594 (2016).</li><li>Moody, D. B., Porcelli, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pathways+of+CD1+antigen+presentation.">Intracellular pathways of CD1 antigen presentation.</a> Nature reviews. Immunology. 3 (1), 11-22 (2003).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Diard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+cooperative+virulence+by+the+expression+of+an+avirulent+phenotype.">Stabilization of cooperative virulence by the expression of an avirulent phenotype.</a> Nature. 494 (7437), 353-356 (2013).</li><li>Bader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proliferative+and+mature+beta-cells+in+the+islets+of+Langerhans.">Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans.</a> Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).</li><li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+imaging+software+tools.">Biological imaging software tools.</a> Nature. 9 (7), 697-710 (2012).</li><li>Costes, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+and+quantitative+measurement+of+protein-protein+colocalization+in+live+cells.">Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells.</a> Biophysical journal. 86 (6), 3993-4003 (2004).</li></ol>

複数の経路と個々 と個体群の細胞活動を統合する難しさを含む広く影響を受けた遺伝子発現のため、変更された遺伝子経路の機能確認は困難です。特にテスト CD1d エンドサイトーシスのコンパートメントに人身売買にイメージング フローサイトメトリーを採用しました。フローサイトメトリーをイメージングには、細胞の変化の測定、複数のタンパク質の細胞内局在の共存の個別デモンス?...

抗原提示は通常多くの場合形態的特性と抗原提示細胞1,2,3 の表現型プロファイリングを使用して検討されているが、人身売買、細胞内のタンパク質を含む.イメージングと表現方法の利点を統合するには、単一のセルでひと樹状細胞 (Dc) で変更されたタンパク質の共局在を示す人口レベルのイメージング解析プラットフォームをについて説明します。ペプチド抗原提示で主要組織適合複合体 (MHC) クラス I の分子従来 CD8 をアクティブにする小胞体の短いペプチド (8-10 残基) をバインド+ T 細胞、MHC クラス II 分子結合比較的長い間従来の CD4 をアクティブにエンドサイトーシスのコンパートメントにおけるペプチド (~ 20 残基)+ T 細胞1,4。対照的に、脂質特異的 T 細胞はエンドサイトーシス コンパートメント5,6を中心に読み込まれる脂質抗原と CD1 の蛋白質によってアクティブ化されます。脂質抗原提示が脂質代謝脂質代謝7,8,9,10と CD1 の蛋白質代謝産物の機能性脂質のロードの物の供給を必要とします。エンドサイトーシス コンパートメント5,6。この文脈では、脂質抗原提示、特に脂溶性の汚染物質と免疫疾患の環境の露出の調節細胞要因を定義する重要です。本研究では汚染物質の暴露で脂質抗原提示に貢献してエンドサイトーシス蛋白質の売買を決定するためのトランスクリプトーム解析、イメージ プロファイル、およびひと単球由来の Dc の細胞および個体群のイメージング解析を使いました。確かに、この組み合わせのプラットフォームは、細胞内の蛋白質の売買と異なる生物学的プロセスの共存を勉強に適用できます。
技術的には、共焦点顕微鏡を用いて、統計的に検出された細胞1,2,3,11の限られた数の分析、蛋白質の細胞レベル下のローカリゼーション通常示されました。また、フローサイトメトリーは広く細胞レベル12; 複数のタンパク質の共同染色信号ゲート細胞集団に適用されています。しかし、これは細胞内の蛋白質の共存の詳細な可視化を欠いています。生物的蛋白質ハラーゼの機能を決定するためのプロファイルと分析アプローチをイメージングを取り入れる割合タンパク質共存携帯および人口レベルでの包括的かつ統計的分析を達成するために関連性。CD1d およびリソソーム膜蛋白質 1 (Lamp1) の共存を検出するイメージング フローサイトメトリーを用いて具体的には、本研究ではタンパク質。コードして, 分子の定量解析が難しかった以前いついての規模で演奏されます。本研究で我々 はいついて、個々 の細胞レベルで共同染色細胞数が多いタンパク質ハラーゼの割合を調べるための ImageJ フィジー プログラムを適応しました。具体的には、CD1d タンパク質が、親油性の汚染物質ベンゾ [a] ピレン (BaP)13 にさらされる人間の Dc の後半のエンドサイトーシス コンパートメントで保持された主結論を支持する人口サイズ、強度、共局在領域を測定しました。.この複合携帯と画像解析の人口抑制脂質抗原提示に関連する CD1d Lamp1 共存の再現性の高い、包括的、かつ統計的に有意な結果を提供しました。
BaP 公開人間 Dc のトランスクリプトームは強くエンドサイトーシス脂質代謝と CD1d エンドサイトーシス人身売買された BaP 露出で損なわれること仮説をサポートしました。この仮説をテストするため CD1d、エンドサイトーシスのマーカー、および DC マーカーを含む複数のタンパク質を染色共同 DC 人口の画像をプロフィールにイメージング フローサイトメトリーを適用されます。最後に、共同染色細胞は強度の割合と CD1d と Lamp1 共存のエリアを示す統計的に分析しました。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1340px;" width="1340">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Transcriptomics</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td style="width:417px;">HiSeq 2500 v4</td>
			<td style="width:191px;">Illumina HiSeq system</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">ImagingStream X</td>
			<td style="width:448px;">Millipore</td>
			<td>100220</td>
			<td>Imaging flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">mirVana miRNA Isolation Kit</td>
			<td style="width:448px;">Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Total RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agilent RNA 6000 Pico Kit</td>
			<td style="width:448px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Total RNA QC analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler</td>
			<td style="width:448px;">Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>PCR, enzyme reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module&#160;</td>
			<td style="width:448px;">New England Biolab</td>
			<td></td>
			<td>PolyA RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Automated SMARTer Apollo system</td>
			<td style="width:448px;">Takara</td>
			<td></td>
			<td>PolyA RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td style="width:448px;">New England Biolab</td>
			<td></td>
			<td>Library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agencourt AMPure XP magnetic beads</td>
			<td style="width:448px;">Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>DNA purification&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:448px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Library QC, size distribution analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td style="width:448px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Library QC, size distribution analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher)</td>
			<td style="width:448px;">Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Library quantification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NEBNext Library Quant Kit</td>
			<td style="width:448px;">New England Biolab</td>
			<td></td>
			<td>Library quantification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">cBot</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Library cluster generation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot &#8211; HS</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Library cluster generation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">HiSeq 1000</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">TruSeq SBS Kit v3 - HS (50-cycles)</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7)</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td style="width:417px;">L243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5)</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td align="right" style="width:417px;">3.9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Brilliant violet 421</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td style="width:417px;">L161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">PE-anti-mouse IgG2b</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td align="right" style="width:417px;">51.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Alexa Fluor 647 (AF647)</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td style="width:417px;">CD107a(H4A3)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integrate imaging flow cytometry and transcriptomic profiling to evaluate altered endocytic cd1d trafficking

エンドサイトーシスの蛋白質の形態学的、機能的変化の個体群解析いついてレベルで単一細胞レベルで統計画像解析画像キャプチャの需要のために挑戦しています。この困難を克服するためとを使ってイメージング フローサイトメトリー トランスクリプトーム (RNA シーケンス) をプロファイリング分化 1 d タンパク質 (CD1d) のクラスターの関連付けられている細胞内局在性変化を決定する人間の障害エンドサイトーシス遺伝子発現と脂溶性の共通にさらされた樹状細胞 (Dc)、空気汚染物質ベンゾ ピレン []。CD1d とフローサイトメトリーをイメージングを用いた細胞画像の数千からエンドサイトーシス マーカー Lamp1 蛋白質の共存は、アイデアや ImageJ フィジーを用いて解析したプログラム。共同染色 CD1d と Lamp1 蛋白質と多数の携帯電話画像 CD1d のゲーティング後, 可視化された+Lamp1+の Dc のアイデアを使用しています。BaP 露出マンダーの共局在の強度係数テストどちらられる散布図を使用して、プロットに示されたさらに強化された CD1d と Lamp1 の共存は、ImageJ フィジーを用いた共局在の面積の割合に基づいています。私たちのデータが汚染物質にさらされた人間のトランスクリプトーム変質の障害の機能的予後をサポート、シングル、いついての細胞レベルでのタンパク質共存を測定する有利なインストゥルメンタルとバイオ情報アプローチを提供します。Dc。

脂溶性の汚染物質 BaP 変更各ドナーから人間人間 dc 単球由来 dcs エンドサイトーシス遺伝子群 (n = 3)、さらに前述の RNA 抽出とトランスクリプトーム解析に使用された従来の Dc の bap が培養され.遺伝子発現の正常化に BaP 公開し、非曝露群の間の変えられた遺伝子は、発現遺伝子の機能的相関によるとクラスター化されました。関連の携帯電話経路の解析のための Toppcl...

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Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking

フローサイトメトリーをイメージング細胞個々 および地方レベルでの形態学的、機能的変化を検出するための理想的なアプローチを提供します。中断エンドサイトーシス汚染物質にさらされたひと樹状細胞における脂質抗原提示機能を遺伝子発現と蛋白質の売買の形態のデモの複合トランスクリプトームのプロファイルを示した。

イメージング フローサイトメトリーとトランスクリプトーム変質エンドサイトーシス CD1d の人身売買を評価するプロファイリングを統合します。

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single ...

これらの方法は、次世代シーケンシングとフローサイトメトリーイメージング解析を統合します。これは、特に汚染物質暴露環境において、トランスクリプトームの代わりに、いくつかの表記の変化が含まれているかどうかのような興味深い質問に答えるのに役立ちます。この単純な方法の主な利点は、生物学的に重要なタンパク質の共局在化を測定し、主要な遺伝子発現の結果を機能レベルで解釈できることです。この技術の意味は、病理学的および毒物学的結果の診断に及ぶ。通常のイメージャーアプローチとして、forseeは、遺伝子発現をタンパク質機能に接続する能力を有する。一般的に、この方法に新しい個人は、イメージングおよびトランスクリプト分析の高い技術的要求のために苦労します。ヒト単球由来樹状細胞ライブラリーを配列するには、まずシーケンシング合成試薬およびインデックス用試薬ラックにシーケンシングおよびインデックス化試薬を積み込み、すべての氷が溶けるまで1時間、実験室グレードの水浴にラックを入れ、試薬を完全に混合します。試薬が解凍されている間、シーケンサの電源を入れ、取り出す操作のドライブが表示されたらコンピュータをネットワークドライブに接続し、シーケンサ制御ソフトウェアを起動します。次に、シーケンシング生合成試薬ラックの各ボトルに約100ミリリットルのメンテナンス洗浄液を加え、各ボトルに漏斗キャップをねじ込みます。約12ミリリットルのメンテナンス洗浄液を、インデックス用試薬ラックの15ミリリットル円錐形チューブに加え、キャップを廃棄します。次に、両方のラックをシーケンサーに積み込みます。シーケンサ制御ソフトウェアで「メンテナンスウォッシュ」を選択し、シーケンサ流体システムのクリーニング手順に従います。フラッシュライトを使用して、フローセルの車線を通過する気泡を視覚的に検査し、漏れがないことを確認します。ウォッシュシーケンスが終了したら、[シーケンス]タブを開き、新しい実行を開始して、出力データをネットワークドライブに送ります。デマルチプレクシング用のサンプルシートをアップロードし、適切な試薬情報を入力します。使用フローセルを使用して、シーケンシング試薬を使用してシステムをプライミングします。クラスターの生成が完了したら、フロー セルを削除します。そして、軽く水で細胞をスプレー.フローセルをレンズペーパーで拭き、続いて95%エタノールの軽いスプレーを吹き付けます。フローセルを再び乾かした後、フローセルの表面を光に照らしてチェックし、残骸や塩残渣がなくても清潔であることを確認します。プライムステップが終了したら、クラスター化されたフローセルをロードし、シーケンスを開始します。シーケンス解析ビューアソフトウェアが自動的に起動します。約26時間後、高シーケンス制御ソフトウェアを介してシーケンシングデータ品質を監視し、シーケンシング分析ビューソフトウェアを使用してデータ品質を評価し、トラブルシューティングを行います。そして、シーケンスが終了したら、フローセルガスケットを変更し、次の実行を開始する前にメンテナンス洗浄を行う。汚染物質曝露樹状細胞のフローサイトメトリックイメージング後、ImageJ Fijiを開き、非暴露および汚染物質にさらされたヒト樹状細胞サンプル群の保存された100個の保存された細胞画像を、治療群に従って個々のファイルにマージする。CD1d と 2 つの集団内の Lamp1 の共局在化を分析するには、汚染物質にさらされた 100 個の結合セルイメージを開き、[画像]、[色]、[スプリット チャネル] を選択して、画像をチャンネルごとに 1 つのフルオロフォアで 2 つの個別の画像に分割します。共局化されたピクセルの散布図を作成するには、[分析]、[共局化]、[共局化のしきい値] を選択し、[印刷画面] を押して散布図を保存します。単一セルラー画像ごとに Mander の共局在係数を計算するには、楕円選択ツールを使用して、分割チャネルを含むイメージ ファイル上の単一セル画像を選択し、分析、共局在化、および共局在化のしきい値を再度選択します。次に、対象地域のダイアログ ボックスから [チャンネル 1] を選択し、[OK] をクリックします。100 個のセルイメージすべてに対して係数が計算されたら、結果を適切なスプレッドシートにインポートし、コントロールの非公開セル サンプルの分析を繰り返します。RNAシーケンシングおよび転写データ解析を用いて、汚染物質暴露DCにおいて脂質代謝および内視鏡機能を含むいくつかの主要な遺伝子クラスターが同定された。個々の細胞画像レベルでは、HLADR陽性CD11c陽性樹状細胞は、CD1dおよびLamp1共発現に従ってゲートすることができる。コントロール非露出樹状細胞は、CD1dおよびLamp1タンパク質共局在化を最小限に抑え、CD1dの内視鏡的人身売買の基底レベル、および生理学的条件下での高レベルの表面発現を示す。CD1dは汚染物質曝露樹状細胞の後期内視鏡区画に保持されているのに対し、この実験細胞集団における変化した内視鏡遺伝子プロファイルを確認する。個々の細胞画像を単一の画像ファイルにマージした後、個々の画像をフルオロフォアの発現に従って分割することができ、2つのチャンネル間のピクセル強度の共局在化を散布図で視覚化することができます。2つの処理グループにおけるCD1dとLamp1タンパク質の共局在化の程度は、マンダーの係数を使用して定量化することができます。タンパク質の強度が共局領域と非共局領域の間で不均一である場合、共局化された強度は共局領域と平行ではないため、ピクセル強度に基づいて2つのタンパク質の共局在化をさらに評価することも重要である。一度マスターすると、画像解析は2時間で完了し、RNAシーケンシングのセットアップは、各技術が適切に実行されれば、3時間で完了することができます。この手順を試みる際には、すべての試薬が正しい位置に正しくロードされ、シーケンサーに漏れがないように注意することが重要です。この手順に従って、マイクロRNA、エキソーム、またはマスト細胞シーケンシングのような他の方法を、それぞれ、グローバルなマイクロRNA発現、遺伝子変異、またはDNAメチル化に関する追加の質問に答えるために実行することができる。開発後、この技術は、細胞イメージング分析の分野の研究者と、遺伝子発現およびタンパク質機能に対する環境汚染物質の影響を探求する次世代シーケンシングの研究に役立ちます。このビデオを見た後、次世代シーケンシングの設定方法とタンパク質共局在のイメージャー分析についてよく理解する必要があります。人間の血液サンプル中の有毒な汚染物質化学物質を使用すると、非常に危険な場合があることを忘れないでください。これらの手順を実行する際には、化学発煙フードや個人用保護具の使用などの注意事項を必ず考慮してください。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

マウス大動脈内の免疫細胞のフローサイトメトリー分析

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

ヒトのインビトロ</em免疫バランスの初期状態の認識のためのスクリーニングツールとして>抑制

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

顆粒球機能の変化を評価するために、イメージベースのフローサイトメトリー技術<em&gt;インビトロ</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

簡単かつ迅速なプロトコル非酵素的に浸潤リンパ球の分析のための新鮮なヒト組織を解離

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

マウスの骨髄から形質細胞様樹状細胞の精製のために、蛍光活性化細胞選別

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

マウスリンパ球標識による<sup&gt; 64</sup以下のためのターゲット設定&gt;のCu-抗体の受容体<em&gt;インビボ</em&gt; PET / CTによる細胞輸送

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

イメージングフローサイトメトリーを使用したT細胞同種反応性の測定

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

フローサイトメトリーをイメージングを用いた人間システムの免疫シナプスの定性・定量分析

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

蛍光寿命イメージングによる細胞内のスネアを可視化

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

イメージング フローサイトメトリーとトランスクリプトーム変質エンドサイトーシス CD1d の人身売買を評価するプロファイリングを統合します。

イメージングフローサイトメトリーとトランスクリプトーム変質エンドサイトーシス CD1d の人身売買を評価するプロファイリングを統合します。