Name: integrate imaging flow cytometry and transcriptomic profiling to evaluate altered endocytic cd1d trafficking
Uploaded: 2018-10-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking at JoVE.com

Os autores agradecer Robert Giulitto (centro de sangue de Hoxworth) para amostras de sangue humano e Dr. Liang Niu para a normalização da expressão do gene lê. Agradecemos também a concessão de apoio do nacional Instituto de Ciências de saúde ambiental (ES006096), centro de genética ambiental (CEG) projecto-piloto (S.H.), Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas (AI115358) (Samba), Universidade de Prêmio de Cincinnati University Research Council (S.H.) e Universidade de Cincinnati College de medicina núcleo realce do financiamento (X. Z.).

Protocolos humanos neste estudo foram aprovados pelo Conselho de revisão institucional da Universidade de Cincinnati, e todos os métodos foram realizados em conformidade com as normas orientadoras aplicáveis e regulamentos. Amostras de sangue de doadores saudáveis foram obtidas do centro Hoxworth de sangue no centro médico da Universidade de Cincinnati.
1. Transcriptomic de criação de perfil de expostos a poluentes derivados de monócitos humanas DCs
<ol><li>Extração de RNA total de...

<ol>
	<li>Roche, P. A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+Processing+and+Presentation+Mechanisms+in+Myeloid+Cells.">Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells.</a> Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MR1+uses+an+endocytic+pathway+to+activate+mucosal-associated+invariant+T+cells.">MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells.</a> The Journal of experimental medicine. 205 (5), 1201-1211 (2008).</li><li>Nakamura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomes+are+specialized+platforms+for+bacterial+sensing+and+NOD2+signalling.">Endosomes are specialized platforms for bacterial sensing and NOD2 signalling.</a> Nature. 509 (7499), 240-244 (2014).</li><li>Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+antigen+processing.">Pathways of antigen processing.</a> Annual review of immunology. 31, 443-473 (2013).</li><li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+natural+killer+T+cells:+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions.">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li><li>Zajonc, D. 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S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+antigen+processing+in+vitro+and+in+vivo.">Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo.</a> Annual review of immunology. 23, 975-1028 (2005).</li><li>Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+immunophenotyping+for+the+Human+Immunology+Project.">Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project.</a> Nature reviews. Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).</li><li>Sharma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+endocytic+lipid+antigen+presentation+by+common+lipophilic+environmental+pollutants.">Inhibition of endocytic lipid antigen presentation by common lipophilic environmental pollutants.</a> Science Reports. 7 (1), 2085 (2017).</li><li>Boom, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids.">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> Journal of clinical microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).</li><li>Nachamkin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agilent+2100+bioanalyzer+for+restriction+fragment+length+polymorphism+analysis+of+the+Campylobacter+jejuni+flagellin+gene.">Agilent 2100 bioanalyzer for restriction fragment length polymorphism analysis of the Campylobacter jejuni flagellin gene.</a> Journal of clinical microbiology. 39 (2), 754-757 (2001).</li><li>Kaimal, V., Bardes, E. E., Tabar, S. C., Jegga, A. G., Aronow, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToppCluster:+a+multiple+gene+list+feature+analyzer+for+comparative+enrichment+clustering+and+network-based+dissection+of+biological+systems.">ToppCluster: a multiple gene list feature analyzer for comparative enrichment clustering and network-based dissection of biological systems.</a> Nucleic acids research. 38 (Web Server issue), W96-W102 (2010).</li><li>Bauer-Mehren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+genomic+information+with+biological+networks+using+Cytoscape).">Integration of genomic information with biological networks using Cytoscape).</a> Methods in molecular biology. 1021, 37-61 (2013).</li><li>Cline, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+biological+networks+and+gene+expression+data+using+Cytoscape.">Integration of biological networks and gene expression data using Cytoscape.</a> Nature protocols. 2 (10), 2366-2382 (2007).</li><li>Huang, S., Moody, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-unrestricted+T+cells+in+the+human+CD1+system.">Donor-unrestricted T cells in the human CD1 system.</a> Immunogenetics. 68 (8), 577-596 (2016).</li><li>Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Innate-Like+T+Cells+in+Tuberculosis.">Targeting Innate-Like T Cells in Tuberculosis.</a> Frontiers in immunology. 7, 594 (2016).</li><li>Moody, D. B., Porcelli, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pathways+of+CD1+antigen+presentation.">Intracellular pathways of CD1 antigen presentation.</a> Nature reviews. Immunology. 3 (1), 11-22 (2003).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Diard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+cooperative+virulence+by+the+expression+of+an+avirulent+phenotype.">Stabilization of cooperative virulence by the expression of an avirulent phenotype.</a> Nature. 494 (7437), 353-356 (2013).</li><li>Bader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proliferative+and+mature+beta-cells+in+the+islets+of+Langerhans.">Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans.</a> Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).</li><li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+imaging+software+tools.">Biological imaging software tools.</a> Nature. 9 (7), 697-710 (2012).</li><li>Costes, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+and+quantitative+measurement+of+protein-protein+colocalization+in+live+cells.">Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells.</a> Biophysical journal. 86 (6), 3993-4003 (2004).</li></ol>

Confirmação funcional do percurso gene alterado é um desafio, por causa da expressão do gene amplamente impactados envolvendo múltiplos caminhos e a dificuldade de integrar a actividade celular individual e populacional. Utilizamos a citometria de fluxo da imagem latente para especificamente teste CD1d tráfico de compartimentos endocítica. Citometria de fluxo de imagem integra a medição populacional das células e a demonstração individual da subcellular colocalization de várias proteínas. Microscopia confoc...

Apresentação de antigénios normalmente envolve proteínas intracelulares tráfico, que tem sido investigada frequentemente usando a caracterização morfológica e Caracterização fenotípica das apresentadoras de antígenos de células1,2,3 . Para integrar as vantagens da imagem latente e métodos de fenotipagem, descrevemos uma plataforma de análise de imagem em nível de população para demonstrar uma colocalization de proteína alterada em células dendríticas (DCs) e unicelulares. Na apresentação de antigénios do peptide, complexo de histocompatibilidade (MHC) classe I moléculas vincular um peptídeo curto (resíduos de 8-10) no retículo endoplasmático para ativar o CD8 convencional+ T células, enquanto moléculas de MHC classe II vincular um relativamente mais peptídeo (~ 20 resíduos) em compartimentos endocítica para ativar convencional CD4 células de+ T1,4. Em contraste, as células T de lipídios específicos são ativadas por proteínas CD1 com antígenos lipídicos carregados principalmente em compartimentos endocítica5,6. Apresentação de antigénios de lipídios requer o fornecimento de lipídios metabolitos produzidos no metabolismo lipídico7,8,9,de10 e o carregamento de metabólitos de lipídios funcionais para CD1 proteínas em compartimentos endocítica5,6. Neste contexto, diversos fatores celulares modulando a apresentação de antigénios de lipídios, especialmente na exposição ambiental de poluentes lipofílicos e distúrbios imunológicos, são essenciais para ser definido. Neste estudo, usamos transcriptomic análise, imagem de perfil e análise de imagens celular e populacional de DCs derivados de monócitos humanos para determinar a proteína endocítica tráfico contribuindo para apresentação de antigénios de lipídios na exposição de poluentes. Certamente, esta plataforma combinada pode ser aplicada para estudar proteínas subcellular tráfico e colocalization em diferentes processos biológicos.
Tecnicamente, a Localização subcellular da proteína geralmente foi demonstrada usando microscopia confocal e analisados estatisticamente em um número limitado de células detectado1,2,3,11. Além disso, citometria de fluxo tem sido amplamente aplicada a populações de células de portão com sinais co manchadas de múltiplas proteínas em um nível celular12; no entanto, este não possui uma visualização detalhada de colocalization Subcellular da proteína. Para realizar análises abrangentes e estatísticas de colocalization de proteína percentagem a nível celular e população, podemos incorporar imagens de perfis e análise de abordagens para determinar as características de colocalization de proteína com biológico relevância. Especificamente, nós usamos a citometria de fluxo de imagem para detectar o colocalization de CD1d e proteína de membrana lisossomal-associado 1 (Lamp1) proteínas neste estudo. Análise quantitativa de moléculas colocalized anteriormente era difícil a ser realizada em escala populacional. Neste estudo, adaptamos o programa ImageJ-Fiji para examinar a porcentagem de colocalization de proteína com um grande número de células coradas co nível populacional e individual celular. Especificamente, Nós medimos áreas co localizadas, intensidade e tamanho populacional para apoiar a conclusão de que a proteína CD1d em grande parte foi mantida em compartimentos endocítica atrasados do DCs humanas em exposição a um poluente lipofílicos benzo [a] pireno (BaP),13 . Este celular combinada e população de análise de imagem fornecidos resultados altamente reprodutíveis, abrangentes e estatisticamente significativos de CD1d-Lamp1 colocalization relevante para a apresentação de antigénios de lipídios inibida.
A transcriptoma do BaP-expostos DCs humanos fortemente apoiado a hipótese de que o metabolismo lipídico endocítica e CD1d endocítica tráfico foram prejudicadas em exposição BaP. Para testar esta hipótese, nós aplicamos a citometria de fluxo de imagem para o perfil de imagens da população de DC que co estavam manchadas com várias proteínas, incluindo CD1d, marcadores endocítica e marcadores de DC. Finalmente, as células co manchadas foram analisadas estatisticamente para demonstrar o percentual de intensidade e áreas de colocalization CD1d e Lamp1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1340px;" width="1340">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Transcriptomics</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td style="width:417px;">HiSeq 2500 v4</td>
			<td style="width:191px;">Illumina HiSeq system</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">ImagingStream X</td>
			<td style="width:448px;">Millipore</td>
			<td>100220</td>
			<td>Imaging flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">mirVana miRNA Isolation Kit</td>
			<td style="width:448px;">Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Total RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agilent RNA 6000 Pico Kit</td>
			<td style="width:448px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Total RNA QC analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler</td>
			<td style="width:448px;">Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>PCR, enzyme reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module&#160;</td>
			<td style="width:448px;">New England Biolab</td>
			<td></td>
			<td>PolyA RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Automated SMARTer Apollo system</td>
			<td style="width:448px;">Takara</td>
			<td></td>
			<td>PolyA RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td style="width:448px;">New England Biolab</td>
			<td></td>
			<td>Library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agencourt AMPure XP magnetic beads</td>
			<td style="width:448px;">Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>DNA purification&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:448px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Library QC, size distribution analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td style="width:448px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Library QC, size distribution analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher)</td>
			<td style="width:448px;">Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Library quantification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NEBNext Library Quant Kit</td>
			<td style="width:448px;">New England Biolab</td>
			<td></td>
			<td>Library quantification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">cBot</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Library cluster generation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot &#8211; HS</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Library cluster generation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">HiSeq 1000</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">TruSeq SBS Kit v3 - HS (50-cycles)</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7)</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td style="width:417px;">L243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5)</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td align="right" style="width:417px;">3.9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Brilliant violet 421</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td style="width:417px;">L161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">PE-anti-mouse IgG2b</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td align="right" style="width:417px;">51.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Alexa Fluor 647 (AF647)</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td style="width:417px;">CD107a(H4A3)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integrate imaging flow cytometry and transcriptomic profiling to evaluate altered endocytic cd1d trafficking

Análises populacionais da alteração morfológica e funcional de proteínas endocítica são um desafio devido à demanda de captura de imagem em uma análise de imagem de nível e estatística única célula em um nível populacional. Para superar esta dificuldade, usamos imagens citometria de fluxo e transcriptomic (RNA-seq) de criação de perfil para determinar a Localização subcellular alterada do cluster da proteína de 1D de diferenciação (CD1d) associada com expressão gênica endocítica prejudicada em humanos células dendríticas (DCs), que foram expostas à comum lipofílico ar poluente benzo [a] pireno. O colocalization de CD1d e endocítica marcador Lamp1 proteínas de milhares de células imagens capturadas com imaging citometria de fluxo foi analisada usando ideias e ImageJ-Fiji programas. Numerosas imagens celulares com proteínas CD1d e Lamp1 co manchadas foram visualizadas após retenção na CD1d+Lamp1+ DCs usando ideias. O colocalization CD1d e Lamp1 reforçada em cima BaP exposição demonstrou-se ainda mais usando thresholded scatterplots, testado com coeficientes de Mander para intensidade co localizada e plotados com base na porcentagem de áreas co localizadas usando o ImageJ-Fiji. Nossos dados fornecem uma abordagem instrumental e bioinformatic vantajosa para medir colocalization de proteína em níveis celulares único e populacionais, apoiando um resultado funcional prejudicado de transcriptomic alteração em humanos expostos a poluentes DCs.

Os poluentes lipofílicos BaP altera aglomerados endocítica gene humano DCs. humanos derivados de monócitos DCs de cada doador (n = 3) foram incubadas com BaP e classificados para DCs convencionais, que foram mais utilizados para a análise do RNA extração e transcriptomic conforme descrito . Após a normalização da expressão gênica, genes alterados entre grupos BaP-expostos e não-expostos foram agrupados de acordo com a correlação funcional de genes diferencialmente expressos....

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Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking

Citometria de fluxo de imagem fornece uma abordagem ideal para detectar a alteração morfológica e funcional das células em níveis individuais e populacionais. Função endocítica interrompida para apresentação de antigénios de lipídios em células dendríticas humanas expostas ao poluente foi demonstrada com um combinado transcriptomic perfis de expressão genética e morfológica demonstração do tráfico de proteína.

Integrar a citometria de fluxo de imagem e Transcriptomic de criação de perfil para avaliar alterados CD1d endocítica tráfico

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single ...

Esses métodos integram a análise de imagem de sequenciamento e citometria de fluxo da próxima geração. Pode ajudar a responder perguntas interessantes, como se algumas alterações fenotípicas estão implicando, em vez do transcriptome, especialmente no ambiente de exposição ao poluente. A principal vantagem deste método simples para nós é que podemos usá-lo para medir a colocalização de proteína biologicamente importante, para interpretar os resultados da expressão genética diferencial chave em um nível funcional.As implicações dessa técnica se estendem ao diagnóstico de desfechos patológicos e toxicológicos. Como uma abordagem normal de imager, forsee tem a capacidade de conectar expressão genética à função proteica. Geralmente, indivíduos novos nesse método lutarão devido às altas demandas técnicas da análise de imagem e transcrição.Para sequenciar a biblioteca de células dendríticas derivadas do monócito humano, primeiro carregue os reagentes sequenciamento e indexação na biosíntese e na indexação dos racks de reagentes, respectivamente, e coloque os racks em um banho de água de nível laboratorial por uma hora, até que todo o gelo tenha derretido, e os reagentes sejam misturados completamente. Enquanto os reagentes estão descongelando, ligue o sequenciador, conectando o computador a uma unidade de rede quando a unidade Não Ejetar aparecer e inicie o software de controle do sequenciador. Em seguida, adicione cerca de 100 mililitros de solução de lavagem de manutenção a cada uma das garrafas no rack de reagente de biosíntese de sequenciamento, e enrosque uma tampa de funil em cada garrafa.Adicione aproximadamente 12 mililitros de solução de lavagem de manutenção a cada tubo cônico de 15 mililitros no rack de reagente de indexação e descarte as tampas. Em seguida, carregue os dois racks no sequenciador. Selecione Lavagem de manutenção dentro do software de controle do sequenciador e siga as instruções para limpar o sistema de fluidos do sequenciador.Use uma lanterna para inspecionar visualmente a célula de fluxo para obter bolhas que passam pelas pistas, para ter certeza de que não há vazamento. Quando a sequência de lavagem estiver concluída, abra a guia Sequência e inicie uma nova execução, direcionando os dados de saída para uma unidade de rede. Carregue uma folha de amostra para demultiplexação e insira as informações apropriadas do reagente.Use uma célula de fluxo usada para preparar o sistema, com os reagentes de sequenciamento. Uma vez que a geração de cluster esteja completa, remova a célula de fluxo. E pulverizar levemente a célula com água.Limpe a célula de fluxo seca com papel de lente, seguida de um spray leve com 95% de etanol. Depois de limpar a célula de fluxo secar novamente, verifique a superfície da célula de fluxo contra a luz para ter certeza de que ela está limpa, sem detritos ou resíduos de sal. Quando o passo principal estiver concluído, carregue a célula de fluxo agrupada e inicie o sequenciamento.O software do visualizador de análise de sequência será automaticamente iniciado. Cerca de 26 horas depois, monitore a qualidade dos dados de sequenciamento através do software de controle de alta sequência e a análise de sequenciamento visualize o software para avaliar a qualidade dos dados e para qualquer solução de problemas. Em seguida, quando a sequência estiver concluída, troque a junta da célula de fluxo e realize uma lavagem de manutenção antes de iniciar a próxima execução.Após o fluxo de imagens citométricas das células dendríticas expostas ao poluente, abra ImageJ Fiji e mescla as 100 imagens celulares salvas para os grupos de amostras de células dendríticas humanas não expostas e expostas a poluentes em arquivos individuais de acordo com o grupo de tratamento. Para analisar a colocalização do CD1d e do Lamp1 dentro das duas populações, abra a imagem celular de 100 células expostas ao poluente e selecione Canais de Imagem, Cor e Split para dividir a imagem em duas imagens individuais com um único fluoróforo por canal. Para criar um gráfico de dispersão dos pixels colocalizados, selecione Analisar, Colocalização e Limiar de Colocalização e pressione a Tela de Impressão para salvar o plot de dispersão.Para calcular o coeficiente de colocalização do Mander para cada imagem unicelular, use a ferramenta de seleção oval para selecionar uma imagem unicelular no arquivo de imagem com os canais divididos e selecione Analisar, Colocalização e Limiar de Colocalização novamente. Em seguida, selecione o Canal 1 na caixa de diálogo para a região de interesse e clique em OK. Quando o coeficiente tiver sido calculado para todas as 100 imagens celulares, importe os resultados em uma planilha apropriada e repita a análise para a amostra celular não exposta de controle. Usando sequenciamento de RNA e análises de dados transcriptômicos, vários grandes aglomerados genéticos alterados, incluindo metabolismo lipídico e funções endócticas foram identificados nos DCs expostos ao poluente.No nível de imagem celular individual, as células dendríticas positivas do HLADR CD11c podem ser fechadas, de acordo com sua coexpressão CD1d e Lamp1. O controle de células dendríticas não expostas demonstram uma colocalização mínima da proteína CD1d e Lamp1, indicando um nível basal de tráfico endocítico CD1d, e um alto nível de expressão superficial sob condições fisiológicas. Considerando que o CD1d é retido nos compartimentos endocíticos tardios de células dendríticas expostas a poluentes, confirmando perfis genéticos endocíticos alterados nesta população celular experimental.Depois de fundir as imagens celulares individuais em um único arquivo de imagem, as imagens individuais podem ser divididas de acordo com sua expressão fluorófora, e a colocalização da intensidade do pixel entre os dois canais pode ser visualizada em um gráfico de dispersão. O grau de colocalização entre as proteínas CD1d e Lamp1 nos dois grupos de tratamento pode então ser quantificado usando os coeficientes de Mander. Se a intensidade proteica for hetergênea entre as áreas colocalizadas e não-colocalizadas, a intensidade colocalizada não será paralela às áreas colocalizadas, por isso também é importante avaliar ainda mais a colocalização das duas proteínas, com base na intensidade do pixel.Uma vez dominada, a análise da imagem pode ser concluída em duas horas, e a configuração de sequenciamento de RNA pode ser concluída em três horas, se cada técnica for realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que todos os reagentes estão devidamente carregados nas posições corretas, e que não há vazamento no sequenciador. Após esse procedimento, outros métodos, como micro RNA, exome ou sequenciamento de células de mastro podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre expressão global de micro RNA, mutação genética ou metilação de DNA, respectivamente.Assim, após seu desenvolvimento, essa técnica ajudará os pesquisadores no campo da análise de imagens celulares, e sequenciamento de próxima geração para explorar o efeito do poluente ambiental na expressão genética e na função proteica. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como configurar o sequenciamento da próxima geração, e a análise do imager da colocalização de proteínas. Não se esqueça que trabalhar com um produto químico tóxico em amostras de sangue humano pode ser extremamente perigoso.Precauções como o uso de uma capa de fumaça química e equipamentos de proteção individual devem ser sempre tomadas na realização desses procedimentos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Análise por Citometria de fluxo das células imunológicas Dentro aortas murino

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Imunologia e Infecção

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Humano In Vitro Supressão como ferramenta de triagem para o reconhecimento de um Estado precoce de desequilíbrio imunológico

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Baseada em células de Citometria de Fluxo Ensaio medir citotóxicos Atividade

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Baseada em imagem Técnica de Citometria de Fluxo para avaliar as mudanças na função de granulócitos<em&gt; In Vitro</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

Um protocolo simples e rápido para não enzimática Separar frescos Tecidos Humanos para a Análise de infiltrar Linfócitos

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Classificação de células activadas por fluorescência Para a purificação de células dendríticas plasmocitï¿½des do rato de Medula Óssea

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Murino Linfócitos Rotulagem por<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-Antibody Receptor Segmentação para<em&gt; In Vivo</em&gt; Tráfico celular por PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Medição do T celular aloreactividade usando imagens de Citometria de Fluxo

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Análise qualitativa e quantitativa de sinapse imunológica no sistema humano usando a imagem latente de citometria de fluxo

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Visualizando intracelular SNARE tráfico pela vida de fluorescência, microscopia de imagem

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...