Name: integrate imaging flow cytometry and transcriptomic profiling to evaluate altered endocytic cd1d trafficking
Uploaded: 2018-10-29T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking at JoVE.com

Yazarlar Robert Giulitto (Hoxworth kan Merkezi) insan kan örnekleri için teşekkür ederiz ve Dr Liang Niu gen ekspresyonu normalleştirme için okur. Biz de teşekkür hibe destek üzerinden Ulusal Çevre Sağlık Bilimler Enstitüsü (ES006096), Merkez çevre genetik (CEG) pilot proje için (S.H.), Ulusal Enstitüsü alerji ve enfeksiyon hastalıkları (AI115358) (S.H.), University of Cincinnati Üniversitesi Araştırma Konseyi Ödülü (S.H.) ve University of Cincinnati üniversite tıp çekirdek geliştirme fon (X. Z.).

Bu çalışmanın insan iletişim kuralları Cincinnati Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulca kabul edildi ve tüm yöntemleri ilgili kurallara ve düzenlemelere uygun şekilde gerçekleştirilmiştir. Kan örnekleri sağlıklı bağışçılardan Cincinnati Üniversitesi Tıp Merkezi'nde Hoxworth kan merkezinden elde edilmiştir.
1. Transcriptomic kirletici günese maruz kalan insan monosit kaynaklı DCs profil oluşturma
<ol><li>BaP maruz DCs toplam RNA çıkarımı<ol>
<li>İnsan DCs s...

<ol>
	<li>Roche, P. A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+Processing+and+Presentation+Mechanisms+in+Myeloid+Cells.">Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells.</a> Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MR1+uses+an+endocytic+pathway+to+activate+mucosal-associated+invariant+T+cells.">MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells.</a> The Journal of experimental medicine. 205 (5), 1201-1211 (2008).</li><li>Nakamura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomes+are+specialized+platforms+for+bacterial+sensing+and+NOD2+signalling.">Endosomes are specialized platforms for bacterial sensing and NOD2 signalling.</a> Nature. 509 (7499), 240-244 (2014).</li><li>Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+of+antigen+processing.">Pathways of antigen processing.</a> Annual review of immunology. 31, 443-473 (2013).</li><li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+natural+killer+T+cells:+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions.">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li><li>Zajonc, D. M., Kronenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1+mediated+T+cell+recognition+of+glycolipids.">CD1 mediated T cell recognition of glycolipids.</a> Current opinion in structural biology. 17 (5), 521-529 (2007).</li><li>Cox, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+cellular+lipids+bound+to+human+CD1d+molecules.">Determination of cellular lipids bound to human CD1d molecules.</a> PloS one. 4 (5), e5325 (2009).</li><li>Yuan, W., Kang, S. J., Evans, J. E., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+lipid+ligands+associated+with+human+CD1d+targeted+to+different+subcellular+compartments.">Natural lipid ligands associated with human CD1d targeted to different subcellular compartments.</a> Journal of immunology. 182 (8), 4784-4791 (2009).</li><li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+deoxyceramides+and+diacylglycerols+as+CD1b+scaffold+lipids+among+diverse+groove-blocking+lipids+of+the+human+CD1+system.">Discovery of deoxyceramides and diacylglycerols as CD1b scaffold lipids among diverse groove-blocking lipids of the human CD1 system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19335-19340 (2011).</li><li>de Jong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD1a-autoreactive+T+cells+recognize+natural+skin+oils+that+function+as+headless+antigens.">CD1a-autoreactive T cells recognize natural skin oils that function as headless antigens.</a> Nature. 15 (2), 177-185 (2014).</li><li>Trombetta, E. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+antigen+processing+in+vitro+and+in+vivo.">Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo.</a> Annual review of immunology. 23, 975-1028 (2005).</li><li>Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+immunophenotyping+for+the+Human+Immunology+Project.">Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project.</a> Nature reviews. Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).</li><li>Sharma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+endocytic+lipid+antigen+presentation+by+common+lipophilic+environmental+pollutants.">Inhibition of endocytic lipid antigen presentation by common lipophilic environmental pollutants.</a> Science Reports. 7 (1), 2085 (2017).</li><li>Boom, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids.">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> Journal of clinical microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).</li><li>Nachamkin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agilent+2100+bioanalyzer+for+restriction+fragment+length+polymorphism+analysis+of+the+Campylobacter+jejuni+flagellin+gene.">Agilent 2100 bioanalyzer for restriction fragment length polymorphism analysis of the Campylobacter jejuni flagellin gene.</a> Journal of clinical microbiology. 39 (2), 754-757 (2001).</li><li>Kaimal, V., Bardes, E. E., Tabar, S. C., Jegga, A. G., Aronow, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToppCluster:+a+multiple+gene+list+feature+analyzer+for+comparative+enrichment+clustering+and+network-based+dissection+of+biological+systems.">ToppCluster: a multiple gene list feature analyzer for comparative enrichment clustering and network-based dissection of biological systems.</a> Nucleic acids research. 38 (Web Server issue), W96-W102 (2010).</li><li>Bauer-Mehren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+genomic+information+with+biological+networks+using+Cytoscape).">Integration of genomic information with biological networks using Cytoscape).</a> Methods in molecular biology. 1021, 37-61 (2013).</li><li>Cline, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+biological+networks+and+gene+expression+data+using+Cytoscape.">Integration of biological networks and gene expression data using Cytoscape.</a> Nature protocols. 2 (10), 2366-2382 (2007).</li><li>Huang, S., Moody, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-unrestricted+T+cells+in+the+human+CD1+system.">Donor-unrestricted T cells in the human CD1 system.</a> Immunogenetics. 68 (8), 577-596 (2016).</li><li>Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Innate-Like+T+Cells+in+Tuberculosis.">Targeting Innate-Like T Cells in Tuberculosis.</a> Frontiers in immunology. 7, 594 (2016).</li><li>Moody, D. B., Porcelli, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pathways+of+CD1+antigen+presentation.">Intracellular pathways of CD1 antigen presentation.</a> Nature reviews. Immunology. 3 (1), 11-22 (2003).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Diard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+of+cooperative+virulence+by+the+expression+of+an+avirulent+phenotype.">Stabilization of cooperative virulence by the expression of an avirulent phenotype.</a> Nature. 494 (7437), 353-356 (2013).</li><li>Bader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+proliferative+and+mature+beta-cells+in+the+islets+of+Langerhans.">Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans.</a> Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).</li><li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+imaging+software+tools.">Biological imaging software tools.</a> Nature. 9 (7), 697-710 (2012).</li><li>Costes, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+and+quantitative+measurement+of+protein-protein+colocalization+in+live+cells.">Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells.</a> Biophysical journal. 86 (6), 3993-4003 (2004).</li></ol>

Fonksiyonel onay döngüsünün bir değişmiş gen içeren birden çok yolları ve bireysel ve populational hücresel aktiviteler tümleştirmek için zorluk yaygın olarak etkilenen gen ekspresyonu nedeniyle meydan okuyor. Özellikle test CD1d endositik bölmeleri kaçakçılığı görüntüleme akış sitometresi çalıştırmaya başladık. Akış Sitometresi Imaging hücre populational ölçüm ve birden çok proteinlerin hücre altı colocalization bireysel gösterimi bütünleştirir. Confocal mikroskobu daha ön...

Antijen sunumu genelde kez morfolojik karakterizasyonu ve fenotipik antijen sunan hücreler1,2,3 profil oluşturma kullanarak soruşturma kaçakçılığı, hücre içi protein içerir . Görüntüleme ve fenotipleme yöntemleri avantajları birleştirmek için bir görüntüleme analizi platform tek hücre ve bir değişmiş protein colocalization insan dendritik hücreler (DC) olarak göstermek için nüfus düzeyleri açıklanmaktadır. Peptid antijen sunumu, MHC kompleksi (MHC) sınıf ı molekülleri kısa peptid (8-10 artıkları) endoplazmik geleneksel CD8 etkinleştirmek için bağlamak+ T hücreleri, MHC sınıf II moleküller nispeten daha uzun bağlamak iken peptid (~ 20 artıkları) geleneksel CD4 etkinleştirmek için endositik bölmeleri içinde+ T hücreleri1,4. Buna ek olarak, lipid özgü T hücreleri CD1 proteinler tarafından ağırlıklı olarak endositik bölmeleri5,6' yüklü lipid antijenleri ile aktif hale gelir. Lipid antijen sunumu lipid metabolizma7,8,9,10 ve fonksiyonel lipid metabolitleri CD1 proteinler için yüklenmesini üretilen lipid metabolitleri temini gerektirir endositik bölmeleri5,6. Bu bağlamda, özellikle de lipofilik kirleticiler ve bağışıklık bozuklukları, çevresel maruz lipid antijen sunumu oransal çeşitli hücresel tanımlanması için kritik faktörlerdir. Bu çalışmada, biz transcriptomic analizi, görüntü profil oluşturma ve insan monosit kaynaklı DCs hücresel ve populational görüntüleme analizi lipid antijen sunumu kirletici maruz katkıda endositik protein kaçakçılığı belirlemek için kullanılır. Kesinlikle, bu Birleşik platform hücre altı protein trafiği ve colocalization farklı biyolojik süreçlerin, eğitim için uygulanabilir.
Teknik olarak, hücre altı protein yerelleştirme genellikle confocal mikroskobu kullanarak ve istatistiksel analiz algılanan hücreleri1,2,3,11sınırlı sayıda içinde gösterilmiştir. Ayrıca, akış sitometresi geniş bir hücresel düzeyde12birden çok proteinlerin Co lekeli sinyallerle kapısı hücre popülasyonlarının uygulandı; Ancak, bu hücre altı protein colocalization detaylı bir görselleştirme eksik. Yüzde protein colocalization, hücresel ve nüfus düzeyde kapsamlı ve istatistiksel analizlerini elde etmek için protein colocalization ile biyolojik özelliklerini belirlemek için profil oluşturma ve çözümleme yaklaşımlar görüntüleme dahil alaka. Özellikle, colocalization, CD1d ve ilişkili lizozomal membran proteini 1 (Lamp1) algılamak için görüntüleme akış sitometresi kullanır Bu çalışmada proteinler. Kantitatif analiz colocalized moleküllerin daha önce populational bir ölçekte yapılması zordu. Bu çalışmada, ImageJ-Fiji program protein colocalization ile çok sayıda populational ve bireysel hücresel düzeyde işbirliği lekeli hücre yüzdesi incelemek için uyarlanmış. Özellikle, biz birlikte lokalize alanlarda, yoğunluk ve CD1d protein büyük ölçüde insan DC'lerin lipofilik kirletici benzo [a] dumanında (BaP)13 maruz geç endositik bölmeleri içinde muhafaza edildi sonuç desteklemek için populational boyutu ölçülür . Bu kombine cep ve analiz görüntüleme nüfus CD1d-Lamp1 colocalization Inhibe lipid antijen sunumu için ilgili son derece tekrarlanabilir, kapsamlı ve istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar sağladı.
İnsan DCs BaP maruz transcriptome endositik lipid metabolizması ve CD1d endositik kaçakçılığı BaP pozlama Engelli hipotez kuvvetle desteklediler. Bu hipotezi test etmek için biz CD1d, endositik işaretleri ve DC işaretleri de dahil olmak üzere birden çok proteinler ile birlikte lekeli görüntüleri DC nüfusunun profil görüntüleme akış sitometresi uygulanır. Son olarak, ortak lekeli hücreleri istatistiksel olarak yoğunluk yüzdesi ve CD1d ve Lamp1 colocalization alanları göstermek için analiz edildi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1340px;" width="1340">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Transcriptomics</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td style="width:417px;">HiSeq 2500 v4</td>
			<td style="width:191px;">Illumina HiSeq system</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">ImagingStream X</td>
			<td style="width:448px;">Millipore</td>
			<td>100220</td>
			<td>Imaging flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">mirVana miRNA Isolation Kit</td>
			<td style="width:448px;">Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Total RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agilent RNA 6000 Pico Kit</td>
			<td style="width:448px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Total RNA QC analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler</td>
			<td style="width:448px;">Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>PCR, enzyme reaction</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module&#160;</td>
			<td style="width:448px;">New England Biolab</td>
			<td></td>
			<td>PolyA RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Automated SMARTer Apollo system</td>
			<td style="width:448px;">Takara</td>
			<td></td>
			<td>PolyA RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td style="width:448px;">New England Biolab</td>
			<td></td>
			<td>Library preparation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agencourt AMPure XP magnetic beads</td>
			<td style="width:448px;">Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>DNA purification&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:448px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Library QC, size distribution analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td style="width:448px;">Agilent</td>
			<td></td>
			<td>Library QC, size distribution analysis</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher)</td>
			<td style="width:448px;">Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Library quantification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">NEBNext Library Quant Kit</td>
			<td style="width:448px;">New England Biolab</td>
			<td></td>
			<td>Library quantification</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">cBot</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Library cluster generation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot &#8211; HS</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Library cluster generation</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">HiSeq 1000</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">TruSeq SBS Kit v3 - HS (50-cycles)</td>
			<td style="width:448px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td>Sequencing</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7)</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td style="width:417px;">L243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5)</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td align="right" style="width:417px;">3.9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Brilliant violet 421</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td style="width:417px;">L161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">PE-anti-mouse IgG2b</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td align="right" style="width:417px;">51.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:284px;">Alexa Fluor 647 (AF647)</td>
			<td style="width:448px;">Bio Legend</td>
			<td style="width:417px;">CD107a(H4A3)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integrate imaging flow cytometry and transcriptomic profiling to evaluate altered endocytic cd1d trafficking

Populational morfolojik ve fonksiyonel değişikliğin endositik proteinlerin populational düzeyde bir tek hücre düzeyi ve istatistiksel görüntü analizi, görüntü yakalama talebi nedeniyle zorlu analizlerdir. Bu zorluk üstesinden gelmek için biz görüntüleme akış sitometresi ve transcriptomic (RNA-seq) profil oluşturma ilişkili değişmiş hücre altı yerelleştirme farklılaşma 1 d protein (CD1d) kümenin belirlemek için Engelli endositik gen ifade insan ile kullanılan ortak lipofilik sinin dendritik hücreler (DCs), kirletici benzo [a] dumanında hava. Colocalization CD1d ve endositik işaret Lamp1 proteinler akış sitometresi Imaging ile yakalanan hücre görüntüleri binlerce fikir ve ImageJ-Fiji kullanılarak analiz programları. Hücresel görüntülerle çok sayıda ortak lekeli CD1d ve Lamp1 proteinleri CD1d üzerinde Perdeleme sonra görüntülenir+Lamp1+ DCs fikirler kullanarak. Pozlama daha da thresholded scatterplots, kullanarak ortak yerelleştirilmiş yoğunluğu için Mander'ın katsayıları ile test edilmiş ve çizilen gösterilmiştir BaP üzerine geliştirilmiş CD1d ve Lamp1 colocalization ImageJ-Fiji kullanarak ortak lokalize alanlarda yüzde tabanlı. Protein colocalization, kirletici günese maruz kalan insan transcriptomic değişiklik Engelli fonksiyonel sonuç destekleyen tek ve populational hücresel düzeyde ölçmek için avantajlı bir enstrümantal ve bioinformatic yaklaşım bizim veri sağlamak DCs.

Lipofilik kirletici BaP endositik gen kümelerden her donör insan DCs. insan DCs monosit kaynaklı olarak değiştirir (n = 3) BaP ile inkübe ve daha da açıklandığı gibi RNA çıkarma ve transcriptomic analiz için kullanılan geleneksel DCs için sıralanmış . Gen ifadesinin normalleştirme, BaP maruz kalan ve sigara günese maruz kalan gruplar arasında değişmiş gen göre differentially ifade genlerin korelasyon fonksiyonel kümelenmiş. Toppcluster program...

Watch this Scientific Journal Video about Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking at JoVE.com

Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking

Akış Sitometresi Imaging hücreleri, bireysel ve populational düzeyde morfolojik ve fonksiyonel İLETİMLERİNİZE algılamak için ideal bir yaklaşım sağlar. Kirletici günese maruz kalan insan dendritik hücrelerinde lipid antijen sunumu için kesintiye endositik işlevi bir kombine transcriptomic gen ekspresyonu ve protein ticareti morfolojik gösteri profil oluşturma ile gösterilmiştir.

Görüntüleme akış sitometresi ve değiştirilmiş endositik CD1d kaçakçılığı değerlendirmek için profil oluşturma Transcriptomic entegre

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single ...

Bu yöntemler yeni nesil sıralama ve akış sitometri görüntüleme analizientegre. Bazı henotypik değişikliklerin transkripsiyon yerine, özellikle kirletici maruzkalma ortamında, karışıp karışmadığı gibi ilginç soruların yanıtlatımı yardımcı olabilir. Bu basit yöntemin bizim için en büyük avantajı, biyolojik olarak önemli proteinin kolokalizasyonunu ölçmek, anahtar diferansiyel gen ekspresyonunun sonuçlarını işlevsel düzeyde yorumlamak için kullanabilmektir.Bu tekniğin sonuçları patolojik ve toksikolojik sonuçların tanısına kadar uzanır. Normal bir görüntüleyici yaklaşımı olarak, forsee protein fonksiyonu gen ekspresyonu bağlamak için yeteneğine sahiptir. Genel olarak, bu yönteme yeni yeni bireyler görüntüleme ve transkripsiyon analizinin yüksek teknik talepleri nedeniyle mücadele edecektir.İnsan monositt tendritik hücre kitaplığı dizilimi için, ilk sıralama ve indeksleme reaktifleri sırasıyla biyosentez ve indeksleme reaktif rafları üzerine yükleyin ve tüm buz eriyene kadar rafları bir saat boyunca laboratuvar sınıfı su banyosuna yerleştirin ve reaktifler iyice karıştırılır. Reaktifler çözülirken, sıralayıcının gücü, Do Not Eject sürücüsü göründüğünde bilgisayarı bir ağ sürücüsüne bağlayın ve sıralayıcı kontrol yazılımını başlatın. Daha sonra, sıralama biyosentez reaktif rafındaki şişelerin her birine yaklaşık 100 mililitre bakım yıkama çözeltisi ekleyin ve her şişenin üzerine bir huni kapağı vidalayın.İndeksleme reaktifrafındaki her 15 mililitrelik konik tüpe yaklaşık 12 mililitre bakım yıkama çözeltisi ekleyin ve kapakları atın. Sonra sıralayıcı üzerine her iki rafları yükleyin. Sıralayıcı kontrol yazılımı içinde Maintenance Wash'ı seçin ve sıralayıcı akışkan sistemini temizleme yönergelerini izleyin.Sızıntı olmadığından emin olmak için akış hücresini şeritlerden geçen kabarcıklar için görsel olarak incelemek için bir el feneri kullanın. Yıkama sırası tamamlandığında, Sıra sekmesini açın ve çıktı verilerini bir ağ sürücüsüne yönlendirerek yeni bir çalıştırma başlatın. Demultiplexing için örnek bir sayfa yükleyin ve uygun reaktif bilgilerini girin.Sıralama reaktifleri ile sistemi asal etmek için kullanılan bir akış hücresi kullanın. Küme oluşturma tamamlandıktan sonra, akış hücresini çıkarın. Ve hücreyi hafifçe suyla püskürtün.Akış hücresini mercek kağıdıyla kurulayın ve ardından %95 etanol içeren hafif bir sprey püskürtün. Akış hücresini tekrar kurustuktan sonra, enkaz veya tuz kalıntısı olmadan temiz olduğundan emin olmak için akış hücresinin yüzeyini ışığa karşı kontrol edin. Asal adım tamamlandığında, kümelenmiş akış hücresini yükleyin ve sıralamaya başlayın.Dizi analizi görüntüleyici yazılımı otomatik olarak başlatılır. Yaklaşık 26 saat sonra, veri kalitesini değerlendirmek ve herhangi bir sorun giderme için yüksek sıralı kontrol yazılımı ve sıralama analizi görüntüleme yazılımı aracılığıyla veri kalitesini izleyin. Daha sonra, sıra bittiğinde, akış hücre contasını değiştirin ve bir sonraki çalıştırmaya başlamadan önce bir bakım yıkama gerçekleştirin.Kirletici maruz dendritik hücrelerin akış sitometrik görüntüleme sonra, ImageJ Fiji açık ve tedavi grubuna göre bireysel dosyalara maruz ve kirletici maruz kalan insan dendritik hücre örnek grupları için kaydedilen 100 hücre görüntüleri birleştirir. CD1d'yi ve Lamp1'i iki popülasyon içinde çözümlemek için, kirletici maruz kalan 100 birleştirilmiş hücre görüntüsünü açın ve görüntüyü kanal başına tek bir floroforile iki ayrı görüntüye bölmek için Görüntü, Renk ve Split Kanallarını seçin. Ortak yerelleştirilmiş piksellerin dağılım çizimini oluşturmak için Çözümle, Birlikte Yerelleştirme ve Colocalization Eşlemesi'ni seçin ve dağılım çizimini kaydetmek için Yazdırma Ekranına basın.Her tek hücreli görüntü için Mander'in kolocalization katsayısını hesaplamak için, bölünmüş kanalları içeren görüntü dosyasında tek hücreli bir görüntü seçmek için oval seçim aracını kullanın ve yeniden Çözümleme, Birlikte Yerelleştirme ve Kolocalization Eşiğini seçin. Ardından ilgi alanı için diyalog kutusundan Kanal 1'i seçin ve Tamam'ı tıklatın. Katsayı tüm 100 hücre görüntüleri için hesaplandığında, sonuçları uygun bir elektronik tabloya aktarın ve kontrol edilemeyen hücre örneği için çözümlemesi yineleyin. RNA dizilimi ve transkripsiyonel veri analizleri kullanılarak, kirletici maruz kalan DC'lerde lipid metabolizması ve endositik fonksiyonlar da dahil olmak üzere birçok büyük değiştirilmiş gen kümesi tespit edildi.Bireysel hücre görüntü düzeyinde, HLADR pozitif CD11c pozitif dendritik hücreler geçitli olabilir, onların CD1d ve Lamp1 coexpression göre. Kontrol maruz olmayan dendritik hücreler minimal CD1d ve Lamp1 protein kolokalizasyonu gösterir, CD1d endositik ticareti bazal düzeyde gösteren, ve fizyolojik koşullar altında yüzey ekspresyonu yüksek düzeyde. CD1d bu deneysel hücre popülasyonunda değişmiş endositik gen profilleri doğrulayan, kirletici maruz dendritik hücrelerin geç endositik bölmelerde tutulur ise.Tek tek hücresel görüntüleri tek bir görüntü dosyasında birleştirdikten sonra, tek tek görüntüler florofor ifadelerine göre bölünebilir ve iki kanal arasındaki piksel yoğunluğunun birlikte yerelleştirilmesi bir dağılım çiziminde görselleştirilebilir. Cd1d ve Lamp1 proteinleri arasındaki kolokalizasyon derecesi iki tedavi grubundaki Mander katsayıları kullanılarak ölçülebilir. Eğer protein yoğunluğu kolokalize ve kolokalize olmayan alanlar arasında heterjen ise, kolokalize edilmiş yoğunluk kolokalize alanlara paralel olmayacaktır, bu nedenle piksel yoğunluğuna bağlı olarak iki proteinin kolokalizasyonunu daha fazla değerlendirmek de önemlidir.Bir kez hakim, görüntü analizi iki saat içinde tamamlanabilir ve RNA sıralama kurulumu üç saat içinde tamamlanabilir, her teknik düzgün yapılırsa. Bu yordamı çalışırken, tüm reaktiflerin doğru konumlara düzgün yüklendiğinden ve sıralayıcıda sızıntı olmadığından emin olmak önemlidir. Bu prosedürü takiben, sırasıyla küresel mikro RNA ekspresyonu, gen mutasyonu veya DNA metilasyon hakkında ek soruları yanıtlamak için mikro RNA, eksom veya mast hücre dizilemesi gibi diğer yöntemler de yapılabilir.Yani geliştirildikten sonra, bu teknik hücresel görüntüleme analizi ve yeni nesil dizileme alanında araştırmacılara çevresel kirleticinin gen ekspresyonu ve protein fonksiyonu üzerindeki etkisini keşfetmede yardımcı olacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, yeni nesil sıralamayı ve protein kolokalizasyonunun görüntüleyici analizini nasıl kurabileceğinizi iyi anlamalısınız. İnsan kanı örneklerinde zehirli kirletici kimyasallarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın.Kimyasal duman başlığı ve kişisel koruyucu ekipman kullanımı gibi önlemler, bu işlemleri gerçekleştirirken her zaman alınmalıdır.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Bağışıklık Hücreleri murin aorta içinde Sitometrisi Analizi

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Insan In Vitro Bağışıklık Dengesizlik Erken Devlet Tanıma Tarama Aracı Olarak Bastırılması

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Görüntü tabanlı Sitometrisi Tekniği Granülosit Fonksiyonu Değişiklikleri değerlendirin<em&gt; İn Vitro</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

İnfiltratif Lenfositlerinin Analiz Olmayan enzimatik ayırmak Taze İnsan Dokusuna Basit ve Hızlı Protokolü

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fare kemik iliğinden plazmasitoid dendritik hücreleri Saflaştırılması floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

tarafından Kemirgen Lenfosit Etiketleme<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-Antikor Reseptör için hedefleme<em&gt; In Vivo</em&gt; PET / CT ile hücre Trafik

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

Görüntüleme Akım Sitometri Kullanımı T Hücresi alloreaktivitesini Ölçümü

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Akış Sitometresi Imaging kullanılarak insan sisteminde bağışıklık Synapse nitel ve nicel analiz

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Hücre içi SNARE mikroskobu Imaging Floresans ömür tarafından kaçakçılığı görüntülenmesi

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...