Name: evaluation of exon inclusion induced by splice switching antisense oligonucleotides in sma patient fibroblasts
Uploaded: 2018-05-11T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Exon Inclusion Induced by Splice Switching Antisense Oligonucleotides in SMA Patient Fibroblasts at JoVE.com

著者はニコール McRorie の実験の助けをありがちましょう。この作品は、アルバータ大学の医学、歯学、・ スリプチュク SMA 研究財団研究助成金、カナダ保健研究機構 (機構)、友人のギャレット カミング研究資金、HM のトゥーピン神経学部によって支えられました。科学研究費、筋ジストロフィー カナダ、イノベーション、アルバータ州企業と高等教育と女性や子供の健康研究所 (WCHRI) のカナダの基礎。

1. 細胞培養
<ol><li>37 ° C で CO2インキュベーターの成長培地 (ダルベッコ改変イーグル培地 1:1-12 (ハム) 10% 牛胎児血清 (FBS) と 0.5% ペニシリン/ストレプトマイシン) で文化の SMA 患者線維芽細胞</li>
	<li>自動化された細胞カウンターを用いた細胞濃度を決定し、1 x 105セル/ml 成長媒体、そして適切なプレートの種子に細胞を希釈します。RT-PCR の qPCR 12 ウェル プレート (ウェルあた...

<ol>
	<li>Iascone, D. M., Henderson, C. E., Lee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+muscular+atrophy:+from+tissue+specificity+to+therapeutic+strategies.">Spinal muscular atrophy: from tissue specificity to therapeutic strategies.</a> F1000Prime Rep. 7, 4 (2015).</li><li>Touznik, A., Lee, J. J., Yokota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+developments+in+exon+skipping+and+splice+modulation+therapies+for+neuromuscular+diseases.">New developments in exon skipping and splice modulation therapies for neuromuscular diseases.</a> Expert Opin Biol Ther. 14 (6), 809-819 (2014).</li><li>Lefebvre, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Characterization+of+a+Spinal+Muscular+Atrophy-Determining+Gene.">Identification and Characterization of a Spinal Muscular Atrophy-Determining Gene.</a> Cell. 80 (1), 155-165 (1995).</li><li>Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+nucleotide+in+the+SMN+gene+regulates+splicing+and+is+responsible+for+spinal+muscular+atrophy.">A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (11), 6307-6311 (1999).</li><li>Monani, U. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+nucleotide+difference+that+alters+splicing+patterns+distinguishes+the+SMA+gene+SMN1+from+the+copy+gene+SMN2.">A single nucleotide difference that alters splicing patterns distinguishes the SMA gene SMN1 from the copy gene SMN2.</a> Hum Mol Genet. 8 (7), 1177-1183 (1999).</li><li>Lee, J. J., Yokota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+therapy+in+neurology.">Antisense therapy in neurology.</a> J Pers Med. 3 (3), 144-176 (2013).</li><li>Aartsma-Rus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FDA+Approval+of+Nusinersen+for+Spinal+Muscular+Atrophy+Makes+2016+the+Year+of+Splice+Modulating+Oligonucleotides.">FDA Approval of Nusinersen for Spinal Muscular Atrophy Makes 2016 the Year of Splice Modulating Oligonucleotides.</a> Nucleic Acid Ther. 27 (2), 67-69 (2017).</li><li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+SMN+restoration+is+essential+for+long-term+rescue+of+a+severe+spinal+muscular+atrophy+mouse+model.">Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model.</a> Nature. 478 (7367), 123-126 (2011).</li><li>Hua, Y., Vickers, T. A., Baker, B. F., Bennett, C. F., Krainer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+SMN2+exon+7+inclusion+by+antisense+oligonucleotides+targeting+the+exon.">Enhancement of SMN2 exon 7 inclusion by antisense oligonucleotides targeting the exon.</a> PLoS Biol. 5 (4), 73 (2007).</li><li>Passini, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+oligonucleotides+delivered+to+the+mouse+CNS+ameliorate+symptoms+of+severe+spinal+muscular+atrophy.">Antisense oligonucleotides delivered to the mouse CNS ameliorate symptoms of severe spinal muscular atrophy.</a> Sci Transl Med. 3 (72), (2011).</li><li>Hammond, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+peptide-mediated+oligonucleotide+therapy+improves+long-term+survival+in+spinal+muscular+atrophy.">Systemic peptide-mediated oligonucleotide therapy improves long-term survival in spinal muscular atrophy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (39), 10962-10967 (2016).</li><li>Porensky, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+administration+of+morpholino+antisense+oligomer+rescues+spinal+muscular+atrophy+in+mouse.">A single administration of morpholino antisense oligomer rescues spinal muscular atrophy in mouse.</a> Hum Mol Genet. 21 (7), 1625-1638 (2012).</li><li>Touznik, A., Maruyama, R., Hosoki, K., Echigoya, Y., Yokota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LNA/DNA+mixmer-based+antisense+oligonucleotides+correct+alternative+splicing+of+the+SMN2+gene+and+restore+SMN+protein+expression+in+type+1+SMA+fibroblasts.">LNA/DNA mixmer-based antisense oligonucleotides correct alternative splicing of the SMN2 gene and restore SMN protein expression in type 1 SMA fibroblasts.</a> Sci Rep. 7 (1), 3672 (2017).</li><li>Obika, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+2'-O,4'-C-methyleneuridine+and+-cytidine.+Novel+bicyclic+nucleosides+having+a+fixed+C-3,-endo+sugar+puckering.">Synthesis of 2'-O,4'-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides having a fixed C-3,-endo sugar puckering.</a> Tetrahedron Letters. 38 (50), 8735-8738 (1997).</li><li>Singh, S. K., Nielsen, P., Koshkin, A. A., Wengel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LNA+(locked+nucleic+acids):+synthesis+and+high-affinity+nucleic+acid+recognition.">LNA (locked nucleic acids): synthesis and high-affinity nucleic acid recognition.</a> Chemical Communications. (4), 455-456 (1998).</li><li>Navarro, E., Serrano-Heras, G., Castano, M. J., Solera, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+detection+chemistry.">Real-time PCR detection chemistry.</a> Clin Chim Acta. 439, 231-250 (2015).</li><li>Urbanek, M. O., Nawrocka, A. U., Krzyzosiak, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA+Detection+by+in+Situ+Hybridization+Methods.">Small RNA Detection by in Situ Hybridization Methods.</a> Int J Mol Sci. 16 (6), 13259-13286 (2015).</li><li>Wahlestedt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+nontoxic+antisense+oligonucleotides+containing+locked+nucleic+acids.">Potent and nontoxic antisense oligonucleotides containing locked nucleic acids.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5633-5638 (2000).</li><li>Rupaimoole, R., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+therapeutics:+towards+a+new+era+for+the+management+of+cancer+and+other+diseases.">MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases.</a> Nat Rev Drug Discov. 16 (3), 203-222 (2017).</li><li>Lanford, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+silencing+of+microRNA-122+in+primates+with+chronic+hepatitis+C+virus+infection.">Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection.</a> Science. 327 (5962), 198-201 (2010).</li><li>Shimo, T., Maruyama, R., Yokota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+Effective+Antisense+Oligonucleotides+for+Exon+Skipping.">Designing Effective Antisense Oligonucleotides for Exon Skipping.</a> Methods Mol Biol. 1687, 143-155 (2018).</li><li>Shimo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+evaluation+of+locked+nucleic+acid-based+splice-switching+oligonucleotides+in+vitro.">Design and evaluation of locked nucleic acid-based splice-switching oligonucleotides in vitro.</a> Nucleic Acids Res. 42 (12), 8174-8187 (2014).</li><li>Nguyen, Q., Yokota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+Muscle+Cell+Model+to+Test+the+Exon+Skipping+Efficacy+for+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Immortalized Muscle Cell Model to Test the Exon Skipping Efficacy for Duchenne Muscular Dystrophy.</a> J. Pers. Med. 7 (4), 13 (2017).</li><li>Echigoya, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Antisense+Screening+and+Optimization+for+Exon+51+Skipping+in+Duchenne+Muscular+Dystrophy.">Quantitative Antisense Screening and Optimization for Exon 51 Skipping in Duchenne Muscular Dystrophy.</a> Mol Ther. , (2017).</li><li>Saito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+PMO+found+in+dystrophic+dog+model+was+effective+in+cells+from+exon+7-deleted+DMD+patient.">Antisense PMO found in dystrophic dog model was effective in cells from exon 7-deleted DMD patient.</a> PLoS One. 5 (8), 12239 (2010).</li><li>Donnelly, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+murine+model+of+SMA.">Characterization of a murine model of SMA.</a> Neurobiol Dis. 45 (3), 992-998 (2012).</li><li>Lim, K. R., Maruyama, R., Yokota, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eteplirsen+in+the+treatment+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Eteplirsen in the treatment of Duchenne muscular dystrophy.</a> Drug Des Devel Ther. 11, 533-545 (2017).</li><li>Paton, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nusinersen:+antisense+oligonucleotide+to+increase+SMN+protein+production+in+spinal+muscular+atrophy.">Nusinersen: antisense oligonucleotide to increase SMN protein production in spinal muscular atrophy.</a> Drugs Today (Barc). 53 (6), 327-337 (2017).</li><li>Prakash, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+in+vitro+and+in+vivo+activity+of+2'-O-[2-(methylamino)-2-oxoethyl]-+and+2'-O-methoxyethyl-modified+antisense+oligonucleotides.">Comparing in vitro and in vivo activity of 2'-O-[2-(methylamino)-2-oxoethyl]- and 2'-O-methoxyethyl-modified antisense oligonucleotides.</a> J Med Chem. 51 (9), 2766-2776 (2008).</li><li>Aoki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bodywide+skipping+of+exons+45-55+in+dystrophic+mdx52+mice+by+systemic+antisense+delivery.">Bodywide skipping of exons 45-55 in dystrophic mdx52 mice by systemic antisense delivery.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (34), 13763-13768 (2012).</li></ol>

ここで説明の in vitro評価法は、迅速、簡単、かつ様々 な AONs のテスト十分に敏感です。このプロトコルは、エクソン スキップや他の遺伝子や様々 なセルの種類を含めることに広く適用されます。さらに、このメソッドを使用して (PMOs) を除くほとんどのエーオン化学を導入することができます。AONs は内因性、人為的に導入された遺伝子の mRNA の選択的スプライシングを調節すること...

脊髄性筋萎縮症 (SMA) は、常染色体劣性パターンで継承された致命的な神経筋疾患です。それは、運動ニューロンと進歩的な体幹および下肢筋麻痺1,2の低下が特徴です。SMA の出現の大半は生存運動ニューロン 1 (SMN1) 遺伝子3のホモ接合体変異が原因です。生存運動ニューロン 2 (SMN2) 遺伝子はSMN1の逆複製で、ほぼ同じシーケンスのみ 5 拠点4,5によって異なります。SMN2エクソン 7 にある C-T 転移は突然変異が不可欠であるエクソンSMN2コピー (図 1、) のほぼ 90% で除外されて 7 につながるのでほぼ機能しない遺伝子を作る。エクソン 7 を行方不明SMN2 Mrna は、その蛋白質の製品は安定していないが急速に低下、 SMN1関数の補正はできません。
アンチセンス療法は最近 SMA6を治療するための非常に有望な戦略として浮上しています。米国食品医薬品局 (FDA) によって nusinersen の最近の承認は最初の薬 SMA7を治療するために利用可能にしました。Nusinersen は、2 '-O-メトキシエチル変更 (萌) ホスホロチオエート バックボーンと 18 mer アンチセンス オリゴヌクレオチド (AON) です。薬剤ターゲット イントロンのスプライシング サイレンサー N1 (ISS N1) 第 7 SMN2遺伝子のイントロンであります。ISS n1 nusinersen の結合はエクソン 7 包有物 (図 1、)8,9,10 を誘導することによって内因性のSMN2遺伝子から機能のフルレングス召蛋白質の表現の回復を促進します。.現在、SMA のエーオン療法を含む多くの研究は、nusinersen よりもより効果的なより少ない毒性があります小説エーオンの化学的性質の調査に焦点を当てます。それは、他の化学と AONs も効率的にエクソンSMN2エクソン 7 含有を誘発する実証されている生体外でそして生体内の11,12,13。
ロックされた核酸 (Lna)、化学修飾 RNA アナローグ 2 ′-酸素フラノース構造 (図 1b)14,15以内と 4 ′-炭素を結ぶメチレン橋です。Dna または Rna に比べると、Lna は相補的な RNA シーケンスにバインドするための高親和性があるし、内因性核酸に強いという利点を持っています。LNA 化学は、qPCR16,17蛍光その場で交配 (魚) のためのプローブとして使用するため適用されています。また、それを利用する遺伝子発現調節の in vitroとin vivoの両方。GapmeR AONs は、5 'と 3' 端に複数の Lna が並ぶ単一座礁させた DNA の分子の組み合わせです。彼らはターゲット Mrna、活性化リボヌクレアーゼ H18が低下する原因とする相補的な結合による遺伝子発現ノックダウンします。LNA/DNA mixmers は、Lna の間に統合された DNA ヌクレオチドから成る AONs です。この向きで提示彼らはその関数 (LNA antimiR)19を阻害する miRNA をバインドできます。いくつかの LNA antimiRs 臨床開発に達しています。例については、miravirsen (AntimiR-122) は c 型肝炎を治療するためにミール 122 を阻害する LNA antimiR といくつかのフェーズ II 臨床試験が現在進行中19,20。最近、LNA/DNA mixmers もまた RNA スプライシング21に調節をすることが実証されています。それ mRNA の特定のシーケンスにバインドでき、ジストロフィンの mRNA とエクソンのインクルー ジョンSMN2 mRNA体外13,22.のエクソンを誘発します。
この記事では、エクソン含める RNA および蛋白質レベルで AONs と有効性の評価を使用しての誘導のための方法論を概説します。この方法を実証するため、 SMN2のイントロン 7 年目標は ISS N1 LNA/DNA mixmers を使用しました。Lipotransfection による SMA 患者細胞にトランスフェクション AONs による最終SMN2コピーおよび召蛋白質の生産のアップレギュレーションのエクソン 7 含有。エクソンを含めることを誘発する LNA/DNA mixmers を使用する利点の 1 つは、トランスフェクションの効果的な濃度は他の化学13よりかなり低いです。このメソッドは、phosphorodiamidate morpholino オリゴマー (PMOs) 遠藤ポーターの共トランスフェクション試薬によるエンドサイトーシスによって細胞を入力する必要のある、その電荷は中性のためを除いて他の多くの AONs を使用できます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:655px;" width="655">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">SMA Fibroblasts</td>
			<td style="width:153px;">Coriell NIGMS human genetic cell repository</td>
			<td style="width:119px;">GM03813</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:153px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:153px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td style="width:153px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Serum-deprived media</td>
			<td style="width:153px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Transfection reagent</td>
			<td style="width:153px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">15338100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (TRIzol)</td>
			<td style="width:153px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">15596-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RT-PCR Primers</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sequence 5&#39; to 3&#39;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SMN2 forward:&#160;</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>CTGCCTCCATTTCCTTCTG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SMN2 reverse:&#160;</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>TGGTGTCATTTAGTGCTGCTC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GAPDH forward:&#160;</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>TCCCTGAGCTGAACGGGAAG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GAPDH reverse:&#160;</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>GGAGGAGTTTGGTCGCTGT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">qPCR Primers</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">full-length SMN2 forward:</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>GCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">full-length SMN2 reverse:&#160;</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>CTCTATGCCAGCATTTCTCCTTAAT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#8710;7&#160;SMN2 forward:</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>TCTGGACCACCAATAATTCCCC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#8710;7&#160;SMN2 reverse:&#160;</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>ATGCCAGCATTTCCATATAATAGCC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GAPDH forward:&#160;</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>GCAAATTCCATGGCACCGT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GAPDH reverse:</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>AGGGATCTCGCTCCTGGAA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloroform</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P3803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycogen, RNA grade</td>
			<td style="width:153px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">R0551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ Software</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Protease cocktail inhibitor&#160;</td>
			<td style="width:153px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cathode Buffer</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>0.025 M Tris base + 40&#160;mM 6-aminocaproic acid + 20% Methanol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anode Buffer</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>0.03 M Tris Base + 20% Methanol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Concentred Anode Buffer</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>0.3 M Tris base + 20% Methanol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Beta Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td style="width:153px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">ES-007-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PVDF membrane&#160;</td>
			<td style="width:153px;">GE</td>
			<td style="width:119px;">10600021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Loading/sample buffer for Western blotting</td>
			<td style="width:153px;">NuPage Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">NP007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">One-Step RT-PCR kit&#160;</td>
			<td style="width:153px;">Qiagen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">210210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dNTPs</td>
			<td style="width:153px;">Clontech</td>
			<td style="width:119px;">3040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of exon inclusion induced by splice switching antisense oligonucleotides in sma patient fibroblasts

脊髄性筋萎縮症 (SMA)、 SMN1の損失によって引き起こされる致命的な神経疾患がアンチセンス オリゴヌクレオチド (AON) の分野でユニークなケースを提示-療法を介した。SMN1遺伝子の変異は、病気の責任ですが、 SMN2のイントロンのスプライシング サイレンサー (ISS) 部位をターゲット AONs は召式を復元し、症状を改善する示されている FDA 承認 nusinersen を含みます。現在、SMA のエーオン療法を含む多くの研究は、小説エーオン化学SMN2 nusinersen よりもより効果的なより少ない有毒ことができるターゲットの調査に焦点を当てます。ここでは、AONs 続いて逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR)、量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) と西部にしみが付くことの lipotransfection を使用してエクソン介在物の in vitro評価のためのプロトコルについて述べる。このメソッドは、エーオン化学の様々 なタイプに流用できます。このメソッドを使用して、ことを示す AONs から成る交互ロックされた核酸 (Lna) 効率的なのSMN2エクソン インクルー ジョンと非常に低濃度としたがって、LNA でサンタマリアノヴェッラタンパク質の回復につながる DNA ヌクレオチド (LNA/DNA mixmers)/DNA mixmer ベース アンチセンスオリゴヌクレオチド遺伝的疾患によるスプライシングの欠陥を治療するために魅力的な治療戦略があります。ここで説明の in vitro評価法は、迅速、簡単、かつ様々 な新規 AONs のテスト十分に敏感です。

SMA 患者線維芽細胞を使用して、第 7 と 8 つの異なるアンチセンス LNA/DNA mixmers 5 nM 濃度 (図 3) で導入させたSMN2遺伝子のイントロンの ISS N1 サイレンサー地域を対象とします。Mixmers のそれぞれには、ヌクレアーゼの劣化に抵抗するが有効になって変更された phosphorothioated バックボーンが含まれています。Mixmers、 SMN2エクソンの率の?...

Watch this Scientific Journal Video about Evaluation of Exon Inclusion Induced by Splice Switching Antisense Oligonucleotides in SMA Patient Fibroblasts at JoVE.com

Evaluation of Exon Inclusion Induced by Splice Switching Antisense Oligonucleotides in SMA Patient Fibroblasts

によるエクソン介在物評価スプライスの SMA 患者の繊維芽細胞でスイッチング アンチセンスオリゴヌクレオチド

エクソン インクルー ジョン (スプライス変調) を誘導し、脊髄性筋萎縮症 (SMA) の召式を救出様々 なアンチセンスオリゴヌクレオチド (AONs) が示されています。ここでは、エーオン lipotransfection エクソン包含SMN2遺伝子の SMA 患者の繊維芽細胞の有効性を判断する評価方法を誘導するためのプロトコルについて述べる。

Spinal muscular atrophy (SMA), a lethal neurological disease caused by the loss of SMN1, presents a unique case in the field of antisense oligonucleotide ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Vascular Occlusion Training for Inclusion Body Myositis: A Novel Therapeutic Approach

封入体筋炎のための血管閉塞のトレーニング：新しい治療アプローチ

Inclusion body myositis (IBM) is a rare idiopathic inflammatory myopathy. It is known to produces remarkable muscle weakness and to greatly compromise ...

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

ヒト乳腺線維芽細胞からの癌関連線維芽細胞の実験的生成（CAFS）

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Mouse Model of Intraluminal MCAO: Cerebral Infarct Evaluation by Cresyl Violet Staining

腔内MCAOのマウスモデル：クレシルバイオレット染色による脳梗塞の評価

Stroke is the third  cause of mortality and the leading cause of disability in the World. Ischemic  stroke accounts for approximately 80% of all strokes. ...

Cardiac Stress Test Induced by Dobutamine and Monitored by Cardiac Catheterization in Mice

心臓ストレステストドブタミンによって誘導され、マウスにおける心臓カテーテル検査によって監視される

Dobutamine is a &beta;-adrenergic agonist with an affinity higher for receptor expressed in the heart (&beta;1) than for receptors expressed in the ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

定量的リアルタイムPCRによるマウス乳腺腫瘍モデルにおける肺転移の評価

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Multi-exon Skipping Using Cocktail Antisense Oligonucleotides in the Canine X-linked Muscular Dystrophy

マルチエクソンイヌX連鎖筋ジストロフィーでカクテルアンチセンスオリゴヌクレオチドを​​使用してスキップ

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is one of the most common lethal genetic diseases worldwide, caused by mutations in the dystrophin (DMD) gene. Exon ...

A Model of Glaucoma Induced by Circumlimbal Suture in Rats and Mice

ラットおよびマウスの Circumlimbal 縫合による緑内障のモデル

The circumlimbal suture is a technique for inducing experimental glaucoma in rodents by chronically elevating intraocular pressure (IOP), a well-known ...

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

顔面性腰痛患者における動的骨回転率の評価に関する定量的[18F]-Naf-PET-MRI分析

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing ...

Invasive Hemodynamic Assessment for the Right Ventricular System and Hypoxia-Induced Pulmonary Arterial Hypertension in Mice

マウスにおける右心室系と低酸素誘発性肺動脈高血圧に対する侵襲的血行力学的評価

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a chronic and severe cardiopulmonary disorder. Mice are a popular animal model used to mimic this disease. ...

Characterizing Exon Skipping Efficiency in DMD Patient Samples in Clinical Trials of Antisense Oligonucleotides

アンチセンスオリゴヌクレオチドの臨床試験におけるDMD患者サンプルにおけるエキソンスキップ効率の特徴付け

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a degenerative muscle disease that causes progressive loss of muscle mass, leading to premature death. The mutations ...

によるエクソン介在物評価スプライスの SMA 患者の繊維芽細胞でスイッチング アンチセンスオリゴヌクレオチド

によるエクソン介在物評価スプライスの SMA 患者の繊維芽細胞でスイッチングアンチセンスオリゴヌクレオチド