Name: integrate imaging flow cytometry and transcriptomic profiling to evaluate altered endocytic cd1d trafficking
Uploaded: 2018-10-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking at JoVE.com

Авторы благодарят Роберт Giulitto (центр крови Hoxworth) для образцов крови человека и читает доктор Лян Niu для нормализации экспрессии генов. Мы также благодарим Грантовая поддержка от национального института окружающей среды медицинских наук (ES006096), центр экологической генетики (ГОЗ) экспериментального проекта (с.х.), Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний (AI115358) (с.х.), университет Премия Совета исследований Университета Цинциннати (с.х.) и университета из Цинциннати колледж медицины Core Укрепление финансирования (X. Z.).

Человека протоколов в этом исследовании были утверждены институциональных Наблюдательный Совет Университета Цинциннати и все методы были исполнены в соответствии с соответствующих руководящих принципов и правил. Образцы крови здоровых доноров были получены из центра крови Hoxworth в м?...

<ol>
	<li>Roche, P. A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+Processing+and+Presentation+Mechanisms+in+Myeloid+Cells.">Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells.</a> Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MR1+uses+an+endocytic+pathway+to+activate+mucosal-associated+invariant+T+cells.">MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells.</a> The Journal of experimental medicine. 205 (5), 1201-1211 (2008).</li><li>Nakamura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomes+are+specialized+platforms+for+bacterial+sensing+and+NOD2+signalling.">Endosomes are specialized platforms for bacterial sensing and NOD2 signalling.</a> Nature. 509 (7499), 240-244 (2014).</li><li>Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+antigen+processing.">Pathways of antigen processing.</a> Annual review of immunology. 31, 443-473 (2013).</li><li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+natural+killer+T+cells:+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions.">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li><li>Zajonc, D. M., Kronenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1+mediated+T+cell+recognition+of+glycolipids.">CD1 mediated T cell recognition of glycolipids.</a> Current opinion in structural biology. 17 (5), 521-529 (2007).</li><li>Cox, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+cellular+lipids+bound+to+human+CD1d+molecules.">Determination of cellular lipids bound to human CD1d molecules.</a> PloS one. 4 (5), e5325 (2009).</li><li>Yuan, W., Kang, S. J., Evans, J. E., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+lipid+ligands+associated+with+human+CD1d+targeted+to+different+subcellular+compartments.">Natural lipid ligands associated with human CD1d targeted to different subcellular compartments.</a> Journal of immunology. 182 (8), 4784-4791 (2009).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+deoxyceramides+and+diacylglycerols+as+CD1b+scaffold+lipids+among+diverse+groove-blocking+lipids+of+the+human+CD1+system.">Discovery of deoxyceramides and diacylglycerols as CD1b scaffold lipids among diverse groove-blocking lipids of the human CD1 system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19335-19340 (2011).</li><li>de Jong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1a-autoreactive+T+cells+recognize+natural+skin+oils+that+function+as+headless+antigens.">CD1a-autoreactive T cells recognize natural skin oils that function as headless antigens.</a> Nature. 15 (2), 177-185 (2014).</li><li>Trombetta, E. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+antigen+processing+in+vitro+and+in+vivo.">Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo.</a> Annual review of immunology. 23, 975-1028 (2005).</li><li>Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+immunophenotyping+for+the+Human+Immunology+Project.">Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project.</a> Nature reviews. Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).</li><li>Sharma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+endocytic+lipid+antigen+presentation+by+common+lipophilic+environmental+pollutants.">Inhibition of endocytic lipid antigen presentation by common lipophilic environmental pollutants.</a> Science Reports. 7 (1), 2085 (2017).</li><li>Boom, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids.">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> Journal of clinical microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).</li><li>Nachamkin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agilent+2100+bioanalyzer+for+restriction+fragment+length+polymorphism+analysis+of+the+Campylobacter+jejuni+flagellin+gene.">Agilent 2100 bioanalyzer for restriction fragment length polymorphism analysis of the Campylobacter jejuni flagellin gene.</a> Journal of clinical microbiology. 39 (2), 754-757 (2001).</li><li>Kaimal, V., Bardes, E. E., Tabar, S. C., Jegga, A. G., Aronow, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToppCluster:+a+multiple+gene+list+feature+analyzer+for+comparative+enrichment+clustering+and+network-based+dissection+of+biological+systems.">ToppCluster: a multiple gene list feature analyzer for comparative enrichment clustering and network-based dissection of biological systems.</a> Nucleic acids research. 38 (Web Server issue), W96-W102 (2010).</li><li>Bauer-Mehren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+genomic+information+with+biological+networks+using+Cytoscape).">Integration of genomic information with biological networks using Cytoscape).</a> Methods in molecular biology. 1021, 37-61 (2013).</li><li>Cline, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+biological+networks+and+gene+expression+data+using+Cytoscape.">Integration of biological networks and gene expression data using Cytoscape.</a> Nature protocols. 2 (10), 2366-2382 (2007).</li><li>Huang, S., Moody, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-unrestricted+T+cells+in+the+human+CD1+system.">Donor-unrestricted T cells in the human CD1 system.</a> Immunogenetics. 68 (8), 577-596 (2016).</li><li>Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Innate-Like+T+Cells+in+Tuberculosis.">Targeting Innate-Like T Cells in Tuberculosis.</a> Frontiers in immunology. 7, 594 (2016).</li><li>Moody, D. B., Porcelli, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pathways+of+CD1+antigen+presentation.">Intracellular pathways of CD1 antigen presentation.</a> Nature reviews. Immunology. 3 (1), 11-22 (2003).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Diard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+cooperative+virulence+by+the+expression+of+an+avirulent+phenotype.">Stabilization of cooperative virulence by the expression of an avirulent phenotype.</a> Nature. 494 (7437), 353-356 (2013).</li><li>Bader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proliferative+and+mature+beta-cells+in+the+islets+of+Langerhans.">Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans.</a> Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).</li><li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+imaging+software+tools.">Biological imaging software tools.</a> Nature. 9 (7), 697-710 (2012).</li><li>Costes, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+and+quantitative+measurement+of+protein-protein+colocalization+in+live+cells.">Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells.</a> Biophysical journal. 86 (6), 3993-4003 (2004).</li></ol>

Функциональные подтверждения пути измененный ген является сложной задачей, из-за широко влияние генов выражения с участием нескольких путей и трудности интеграции индивидуальных и популяционной клеточной деятельности. Мы использовали визуализации проточной цитометрии специально т...

Презентация антигена, как правило, включает внутриклеточных белков людьми, который часто исследовано с помощью морфологических характеристик и фенотипические профилирование антиген представляющих клеток в1,2,3 . Чтобы интегрировать преимущества изображений и методов фенотипа, мы описываем анализа платформа отображения информации на одну ячейку и численности населения продемонстрировать измененный белок colocalization дендритных клеток человека (DCs). В презентации антигена пептидный комплекс гистосовместимости (MHC) сорта молекул привязать короткие пептиды (8-10 остатков) в эндоплазматический ретикулум активировать обычных CD8 клетки+ T, хотя II молекул MHC класса привязки относительно больше пептид (~ 20 остатков) в endocytic отсеках для активации обычных CD4 клеток+ T1,4. В противоположность этому липидов специфичные Т-клетки активируются CD1 белки с антигенами липидов, главным образом в endocytic отсеков5,6. Презентация антигена липидов требует питания липидов метаболитов в липидного метаболизма7,8,9,10 и загрузка функциональных липидов метаболитов CD1 белки в endocytic отсеков5,6. В этом контексте различных клеточных факторов, модулирует презентации антигена липидов, особенно в экологические воздействия липофильных загрязнителей и иммунных, важно определить. В этом исследовании мы использовали транскриптомики анализ, профилирование изображения и клеточных и популяционной изображений анализ человека моноцитарных DCs для определения торговли endocytic белка, способствует презентации антигена липидов в воздействия широкого круга загрязнителей. Конечно это комбинированные платформы может применяться для изучения торговли внутриклеточных белков и colocalization в различных биологических процессах.
Технически локализация внутриклеточных белков обычно была продемонстрирована с помощью конфокальной микроскопии и статистически проанализированы в ограниченное количество обнаруженных клетки1,2,3,11. Кроме того проточной цитометрии широко применяется для ворот клеточных популяций с совместно окрашенных сигналов нескольких белков на клеточном уровне12; Однако это не хватает подробной визуализации внутриклеточных белков colocalization. Для достижения всеобъемлющего и статистический анализ процент белка colocalization на уровнях как клеточного, так и населения, мы внедряем изображений профилирования и анализ подходов для определения функции белка colocalization с биологического актуальность. В частности, мы используем изображений проточной цитометрии для обнаружения colocalization CD1d и лизосомальных связанные мембранный белок 1 (Lamp1) белки в этом исследовании. Количественный анализ colocalized молекул был ранее трудно выполнить в популяционной масштабе. В этом исследовании мы адаптировали ImageJ-Фиджи программа для изучения процент белка colocalization с большим числом совместно окрашенных клеток на популяционной и индивидуальных клеточном уровнях. В частности мы измерили совместно локализованных участков, интенсивности и популяционной размер позволяет поддержать вывод о значительной степени сохранить CD1d белка в конце endocytic отсеках человека РС в подверженности липофильных загрязнителей бензо [а] пирена (БАП)13 . Этот комбинированный клеточного и населения, анализ изображений предоставляет высокую воспроизводимость, всеобъемлющий и статистически значимые результаты CD1d-Lamp1 colocalization отношение к презентации антигена тормозится липидов.
Транскриптом БАП облученных людей DCs решительно поддержали гипотезу, что endocytic липидного обмена и CD1d endocytic людьми были нарушениями в экспозиции БАП. Чтобы проверить эту гипотезу, мы применили изображений проточной цитометрии профилирование изображения DC населения, которые окрашивали совместно с несколькими белков, включая CD1d, endocytic маркеры и маркеры DC. Наконец, совместно окрашенные клетки были статистически проанализированы продемонстрировать процент от интенсивности и районов CD1d и Lamp1 colocalization.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1340px;" width="1340">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Transcriptomics</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td style="width:417px;">HiSeq 2500 v4</td>
			<td style="width:191px;">Illumina HiSeq system</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">ImagingStream X</td>
			<td style="width:448px;">Millipore</td>
			<td>100220</td>
			<td>Imaging flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">mirVana miRNA Isolation Kit</td>
			<td style="width:448px;">Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Total RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agilent RNA 6000 Pico Kit</td>
			<td style="width:448px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Total RNA QC analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler</td>
			<td style="width:448px;">Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>PCR, enzyme reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module&#160;</td>
			<td style="width:448px;">New England Biolab</td>
			<td></td>
			<td>PolyA RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Automated SMARTer Apollo system</td>
			<td style="width:448px;">Takara</td>
			<td></td>
			<td>PolyA RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td style="width:448px;">New England Biolab</td>
			<td></td>
			<td>Library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agencourt AMPure XP magnetic beads</td>
			<td style="width:448px;">Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>DNA purification&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:448px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Library QC, size distribution analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td style="width:448px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Library QC, size distribution analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher)</td>
			<td style="width:448px;">Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Library quantification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NEBNext Library Quant Kit</td>
			<td style="width:448px;">New England Biolab</td>
			<td></td>
			<td>Library quantification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">cBot</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Library cluster generation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot &#8211; HS</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Library cluster generation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">HiSeq 1000</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">TruSeq SBS Kit v3 - HS (50-cycles)</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7)</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td style="width:417px;">L243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5)</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td align="right" style="width:417px;">3.9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Brilliant violet 421</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td style="width:417px;">L161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">PE-anti-mouse IgG2b</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td align="right" style="width:417px;">51.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Alexa Fluor 647 (AF647)</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td style="width:417px;">CD107a(H4A3)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integrate imaging flow cytometry and transcriptomic profiling to evaluate altered endocytic cd1d trafficking

Популяционной анализа морфологических и функциональных изменений endocytic белков сложной из-за спроса захвата изображения на одну ячейку анализа уровня и статистические изображений на популяционной уровне. Для преодоления этой трудности, мы использовали визуализации проточной цитометрии и транскриптомики, профилирование (РНК seq) для определения измененных субцеллюлярные локализации Кластер дифференцировки 1d белка (CD1d) связанные с нарушением endocytic ген выражение в человека дендритные клетки (DCs), которые были подвержены общей липофильных воздушных загрязнителей бензо [а] пирена. Colocalization CD1d и endocytic маркер Lamp1 белков из тысячи клеток изображения, снятые с imaging проточной цитометрии было проанализировано, используя идеи и ImageJ-Фиджи программы. Многочисленные сотовой изображения с совместно окрашенных CD1d и Lamp1 белки были визуализирована после стробирования на CD1d+Lamp1+ РС с помощью идей. Расширение CD1d и Lamp1 colocalization на Бат экспозиции далее была продемонстрирована с помощью показатели scatterplots, протестированы с Мандер в коэффициенты для совместного локализованных интенсивности и нанесены на основе доли совместно локализованных участков с помощью ImageJ-Фиджи. Наши данные обеспечивают выгодно инструментальная и bioinformatic подход для измерения colocalization белка на как одного, так и популяционной сотовой уровнях, поддерживая зрением функциональный результат транскриптомики изменения в подвергшихся воздействию загрязнителей человека РСУ.

Липофильные загрязнителей БАП изменяет endocytic гена кластеров в DCs моноцитарных человека DCs. человека от каждого донора (n = 3) были инкубировали с Бат и сортируются для обычных РСУ, которые использовались для РНК добыча и транскриптомики анализа как описано далее . После н?...

Watch this Scientific Journal Video about Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking at JoVE.com

Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking

Imaging проточной цитометрии предоставляет идеальный подход для выявления морфологических и функциональных изменений клеток на индивидуальном и популяционной уровнях. Нарушается функция endocytic для презентации антигена липидов в подвергшихся воздействию загрязнителей дендритных клетках человека была продемонстрирована с профилирования комбинированных транскриптомики экспрессии генов и морфологических демонстрации оборота белка.

Интегрировать изображений проточной цитометрии и транскриптомики, профилирование для оценки измененных Endocytic CD1d торговля

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single ...

Эти методы интегрируют секвенирование и анализ цитометрии потока. Это может помочь ответить на интересные вопросы, как ли некоторые фенотипические изменения причастны, а не транскриптом, особенно в среде воздействия загрязняющих веществ. Основным преимуществом этого простого метода для нас является то, что мы можем использовать его для измерения колокализации биологически важного белка, для интерпретации результатов экспрессии генов ключевых дифференциалов на функциональном уровне.Последствия этого метода распространяются на диагностику патологических и токсикологических исходов. Как нормальный подход imager, forsee имеет способность соединить выражение гена к функции протеина. Как правило, люди, новые для этого метода будет бороться из-за высоких технических требований изображения и транскриптомного анализа.Чтобы секвенировать биоцит человека, полученный дендритной библиотекой клеток, сначала загрузите секвенирование и индексацию реагентов на секвенирование биосинтеза и индексацию реагентов, соответственно, и поместите стеллажи в ванну для воды лабораторного класса в течение одного часа, пока весь лед не растает, и реагенты тщательно перемешаны. В то время как реагенты оттаивают, питание на секвенсоре, подключение компьютера к сетевому диску, когда не выбрасывается диск появляется, и запуск программного обеспечения управления секвенсором. Далее добавьте около 100 миллилитров раствора для мытья технического обслуживания к каждой из бутылок в секвенировании биосинтеза реагентной стойки, и винт крышки воронки на каждой бутылке.Добавьте приблизительно 12 миллилитров раствора для мытья технического обслуживания в каждую 15 миллилитровую коническую трубку в стойку для индексирования реагентов и отбросьте колпачки. Затем загрузите обе стойки на секвенсор. Выберите техническое обслуживание мыть в программном обеспечении управления секвенсором, и следовать инструкциям для очистки системы жидкости секвенсора.Используйте фонарик, чтобы визуально проверить ячейку потока для пузырьков, проходящих через полосы движения, чтобы убедиться, что нет утечки. Когда последовательность стирки будет закончена, откройте вкладку Sequence и запустите новый запуск, направив выходные данные на сетевой диск. Загрузите образец листа для демултлексирования и введите соответствующую информацию о реагентах.Используйте использованную ячейку потока для подготовки системы с помощью реагентов секвенирования. Как только генерация кластера будет завершена, удалите ячейку потока. И слегка распылить клетку водой.Протрите ячейку потока сухой с бумагой объектива, а затем легкий спрей с 95%этанола. После вытирания потока ячейки сухой снова, проверить поверхность потока ячейки против света, чтобы убедиться, что она чиста, без мусора или остатков соли. Когда первый шаг будет закончен, загрузите кластерную ячейку потока и начните секвенирование.Программное обеспечение просмотра анализа последовательности будет автоматически запущено. Около 26 часов спустя, контролировать качество секвенирования данных с помощью программного обеспечения управления высокой последовательности, и секвенирования анализа просмотра программного обеспечения для оценки качества данных, а также для любого устранения неполадок. Затем, когда последовательность закончена, измените прокладку ячейки потока и выполните ремонтную стирку перед началом следующего запуска.После потока цитометрической визуализации загрязняющих дендритических клеток, откройте ImageJ Фиджи, и объединить 100 сохраненных изображений клеток для неразоблачных и загрязняющих веществ подвергаются человека дендритных групп клеток выборки в отдельные файлы в соответствии с группой обработки. Чтобы проанализировать CD1d и колокализацию Лампы1 в двух популяциях, откройте изображение 100 слитых клеток, подвергшихся воздействию загрязняющих веществ, и выберите каналы изображения, цвета и сплита, чтобы разделить изображение на два отдельных изображения с помощью одного флюорофора на канал. Чтобы создать участок рассеяния колокализованных пикселей, выберите Analyze, Colocalization и Colocalization Threshold, а также нажмите Print Screen, чтобы сохранить участок рассеяния.Чтобы вычислить коэффициент колокализации Мандера для каждого одноклеточного изображения, используйте инструмент овального отбора, чтобы выбрать одноклеточное изображение в файле изображения с разделенными каналами, а также снова выбрать порог анализа, колокализации и колокализации. Затем выберите первый канал из окна диалога для области интересов и нажмите OK. Когда коэффициент был рассчитан для всех 100 изображений ячейки, импортировать результаты в соответствующую таблицу, и повторить анализ для контроля неразоблаченой выборки клеток. С помощью секвенирования РНК и анализа транскриптомных данных в ДК, подвергшихся воздействию загрязняющих веществ, были выявлены несколько крупных измененных генных кластеров, включая липидный метаболизм и эндоцитные функции.На индивидуальном уровне изображения клетки, HLADR положительные CD11c положительные дендритные клетки могут быть закрыты, в соответствии с их CD1d и Лампа1 coexpression. Контроль неразоблаченные дендритные клетки демонстрируют минимальную колокализацию белка CD1d и Lamp1, что указывает на базальный уровень эндоцитической торговли CD1d и высокий уровень экспрессии поверхности в физиологических условиях. В то время как CD1d сохраняется в поздних эндоцитных отсеках загрязняющих дендритических клеток, подтверждая измененные профили эндоцитных генов в этой экспериментальной популяции клеток.После слияния отдельных клеточных изображений в единый файл изображения, отдельные изображения могут быть разделены в соответствии с их выражением флюорофора, и колокализация интенсивности пикселей между двумя каналами может быть визуализирована в участке рассеяния. Степень колокализации между белками CD1d и Lamp1 в двух группах лечения может быть количественно с использованием коэффициентов Мандера. Если интенсивность белка является неоднородной между колокализованными и некокализованными областями, колокализованная интенсивность не будет параллельно колокализованным участкам, поэтому также важно дополнительно оценить колокализацию двух белков, основанную на интенсивности пикселей.После освоения анализ изображения может быть завершен в течение двух часов, а установка секвенирования РНК может быть завершена в течение трех часов, если каждый метод выполняется должным образом. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы убедиться, что все реагенты должным образом загружены в правильном положении, и что нет утечки в секвенсоре. После этой процедуры, другие методы, такие как микро РНК, экзом, или секвенирование тучных клеток могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы о глобальной экспрессии микро РНК, мутации генов, или метилирования ДНК, соответственно.Таким образом, после его развития, этот метод поможет исследователям в области клеточного анализа изображений, а также секвенирования следующего поколения, чтобы исследовать влияние загрязнителя окружающей среды на экспрессию генов и белковую функцию. После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как настроить следующее поколение секвенирования, и имиджер анализ белка колокализации. Не забывайте, что работа с токсичными химическими веществами загрязняющих веществ в образцах крови человека может быть чрезвычайно опасным.Такие меры предосторожности, как использование химического дыма капот, и средства индивидуальной защиты, всегда должны быть приняты при выполнении этих процедур.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Проточной цитометрии анализа иммунных клеток мышей В аорты

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Человек In Vitro Борьбе как инструмент для скрининга Признание ранней стадии иммунного дисбаланса

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Клеточная проточной цитометрии измерить цитотоксическую активность

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Изображение на основе проточной цитометрии Методика оценки изменений в Гранулоцита функции<em&gt; In Vitro</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

Простой и быстрый протокол к неферментативно Диссоциируют Свежие тканей человека для анализа разведку в лимфоцитах

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Флуоресценция активированных сортировки клеток для очистки плазмоцитов дендритных клеток из костного мозга мыши

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Мышиные лимфоцит Этикетировочное по<sup&gt; 64</sup&gt; Си-антитело к рецептору Ориентация на<em&gt; В Vivo</em&gt; Cell Торговля ПЭТ / КТ

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Измерение Т-клетки с помощью визуализации аллореактивности проточной цитометрии

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Качественный и количественный анализ иммунной синапсов в системе человека с использованием визуализации проточной цитометрии

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Визуализация внутриклеточных SNARE людьми флуоресценции жизни изображений микроскопия

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...