Name: integrate imaging flow cytometry and transcriptomic profiling to evaluate altered endocytic cd1d trafficking
Uploaded: 2018-10-29T13:00:00
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저자는 인간의 혈액 샘플에 대 한 로버트 Giulitto (Hoxworth 혈액 센터) 감사 및 유전자 발현의 정규화에 대 한 박사 Liang Niu 읽습니다. 우리는 또한 보조금 지원에서 국립 연구소의 환경 건강 과학 (ES006096) 감사, 환경 유전학 (CEG) 파일럿 프로젝트 (상훈), 알레르기 국립 연구소와 전염병 (AI115358)를 위한 센터 (상훈)의 대학 신시내티 대학 연구 위원회 포상 (상훈), 그리고 대학의 신시내티 대학의 약 코어 향상 자금 (X. Z.).

이 연구에서 인간의 프로토콜 신시내티 대학교의 기관 검토 위원회에 의해 승인 했다 및 모든 방법을 관련 지침 및 규정에 따라 수행 했다. 건강 한 기증자 로부터 혈액 샘플은 신시내티 대학 의료 센터에서 Hoxworth 혈액 센터에서 얻은 했다.
1. Transcriptomic 오염 물질에 노출 된 인간 Monocyte 파생 된 Dc의 프로 파일링
<ol><li>BaP에 노출 된 Dc의 총 RNA 추출<ol>
<li>인간의 Dc cytokines GM-CS...

<ol>
	<li>Roche, P. A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+Processing+and+Presentation+Mechanisms+in+Myeloid+Cells.">Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells.</a> Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MR1+uses+an+endocytic+pathway+to+activate+mucosal-associated+invariant+T+cells.">MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells.</a> The Journal of experimental medicine. 205 (5), 1201-1211 (2008).</li><li>Nakamura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomes+are+specialized+platforms+for+bacterial+sensing+and+NOD2+signalling.">Endosomes are specialized platforms for bacterial sensing and NOD2 signalling.</a> Nature. 509 (7499), 240-244 (2014).</li><li>Blum, J. 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Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).</li><li>Sharma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+endocytic+lipid+antigen+presentation+by+common+lipophilic+environmental+pollutants.">Inhibition of endocytic lipid antigen presentation by common lipophilic environmental pollutants.</a> Science Reports. 7 (1), 2085 (2017).</li><li>Boom, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids.">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> Journal of clinical microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).</li><li>Nachamkin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agilent+2100+bioanalyzer+for+restriction+fragment+length+polymorphism+analysis+of+the+Campylobacter+jejuni+flagellin+gene.">Agilent 2100 bioanalyzer for restriction fragment length polymorphism analysis of the Campylobacter jejuni flagellin gene.</a> Journal of clinical microbiology. 39 (2), 754-757 (2001).</li><li>Kaimal, V., Bardes, E. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+biological+networks+and+gene+expression+data+using+Cytoscape.">Integration of biological networks and gene expression data using Cytoscape.</a> Nature protocols. 2 (10), 2366-2382 (2007).</li><li>Huang, S., Moody, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-unrestricted+T+cells+in+the+human+CD1+system.">Donor-unrestricted T cells in the human CD1 system.</a> Immunogenetics. 68 (8), 577-596 (2016).</li><li>Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Innate-Like+T+Cells+in+Tuberculosis.">Targeting Innate-Like T Cells in Tuberculosis.</a> Frontiers in immunology. 7, 594 (2016).</li><li>Moody, D. B., Porcelli, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pathways+of+CD1+antigen+presentation.">Intracellular pathways of CD1 antigen presentation.</a> Nature reviews. Immunology. 3 (1), 11-22 (2003).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Diard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+cooperative+virulence+by+the+expression+of+an+avirulent+phenotype.">Stabilization of cooperative virulence by the expression of an avirulent phenotype.</a> Nature. 494 (7437), 353-356 (2013).</li><li>Bader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proliferative+and+mature+beta-cells+in+the+islets+of+Langerhans.">Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans.</a> Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).</li><li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+imaging+software+tools.">Biological imaging software tools.</a> Nature. 9 (7), 697-710 (2012).</li><li>Costes, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+and+quantitative+measurement+of+protein-protein+colocalization+in+live+cells.">Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells.</a> Biophysical journal. 86 (6), 3993-4003 (2004).</li></ol>

변경 된 유전자 통로의 기능 확인 널리 영향 을된 유전자 발현 포함 여러 통로 개인과 populational 세포 활동을 통합 하는 데 어려움 때문에 도전적 이다. 우리는 특별히 테스트 CD1d endocytic 구획에 인신 매매를 이미징 cytometry 고용. Cytometry 이미징 셀의 populational 측정 및 여러 단백질의 subcellular colocalization의 개별 데모 통합 합니다. Confocal 현미경 검사 법은 이전 단백질 colocalization를 측정에 높은 해상?...

프레 젠 테이 션 항 원 일반적으로 자주 조사 형태학 상 특성 및 phenotypic 항 원 제시 세포1,2,3의 프로 파일링을 사용 하 여, 세포내 단백질을 포함 . 이미징 및 형질 방법의 장점을 통합 하는 이미징 분석 플랫폼 단일 세포 및 인간 모 수석 세포 (DCs)에서 변경 된 단백질 colocalization를 보여 인구 수준에서 설명 합니다. 펩 티 드 항 원 프레 젠 테이 션에서 중요 한 조직 적합성 복잡 한 (MHC) 종류 I 분자 활성화 기존의 CD8 바인딩과 그물에 짧은 펩 티 드 (8-10 잔류물)을 바인딩할+ T 세포, MHC 종류 II 분자 바인딩 상대적으로 더 오래 동안 기존의 CD4 활성화 endocytic 구획에 있는 펩 티 드 (~ 20 잔류물)+ T 세포1,4. 반면, 지질 관련 T 세포 지질 항 원 endocytic 구획5,6에 주로 로드와 CD1 단백질에 의해 활성화 됩니다. 지질 항 원 프레 젠 테이 션에서 지질 물질 대사7,8,,910 와 로드에 CD1 단백질 기능 지질 대사 산물의 생산 지질 대사 산물의 공급 필요 endocytic 구획5,6. 이러한 맥락에서 변조 지질 항 원 프레 젠 테이 션, 질 성 오염 물질 및 면역 장애, 환경 노출에서 특히 다양 한 세포 요소는 정의할 수 중요 합니다. 이 연구에서 우리가 사용 transcriptomic 분석, 이미지 프로 파일링, 인간 monocyte 파생 된 Dc의 셀룰러 및 populational 이미징 분석 endocytic 단백질 오염 물질 노출에 지질 항 원 프레 젠 테이 션에 기여 매매 결정 하. 물론,이 결합 된 플랫폼 subcellular 단백질 매매 및 다른 생물학 과정에 colocalization를 공부 하 고 적용할 수 있습니다.
기술적으로, 단백질 subcellular 지 방화는 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 검색된 셀1,2,,311의 한정된 된 수에서 분석과 통계를 시연 일반적으로 했다. 또한, cytometry 광범위에 적용 된 세포 레벨12;에 여러 단백질의 공동 스테인드 신호 게이트 세포 인구 그러나,이 상세한 시각화 subcellular 단백질 colocalization의 부족. 휴대 및 인구 수준 비율 단백질 colocalization의 포괄적이 고 통계 분석을 달성 하기 위해 우리 이미징 생물학과 단백질 colocalization의 기능을 확인 하려면 프로 파일링 및 분석 접근 통합 관련성입니다. 특히, 우리를 사용 하 여 이미징 cytometry CD1d lysosomal 관련 막 단백질 1 (Lamp1)의 colocalization를 검출이 연구에서 단백질. Colocalized 분자의 정량 분석 populational 규모에서 이전 어려웠다. 이 연구에서 우리는 populational 및 개별 세포 수준에서 공동 스테인드 세포 수가 많은 단백질 colocalization의 비율을 조사 ImageJ 피지 프로그램 적응. 특히, 강도, 공동 화 된 지역과 CD1d 단백질 질 성 오염 물질 benzo [a] pyrene (BaP)13에 노출에 인간의 Dc의 늦은 endocytic 구획에 크게 유지 했다 결론을 지원 하기 위해 populational 크기 측정 . 이 결합 된 셀룰러 및 인구 분석 이미징 CD1d-Lamp1 colocalization 저해 지질 항 원 프레 젠 테이 션 관련의 높은 재현성, 포괄적인, 통계적으로 유의 한 결과 제공 합니다.
BaP에 노출 된 인간의 Dc transcriptome 강하게 endocytic 지질 대사 및 CD1d endocytic 밀매 BaP 노출에서 손상 했다 가설을 지원. 이 가설을 테스트 하기 위해 우리는 CD1d, endocytic 마커 및 DC 마커 포함 하는 여러 단백질으로 얼룩진 공동 했다 DC 인구의 이미지를 프로 파일링 하려면 이미징 cytometry 적용. 마지막으로, 공동 스테인드 셀 강도의 비율 및 CD1d 및 Lamp1 colocalization의 영역을 통계적으로 분석 되었다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1340px;" width="1340">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Transcriptomics</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td style="width:417px;">HiSeq 2500 v4</td>
			<td style="width:191px;">Illumina HiSeq system</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">ImagingStream X</td>
			<td style="width:448px;">Millipore</td>
			<td>100220</td>
			<td>Imaging flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">mirVana miRNA Isolation Kit</td>
			<td style="width:448px;">Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Total RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agilent RNA 6000 Pico Kit</td>
			<td style="width:448px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Total RNA QC analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler</td>
			<td style="width:448px;">Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>PCR, enzyme reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module&#160;</td>
			<td style="width:448px;">New England Biolab</td>
			<td></td>
			<td>PolyA RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Automated SMARTer Apollo system</td>
			<td style="width:448px;">Takara</td>
			<td></td>
			<td>PolyA RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td style="width:448px;">New England Biolab</td>
			<td></td>
			<td>Library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agencourt AMPure XP magnetic beads</td>
			<td style="width:448px;">Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>DNA purification&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:448px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Library QC, size distribution analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td style="width:448px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Library QC, size distribution analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher)</td>
			<td style="width:448px;">Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Library quantification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NEBNext Library Quant Kit</td>
			<td style="width:448px;">New England Biolab</td>
			<td></td>
			<td>Library quantification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">cBot</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Library cluster generation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot &#8211; HS</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Library cluster generation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">HiSeq 1000</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">TruSeq SBS Kit v3 - HS (50-cycles)</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7)</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td style="width:417px;">L243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5)</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td align="right" style="width:417px;">3.9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Brilliant violet 421</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td style="width:417px;">L161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">PE-anti-mouse IgG2b</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td align="right" style="width:417px;">51.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Alexa Fluor 647 (AF647)</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td style="width:417px;">CD107a(H4A3)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integrate imaging flow cytometry and transcriptomic profiling to evaluate altered endocytic cd1d trafficking

Endocytic 단백질의 형태 및 기능 변경의 populational 분석은 이미지 캡처 populational 수준에서 단일 셀 수준 및 통계 이미지 분석에서의 수요로 인해 도전. 이 어려움을 극복 하기 위해 우리 사용 이미징 cytometry transcriptomic (RNA-seq)를 프로 파일링 관련 차별화 1 d 단백질 (CD1d)의 클러스터의 변경 된 subcellular 지역화가 결정을 인간에서 손상된 endocytic 유전자 발현과 닥터지 일반에 노출 된 수지상 세포 (DCs), 공기 오염 물질 benzo pyrene [a]. CD1d 셀 이미지 이미징 cytometry 점령의 수천에서 endocytic 마커 Lamp1 단백질의 colocalization 아이디어와 ImageJ 피지를 사용 하 여 분석 프로그램. CD1d에 게이팅 후 공동 스테인드 CD1d 및 Lamp1 단백질 많은 세포 이미지 시각화 했다+Lamp1+ Dc 아이디어를 사용 하 여. BaP 노출 했다 Mander의 계수 공동 지역화 된 강도를 테스트 하 고 플롯 thresholded scatterplots를 사용 하 여 입증 시 향상 된 CD1d 및 Lamp1 colocalization ImageJ 피지를 사용 하 여 공동 화 된 영역의 비율 기반으로 합니다. 우리의 데이터 오염 물질에 노출 된 인간의 transcriptomic 변경의 장애인된 기능 결과 지 원하는 단일 및 populational 세포 수준에서 단백질 colocalization를 측정 하는 유리 기 악 및 bioinformatic 접근 방식을 제공합니다 Dc입니다.

질 성 오염 물질 BaP 변경 각 기증자 로부터 인간의 Dc. 인간의 monocyte 파생 된 Dc에서 endocytic 유전자 클러스터 (n = 3) BaP 함께 incubated 되었고 기존의 DCs, RNA 추출 및 분석용 transcriptomic 설명 된 대로 추가 사용에 대 한 정렬 . 유전자 발현의 정규화에 따라 BaP 노출, 비 노출 그룹 간의 변경된 유전자 차동 표현한 유전자의 기능 상관 관계에 따라 클러스터 했다. 우리는 Toppcluster 프...

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Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking

Cytometry 이미징 개인과 populational 수준에서 세포의 형태학 적 및 기능적 변경 감지 하는 이상적인 접근을 제공 합니다. 오염 물질에 노출 된 인간의 수지상 세포에 지질 항 원 프레 젠 테이 션에 대 한 방해 endocytic 기능 유전자 발현 및 단백질 매매의 형태학 데모의 프로 파일링 결합된 transcriptomic 시연 했다.

통합 이미징 Cytometry Transcriptomic 변경된 Endocytic CD1d 매매 평가 하 프로 파일링

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single ...

이러한 방법은 차세대 시퀀싱 및 유동 세포측정 이미징 분석을 통합합니다. 그것은 흥미로운 질문에 대답 하는 데 도움이 수 있습니다., 일부 표현 변경 연루 여부, 대신 전사, 특히 오염 물질 노출 환경에서. 이 간단한 방법의 주요 장점은 생물학적으로 중요한 단백질의 지역화를 측정하여 기능적 수준에서 주요 차등 유전자 발현의 결과를 해석하는 데 사용할 수 있다는 것입니다.이 기술의 의미는 병리학적 및 독성 결과의 진단으로 확장됩니다. 일반적인 심조 접근법으로서, 예측은 유전자 발현을 단백질 기능에 연결하는 능력을 갖는다. 일반적으로, 이 방법에 새로운 개별은 화상 진찰 및 전사 분석의 높은 기술적인 요구 때문에 투쟁할 것입니다.인간 단세포 유래 수지상 세포 라이브러리를 서열화하기 위해, 먼저 시퀀싱 및 인덱싱 시약 랙에 시퀀싱 및 인덱싱 시약을 각각 로드하고, 모든 얼음이 녹을 때까지 실험실 급수 욕조에 랙을 1시간 동안 배치하고, 시약은 철저히 혼합된다. 시약이 해동하는 동안 시퀀서의 전원을 켜고, 컴퓨터를 네트워크 드라이브에 연결하고, 이젝트 금지 드라이브가 나타날 때 네트워크 드라이브에 연결하고 시퀀서 제어 소프트웨어를 시작합니다. 다음으로, 시퀀싱 생합성 시약 랙의 각 병에 약 100 밀리리터의 유지 보수 세척 솔루션을 추가하고 깔때기 캡을 각 병에 나사로 넣습니다.인덱싱 시약 랙의 각 15 밀리리터 원모형 튜브에 약 12밀리리터의 유지 보수 세척 솔루션을 추가하고 캡을 폐기합니다. 그런 다음 두 랙을 시퀀서에 로드합니다. 시퀀서 제어 소프트웨어 내에서 유지 보수 세척을 선택하고 시퀀서 유체 시스템을 청소하는 지침을 따릅니다.손전등을 사용하여 차선을 통과하는 거품의 흐름 셀을 시각적으로 검사하여 누출이 없는지 확인합니다. 세척 순서가 완료되면 시퀀스 탭을 열고 새 실행을 시작하여 출력 데이터를 네트워크 드라이브로 안내합니다. 다중 해제를 위해 샘플 시트를 업로드하고 적절한 시약 정보를 입력합니다.사용 된 흐름 셀을 사용하여 시퀀싱 시약을 사용하여 시스템을 프라임합니다. 클러스터 생성이 완료되면 흐름 셀을 제거합니다. 그리고 가볍게 물로 세포를 스프레이.렌즈 종이로 흐르는 셀건조를 닦은 다음 95%에탄올이 있는 가벼운 스프레이를 뿌립니다. 유동 셀을 다시 닦은 후, 유동 셀의 표면을 빛에 대 고 확인 하 고 이물질이나 소금 잔류물 없이 깨끗 한 있는지 확인 합니다. 프라임 단계가 완료되면 클러스터된 유동 셀을 로드하고 시퀀싱을 시작합니다.시퀀스 분석 뷰어 소프트웨어가 자동으로 시작됩니다. 약 26시간 후, 고시퀀스 제어 소프트웨어를 통해 시퀀싱 데이터 품질을 모니터링하고 분석 뷰 소프트웨어를 시퀀싱하여 데이터 품질을 평가하고 문제 해결을 모니터링합니다. 이어서, 시퀀스가 끝나면, 유동셀 개스킷을 변경하고, 다음 실행을 시작하기 전에 유지 보수 세척을 수행한다.오염물질-노출된 수지상 세포의 유동 세포 측정 영상 후, ImageJ 피지를 열고, 치료군에 따라 비노출 및 오염물질-오염물질-노출된 인간 수지상 세포 샘플 그룹에 대해 저장된 100개의 세포 이미지를 병합한다. 두 집단 내에서 CD1d 및 Lamp1 colocalization을 분석하려면 오염 물질 에 노출된 100개의 병합된 셀 이미지를 열고 이미지, 색상 및 분할 채널을 선택하여 채널을 당 단일 플루오로포어로 두 개의 개별 이미지로 이미지를 분할합니다. 공동화된 픽셀의 분산 플롯을 만들려면 분석, 공동 현지화 및 공동 화 임계값을 선택하고 인쇄 화면을 눌러 분산 플롯을 저장합니다.각 단일 셀룰러 이미지에 대한 Mander의 지역화 계수를 계산하려면 타원형 선택 도구를 사용하여 분할 채널이 있는 이미지 파일의 단일 셀 이미지를 선택하고 분석, Colocalization 및 Colocalization 임계값을 다시 선택합니다. 그런 다음 관심 영역의 대화 상자에서 채널 1을 선택하고 확인을 클릭합니다. 계수가 모든 100개의 셀 이미지에 대해 계산된 경우 결과를 적절한 스프레드시트로 가져오고, 비노출된 셀 샘플 제어를 위한 분석을 반복한다. RNA 염기서열 분석 및 전사 데이터 분석을 사용하여 지질 대사 및 내세포 기능을 포함한 여러 가지 주요 변경 된 유전자 클러스터가 오염 물질 노출 DC에서 확인되었습니다.개별 세포 영상 수준에서 HLADR 양성 CD11c 양성 수지상 세포는 CD1d 및 Lamp1 공동발현에 따라 게이트될 수 있다. 제어 비 노출 수지상 세포는 최소한의 CD1d 및 Lamp1 단백질 colocalization화를 나타내며, 이는 CD1d 내막 인신 매매의 기저 수준을 나타내고, 생리적 조건 하에서 높은 수준의 표면 발현을 나타낸다. CD1d는 오염 물질 노출 수지상 세포의 늦은 내세포 구획에서 유지되는 반면, 이 실험적인 세포 집단에 있는 변경한 내낭성 유전자 단면도를 확인합니다.개별 셀룰러 이미지를 단일 이미지 파일로 병합한 후, 개별 이미지는 형광식에 따라 분할될 수 있으며, 두 채널 간의 픽셀 강도의 공존화는 분산 플롯에서 시각화될 수 있다. 두 치료 군에서 CD1d와 Lamp1 단백질 사이의 코현지화 정도는 Mander의 계수를 사용하여 정량화 될 수 있습니다. 단백질 강도가 지역화 영역과 비지역화된 영역 간의 이질적인 경우, 지역화된 강도는 지역화 부위와 평행하지 않으므로 픽셀 강도에 기초하여 두 단백질의 공동 현지화를 더욱 평가하는 것도 중요하다.일단 마스터되면, 각 기술이 제대로 수행되는 경우, 2시간 안에 화상 분석을 완료할 수 있고, RNA 시퀀싱 설정을 3시간 안에 완료할 수 있다. 이 절차를 시도하는 동안 모든 시약이 올바른 위치에 올바르게 로드되고 시퀀서에 누출이 없는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 마이크로 RNA, 엑소메 또는 마스트 세포 염기서열분석과 같은 다른 방법은 각각 글로벌 마이크로 RNA 발현, 유전자 돌연변이 또는 DNA 메틸화에 대한 추가 질문에 답하기 위해 수행될 수 있다.그래서 개발 후, 이 기술은 세포 화상 진찰 분석의 필드에 있는 연구원을 도울 것입니다, 그리고 차세대 순서는 유전자 발현 및 단백질 기능에 환경 오염 물질의 효력을 탐구하기 위하여. 이 비디오를 시청한 후에는 차세대 시퀀싱을 설정하는 방법과 단백질 합리화의 이미저 분석을 잘 이해해야 합니다. 인간의 혈액 샘플에서 독성 오염 물질 화학 물질로 작업하는 것은 매우 위험 할 수 있음을 잊지 마십시오.화학 연기 후드 및 개인 보호 장비를 사용하는 것과 같은 예방 조치는 이러한 절차를 수행 할 때 항상 취해야합니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Murine Aortas 이내에 면역 세포의 흐름 Cytometry 분석

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

연구

면역학 및 감염병학

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

사람의 체외에서</em면역 불균형의 초기 국가의 인정을위한 심사 도구를> 억제

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

이미지 기반 유동 세포 계측법 기술은 과립구 기능의 변화를 평가하기<em&gt; 체외</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

침투 림프구의 분석을위한 비 효소 해리 신선한 인간의 조직에 대한 간단하고 빠른 프로토콜

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

마우스 골수에서 형질 수지상 세포의 정화를위한 형광 활성화 셀 정렬

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

에 의해 쥐 림프구 라벨링<sup&gt; (64)</sup&gt; CU-항체 수용체는 대한 타겟팅<em&gt; 생체</em&gt; PET / CT에 의한 세포 트래 피킹

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

이미징 유동 세포 계측법을 사용하여 T 세포 Alloreactivity의 측정

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Cytometry 이미징 사용 하 여 인간의 시스템에 면역 시 냅 스의 질적 및 양적 분석

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...