Name: integrate imaging flow cytometry and transcriptomic profiling to evaluate altered endocytic cd1d trafficking
Uploaded: 2018-10-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking at JoVE.com

Forfatterne takker Robert Giulitto (Hoxworth blod center) for menneskelig blodprøver og Dr. Liang Niu for normalisering av genuttrykk leser. Vi takker også gi støtte fra National Institute of Environmental Health Sciences (ES006096), Center for Environmental genetikk (CEG) pilotprosjekt (SH), National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer (AI115358) (SH), universitet Cincinnati University Research Council prisen (SH), og Universitetet i Cincinnati College i medisin kjernen ekstrautstyr midler (X. Z.).

Menneskelige protokoller i denne studien var godkjent av institusjonelle gjennomgang styret ved University of Cincinnati og alle metodene ble utført i henhold til relevante retningslinjer og regler. Blodprøver fra friske blodgivere ble innhentet fra Hoxworth blod Center ved University of Cincinnati Medical Center.
1. Transcriptomic profilering av forurensende-eksponerte menneskelige monocytt-avledet DCs
<ol><li>Totale RNA utvinning av BaP-eksponerte DCs<ol>
<li>Skille menneskelig DCs cytok...

<ol>
	<li>Roche, P. A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+Processing+and+Presentation+Mechanisms+in+Myeloid+Cells.">Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells.</a> Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MR1+uses+an+endocytic+pathway+to+activate+mucosal-associated+invariant+T+cells.">MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells.</a> The Journal of experimental medicine. 205 (5), 1201-1211 (2008).</li><li>Nakamura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomes+are+specialized+platforms+for+bacterial+sensing+and+NOD2+signalling.">Endosomes are specialized platforms for bacterial sensing and NOD2 signalling.</a> Nature. 509 (7499), 240-244 (2014).</li><li>Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+antigen+processing.">Pathways of antigen processing.</a> Annual review of immunology. 31, 443-473 (2013).</li><li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+natural+killer+T+cells:+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions.">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li><li>Zajonc, D. M., Kronenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1+mediated+T+cell+recognition+of+glycolipids.">CD1 mediated T cell recognition of glycolipids.</a> Current opinion in structural biology. 17 (5), 521-529 (2007).</li><li>Cox, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+cellular+lipids+bound+to+human+CD1d+molecules.">Determination of cellular lipids bound to human CD1d molecules.</a> PloS one. 4 (5), e5325 (2009).</li><li>Yuan, W., Kang, S. J., Evans, J. E., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+lipid+ligands+associated+with+human+CD1d+targeted+to+different+subcellular+compartments.">Natural lipid ligands associated with human CD1d targeted to different subcellular compartments.</a> Journal of immunology. 182 (8), 4784-4791 (2009).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+deoxyceramides+and+diacylglycerols+as+CD1b+scaffold+lipids+among+diverse+groove-blocking+lipids+of+the+human+CD1+system.">Discovery of deoxyceramides and diacylglycerols as CD1b scaffold lipids among diverse groove-blocking lipids of the human CD1 system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19335-19340 (2011).</li><li>de Jong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1a-autoreactive+T+cells+recognize+natural+skin+oils+that+function+as+headless+antigens.">CD1a-autoreactive T cells recognize natural skin oils that function as headless antigens.</a> Nature. 15 (2), 177-185 (2014).</li><li>Trombetta, E. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+antigen+processing+in+vitro+and+in+vivo.">Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo.</a> Annual review of immunology. 23, 975-1028 (2005).</li><li>Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+immunophenotyping+for+the+Human+Immunology+Project.">Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project.</a> Nature reviews. Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).</li><li>Sharma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+endocytic+lipid+antigen+presentation+by+common+lipophilic+environmental+pollutants.">Inhibition of endocytic lipid antigen presentation by common lipophilic environmental pollutants.</a> Science Reports. 7 (1), 2085 (2017).</li><li>Boom, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids.">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> Journal of clinical microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).</li><li>Nachamkin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agilent+2100+bioanalyzer+for+restriction+fragment+length+polymorphism+analysis+of+the+Campylobacter+jejuni+flagellin+gene.">Agilent 2100 bioanalyzer for restriction fragment length polymorphism analysis of the Campylobacter jejuni flagellin gene.</a> Journal of clinical microbiology. 39 (2), 754-757 (2001).</li><li>Kaimal, V., Bardes, E. E., Tabar, S. C., Jegga, A. G., Aronow, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToppCluster:+a+multiple+gene+list+feature+analyzer+for+comparative+enrichment+clustering+and+network-based+dissection+of+biological+systems.">ToppCluster: a multiple gene list feature analyzer for comparative enrichment clustering and network-based dissection of biological systems.</a> Nucleic acids research. 38 (Web Server issue), W96-W102 (2010).</li><li>Bauer-Mehren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+genomic+information+with+biological+networks+using+Cytoscape).">Integration of genomic information with biological networks using Cytoscape).</a> Methods in molecular biology. 1021, 37-61 (2013).</li><li>Cline, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+biological+networks+and+gene+expression+data+using+Cytoscape.">Integration of biological networks and gene expression data using Cytoscape.</a> Nature protocols. 2 (10), 2366-2382 (2007).</li><li>Huang, S., Moody, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-unrestricted+T+cells+in+the+human+CD1+system.">Donor-unrestricted T cells in the human CD1 system.</a> Immunogenetics. 68 (8), 577-596 (2016).</li><li>Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Innate-Like+T+Cells+in+Tuberculosis.">Targeting Innate-Like T Cells in Tuberculosis.</a> Frontiers in immunology. 7, 594 (2016).</li><li>Moody, D. B., Porcelli, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pathways+of+CD1+antigen+presentation.">Intracellular pathways of CD1 antigen presentation.</a> Nature reviews. Immunology. 3 (1), 11-22 (2003).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Diard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+cooperative+virulence+by+the+expression+of+an+avirulent+phenotype.">Stabilization of cooperative virulence by the expression of an avirulent phenotype.</a> Nature. 494 (7437), 353-356 (2013).</li><li>Bader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proliferative+and+mature+beta-cells+in+the+islets+of+Langerhans.">Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans.</a> Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).</li><li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+imaging+software+tools.">Biological imaging software tools.</a> Nature. 9 (7), 697-710 (2012).</li><li>Costes, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+and+quantitative+measurement+of+protein-protein+colocalization+in+live+cells.">Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells.</a> Biophysical journal. 86 (6), 3993-4003 (2004).</li></ol>

Funksjonell bekreftelse av en endret genet veien er utfordrende, på grunn av mye påvirket genuttrykk som involverer flere veier og vanskeligheter for å integrere individuelle og populational mobilnettet aktiviteter. Vi ansatt tenkelig flowcytometri spesielt prøve CD1d handel i endocytic avdelinger. Imaging flowcytometri integrerer populational måling av celler og personlige demonstrasjon av subcellular colocalization av flere proteiner. AC confocal mikroskopi har tidligere gitt høy oppløsning måle protein colocal...

Antigen presentasjon innebærer vanligvis intracellulær protein menneskehandel, som har ofte blitt undersøkt morfologiske karakterisering og fenotypiske profilering av antigen presentere celler1,2,3 . For å integrere fordelene med bildebehandling og phenotyping metoder, beskriver vi en tenkelig analyse plattform for både enkeltceller og innbyggere nivåer å demonstrere en endret protein colocalization i menneskelige dendrittiske celler (DCs). I peptid antigen presentasjon, store histocompatibility kompleks (MHC) klasse I molekyler binde et kort peptid (8-10 rester) i det endoplasmatiske retikulum aktivere konvensjonelle CD8+ T celler, mens molekylene av MHC klasse II binde en relativt lengre peptid (~ 20 rester) i endocytic avdelinger å aktivere konvensjonelle CD4+ T celler1,4. Derimot er lipid-spesifikke T-celler aktivert ved CD1 proteiner med lipid antigener hovedsakelig i endocytic rom5,6. Lipid antigen presentasjon krever tilførsel av lipid metabolitter produsert i lipid, metabolisme,7,,8,,9,,10 og lasting av funksjonelle lipid metabolitter CD1 proteiner i endocytic rom5,6. I denne sammenheng er ulike cellulære faktorer modulerende lipid antigen presentasjon, spesielt i miljømessige eksponering lipofile stoffer og immune sykdommer, avgjørende for defineres. I denne studien brukte vi transcriptomic analyse, bilde profilering og mobilnettet og populational tenkelig analyse av menneskelig monocytt-avledet DCs for å bestemme endocytic protein smugling bidra til lipid antigen presentasjon forurensende eksponering. Sikkert, denne kombinerte plattformen kan brukes til å studere subcellular protein narkotikahandel og colocalization i ulike biologiske prosesser.
Teknisk, subcellular protein lokalisering ble vanligvis demonstrert med AC confocal mikroskopi og statistisk analysert i et begrenset antall oppdaget celler1,2,3,11. Videre har flowcytometri blitt bredt brukt til gate celle populasjoner med co farget signaler av flere proteiner på en mobilnettet nivå12; men mangler dette en detaljert visualisering av subcellular protein colocalization. For å oppnå omfattende og statistiske analyser av prosenten protein colocalization både mobilnettet og befolkningen, innlemme vi imaging profilering og analyse tilnærminger for å bestemme funksjonene i protein colocalization med biologiske relevans. Spesifikt bruker vi tenkelig flowcytometri for å oppdage colocalization av CD1d og lysosomale-assosiert membran protein 1 (Lamp1) proteiner i denne studien. Kvantitativ analyse av colocalized molekyler var tidligere vanskelig utføres på populational skala. I denne studien tilpasset vi ImageJ-Fiji skal undersøke prosentandelen av protein colocalization med et stort antall co farget celler på både populational og personlige mobilnettet nivå. Spesielt målt vi samlokalisert områder, intensitet og populational størrelse å støtte konklusjonen at CD1d protein ble stort sett beholdt i slutten endocytic deler av menneskelig DCs eksponering for en lipofile forurensende benzo [a] pyrene (BaP)13 . Denne kombinerte mobilnettet og befolkningen imaging analyse leveres svært reproduserbare, omfattende og statistisk signifikant resultatene av CD1d-Lamp1 colocalization gjelder for hemmet lipid antigen presentasjon.
Transcriptome av BaP-eksponerte menneskelige DCs støttet sterkt hypotesen at endocytic lipid metabolisme og CD1d endocytic handel ble nedsatt i BaP eksponering. For å teste hypotesen, brukt vi tenkelig flowcytometri profilen bilder av DC befolkningen var co farget med flere proteiner inkludert CD1d, endocytic markører og DC markører. Til slutt, co farget celler var statistisk analysert for å demonstrere prosentandelen av intensitet og områder av CD1d og Lamp1 colocalization.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1340px;" width="1340">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Transcriptomics</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td style="width:417px;">HiSeq 2500 v4</td>
			<td style="width:191px;">Illumina HiSeq system</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">ImagingStream X</td>
			<td style="width:448px;">Millipore</td>
			<td>100220</td>
			<td>Imaging flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">mirVana miRNA Isolation Kit</td>
			<td style="width:448px;">Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Total RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agilent RNA 6000 Pico Kit</td>
			<td style="width:448px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Total RNA QC analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler</td>
			<td style="width:448px;">Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>PCR, enzyme reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module&#160;</td>
			<td style="width:448px;">New England Biolab</td>
			<td></td>
			<td>PolyA RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Automated SMARTer Apollo system</td>
			<td style="width:448px;">Takara</td>
			<td></td>
			<td>PolyA RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td style="width:448px;">New England Biolab</td>
			<td></td>
			<td>Library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agencourt AMPure XP magnetic beads</td>
			<td style="width:448px;">Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>DNA purification&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:448px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Library QC, size distribution analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td style="width:448px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Library QC, size distribution analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher)</td>
			<td style="width:448px;">Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Library quantification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NEBNext Library Quant Kit</td>
			<td style="width:448px;">New England Biolab</td>
			<td></td>
			<td>Library quantification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">cBot</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Library cluster generation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot &#8211; HS</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Library cluster generation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">HiSeq 1000</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">TruSeq SBS Kit v3 - HS (50-cycles)</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7)</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td style="width:417px;">L243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5)</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td align="right" style="width:417px;">3.9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Brilliant violet 421</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td style="width:417px;">L161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">PE-anti-mouse IgG2b</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td align="right" style="width:417px;">51.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Alexa Fluor 647 (AF647)</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td style="width:417px;">CD107a(H4A3)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integrate imaging flow cytometry and transcriptomic profiling to evaluate altered endocytic cd1d trafficking

Populational analyser av morfologiske og funksjonell endring av endocytic proteiner er utfordrende på grunn av etterspørselen av image fange på en enkelt celle nivå og statistisk analyse på et populational nivå. For å overkomme dette problemet, brukte vi tenkelig flowcytometri og transcriptomic profilering (RNA-seq) for å finne endrede subcellular lokalisering av klyngen differensiering 1d protein (CD1d) forbundet med nedsatt endocytic genuttrykk i menneskelig dendrittiske celler (DCer), som ble utsatt for felles lipofile luft forurensende benzo [a] pyrene. Colocalization av CD1d og endocytic markør Lamp1 proteiner fra tusenvis av cellen bilder tatt med imaging flowcytometri ble analysert ved hjelp av ideer og ImageJ-Fiji programmer. Mange mobilnettet bilder med co farget CD1d og Lamp1 proteiner var visualisert etter gating på CD1d+Lamp1+ DCs skylden. De forbedrede CD1d og Lamp1 colocalization på BaP eksponering ble ytterligere demonstrert bruker thresholded scatterplots, testet med Manders koeffisientene for samlokalisert intensitet og plottet avhengig av samlokalisert med ImageJ-Fiji. Våre data gir en fordelaktig instrumental og bioinformatic tilnærming for å måle protein colocalization på både enkelt og populational mobilnettet nivå, støtte en svekket funksjonelle utfallet av transcriptomic endring i forurensende-eksponerte menneskelige DCs.

Den lipofile forurensende BaP endrer endocytic genet klynger i menneskelig DCs. Human monocytt-avledet DCs fra hver giver (n = 3) ble inkubert med BaP og sortert for konvensjonelle DCs, som ble videre brukt for RNA utvinning og transcriptomic analyse som beskrevet . Ved normalisering av genuttrykk, var endret genene mellom BaP-eksponert og ikke-utsatt grupper gruppert etter funksjonelle sammenhengen av ulikt uttrykt gener. Vi inn listen endret genet til Toppcluster programmet<sup class="x...

Watch this Scientific Journal Video about Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking at JoVE.com

Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking

Imaging flowcytometri gir en ideell tilnærming for å oppdage morfologiske og funksjonell endring av celler på personlige og populational. Forstyrret endocytic funksjonen for lipid antigen presentasjon i forurensende-eksponerte menneskelige dendrittiske celler ble demonstrert med en kombinert transcriptomic profilering av genuttrykk og morfologiske demonstrasjon av protein menneskehandel.

Integrere Imaging flowcytometri og Transcriptomic profilering å vurdere endret Endocytic CD1d menneskehandel

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single ...

Disse metodene integrerer neste generasjons sekvensering og flytcytometribildeanalyse. Det kan bidra til å svare på interessante spørsmål, som om noen fenotypiske endringer er impliserer, i stedet for transkripsjonen, spesielt i forurensende eksponeringsmiljø. Den største fordelen med denne enkle metoden for oss er at vi kan bruke den til å måle kolokalisering av biologisk viktig protein, for å tolke resultatene av viktige differensialgenuttrykk på funksjonelt nivå.Implikasjonene av denne teknikken strekker seg mot diagnostisering av patologiske og toksikologiske resultater. Som en vanlig imager tilnærming, forutse har evnen til å koble genuttrykk til proteinfunksjon. Generelt vil personer som er nye på denne metoden slite på grunn av de høye tekniske kravene til bildebehandling og transkripsjonsanalyse.For å sekvensere det menneskelige monocytten avledet dendrittisk cellebibliotek, legg først sekvenserings- og indekseringsreagensene på henholdsvis sekvenseringsbiosyntesen og indekseringsreagensstativene, og plasser stativene i et vannbad av laboratoriegrad i en time, til all isen har smeltet, og reagensene blandes grundig. Mens reagensene tiner, slå på sequenceren, kobler datamaskinen til en nettverksstasjon når Ikke løs ut-stasjonen vises, og starter sequencerkontrollprogramvaren. Deretter legger du til ca 100 milliliter vedlikeholdsvaskløsning til hver av flaskene i sekvenseringsreasyntesereagensstativet, og skrur en trakthette på hver flaske.Tilsett ca. 12 milliliter vedlikeholdsvaskeløsning til hvert 15 milliliter koniske rør i indekseringsreagensstativet, og kast hettene. Legg deretter begge stativene på sequenceren. Velg Vedlikeholdsvask i sequencerkontrollprogramvaren, og følg instruksjonene for rengjøring av sequencervæskesystemet.Bruk en lommelykt til å visuelt inspisere strømningscellen for bobler som passerer gjennom banene, for å sikre at det ikke er lekkasje. Når vaskesekvensen er ferdig, åpner du kategorien Sekvens og starter en ny kjøring, og dirigerer utdata til en nettverksstasjon. Last opp et eksempelark for demultiplexing, og skriv inn riktig reagensinformasjon.Bruk en brukt strømningscelle til å prime systemet, med sekvenseringsreagensene. Når klyngegenereringen er fullført, fjerner du flytcellen. Og spray lett cellen med vann.Tørk av strømningscellen tørr med linsepapir, etterfulgt av en lett spray med 95% etanol. Etter at strømningscellen er tørr igjen, kontrollerer du strømningscellens overflate mot lyset for å forsikre deg om at den er ren, uten rusk eller saltrester. Når hovedtrinnet er ferdig, laster du inn den grupperte flytcellen og starter sekvenseringen.Sekvensanalyseviserprogramvaren startes automatisk. Omtrent 26 timer senere overvåker du sekvenseringsdatakvaliteten via programvaren for kontroll av høy sekvens, og sekvenseringsanalysevisningsprogramvare for å vurdere datakvaliteten og for feilsøking. Deretter, når sekvensen er ferdig, endre strømningscellepakningen, og utføre en vedlikeholdsvask før du begynner neste kjøring.Etter strømning cytometrisk avbildning av forurensende eksponerte dendrittiske celler, åpne ImageJ Fiji, og slå sammen de 100 lagrede cellebildene for de ikke-eksponerte og forurensende eksponerte menneskelige dendrittiske celleprøvegruppene i individuelle filer i henhold til behandlingsgruppen. Hvis du vil analysere CD1d og Lamp1-colocalization i de to populasjonene, åpner du det forurensende eksponerte 100 sammenslåtte cellebildet og velger Bilde-, farge- og delekanaler for å dele bildet i to individuelle bilder med én fluorofor per kanal. Hvis du vil opprette et punktdiagram for de kolokaliserte pikslene, velger du Analyser, Colocalization og Colocalization Threshold, og trykker På Skriv ut skjerm for å lagre punktplottet.Hvis du vil beregne Manders kolokaliseringskoeffisient for hvert enkeltcellebilde, bruker du det ovale markeringsverktøyet til å velge et enkeltcellebilde på bildefilen med de delte kanalene, og velger Analyser, Colocalization og Colocalization Threshold på nytt. Velg deretter Kanal 1 fra dialogboksen for interesseområdet, og klikk OK. Når koeffisienten er beregnet for alle 100 cellebilder, importerer du resultatene til et passende regneark og gjentar analysen for kontrolleksponert celleeksempel. Ved hjelp av RNA-sekvensering og transkripsjonsdataanalyser ble flere store endrede genklynger, inkludert lipidmetabolisme og endokytiske funksjoner identifisert i de forurensende eksponerte DCene.På det individuelle cellebildenivået kan HLADR-positive CD11c positive dendrittiske celler gated, i henhold til deres CD1d og Lamp1-samtrykk. Kontroll ikke-eksponerte dendrittiske celler viser minimal CD1d og Lamp1 protein colocalization, noe som indikerer et basalnivå av CD1d endokytisk menneskehandel, og et høyt nivå av overflateuttrykk under fysiologiske forhold. Mens CD1d beholdes i de sene endokytiske rommene av forurensende eksponerte dendrittiske celler, bekrefter endrede endokytiske genprofiler i denne eksperimentelle cellepopulasjonen.Etter å ha sammenslåing av de enkelte mobilbildene til en enkelt bildefil, kan de enkelte bildene deles i henhold til deres fluoroforuttrykk, og kolokaliseringen av pikselintensiteten mellom de to kanalene kan visualiseres i et scatter-plott. Graden av kolokalisering mellom CD1d- og Lamp1-proteinene i de to behandlingsgruppene kan deretter kvantifiseres ved hjelp av Manders koeffisienter. Hvis proteinintensiteten er hetergen mellom de colokaliserte og ikke-colokaliserte områdene, vil den colokaliserte intensiteten ikke være parallell med de samlokaliserte områdene, derfor er det også viktig å vurdere samlokaliseringen av de to proteinene ytterligere, basert på pikselintensiteten.Når den er mestret, kan bildeanalysen fullføres om to timer, og RNA-sekvenseringsoppsettet kan fullføres om tre timer, hvis hver teknikk utføres riktig. Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske å sørge for at alle reagensene er riktig lastet i riktig posisjoner, og at det ikke er lekkasje i sequenceren. Etter denne prosedyren kan andre metoder, som mikro RNA, eksom eller mastcellesekvensering, utføres for å svare på flere spørsmål om henholdsvis globalt mikro RNA-uttrykk, genmutasjon eller DNA-metylering.Så etter utviklingen vil denne teknikken hjelpe forskere innen cellulær bildeanalyse, og neste generasjons sekvensering for å utforske effekten av miljøforurensende på genuttrykk og proteinfunksjon. Etter å ha sett denne videoen, bør du ha en god forståelse av hvordan du setter opp neste generasjons sekvensering, og imageranalysen av proteinkolokalisering. Ikke glem at det kan være ekstremt farlig å arbeide med giftige forurensende kjemikalier i blodprøver hos mennesker.Forholdsregler som bruk av en kjemisk røykhette og personlig verneutstyr, bør alltid tas når du utfører disse prosedyrene.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Bildebasert flowcytometrisystemer Technique å evaluere Endringer i Granulocytt Funksjon<em&gt; In Vitro</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

En enkel og Rapid-protokollen til ikke-enzymatisk distansere Ferske menneskelig vev for analyse av infiltrerende Lymfocytter

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescens-aktivert cellesortering for Rensing av Plasmacytoid dendrittiske celler fra mus Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymfocytter Merking av<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-antistoff Reseptor for målretting<em&gt; In Vivo</em&gt; Celletrafikken av PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Måling av T-celle alloreaktiviteten hjelp Imaging Flow Cytometry

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Kvalitativ og kvantitativ analyse av immun Synapse i menneskelige systemet ved hjelp av Imaging flowcytometri

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Visualisere intracellulær SNARE smugling av fluorescens levetid Imaging mikroskopi

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...