Name: homogeneous time-resolved f&#246;rster resonance energy transfer-based assay for detection of insulin secretion
Uploaded: 2018-05-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Homogeneous Time-resolved FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion at JoVE.com

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

1-الوظائف-1E الخلايا: صيانة وطلاء
<ol><li>الحفاظ على وظائف-1E الخلايا في هوميديفيد 37 ˚C/5% CO2 حاضنة ومثقف مع المتوسط RPMI 1640 تستكمل مع 5% (v/v) إبطال الحرارة الجنين البقري المصل، مم 2 لتر-الجلوتامين، 10 مم حبيس، بيروفات صوديوم 1 مم، 100 يو/مليلتر البنسلين/ستربتوميسين الحل, 50 ميكرومتر β-ميركابتوثانول. ...

<ol>
	<li>Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+nodes+in+signalling+pathways:+Insights+into+insulin+action.">Critical nodes in signalling pathways: Insights into insulin action.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (2), 85-96 (2006).</li><li>Vetere, A., Choudhary, A., Burns, S. M., Wagner, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+pancreatic+beta-cell+to+treat+diabetes.">Targeting the pancreatic beta-cell to treat diabetes.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (4), 278-289 (2014).</li><li>Despres, J. P., Lemieux, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abdominal+obesity+and+metabolic+syndrome.">Abdominal obesity and metabolic syndrome.</a> Nature. 444 (7121), 881-887 (2006).</li><li>Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes.">Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).</li><li>Barg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+exocytosis+in+insulin-secreting+B-cells+and+glucagon-secreting+A-cells.">Mechanisms of exocytosis in insulin-secreting B-cells and glucagon-secreting A-cells.</a> Pharmacol Toxicol. 92 (1), 3-13 (2003).</li><li>Braun, M., Ramracheya, R., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+regulation+of+insulin+secretion.">Autocrine regulation of insulin secretion.</a> Diabetes Obes Metab. 14 Suppl 3, 143-151 (2012).</li><li>Farino, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+rapid+insulin+assay+by+homogenous+time-resolved+fluorescence.">Development of a rapid insulin assay by homogenous time-resolved fluorescence.</a> PLoS One. 11 (2), e0148684 (2016).</li><li>Simpson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine-mediated+autocrine+inhibitory+circuit+regulating+human+insulin+secretion+in+vitro.">Dopamine-mediated autocrine inhibitory circuit regulating human insulin secretion in vitro.</a> Mol Endocrinol. 26 (10), 1757-1772 (2012).</li><li>Heyduk, E., Moxley, M. M., Salvatori, A., Corbett, J. A., Heyduk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+insulin+and+C-Peptide+sensors+for+rapid+assessment+of+insulin+and+C-peptide+secretion+by+the+islets.">Homogeneous insulin and C-Peptide sensors for rapid assessment of insulin and C-peptide secretion by the islets.</a> Diabetes. 59 (10), 2360-2365 (2010).</li><li>Heyduk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein+conformational+changes+by+FRET/LRET.">Measuring protein conformational changes by FRET/LRET.</a> Curr Opin Biotechnol. 13 (4), 292-296 (2002).</li><li>Degorce, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTRF((R)):+Pioneering+technology+for+high-throughput+screening.">HTRF((R)): Pioneering technology for high-throughput screening.</a> Expert Opin Drug Discov. 1 (7), 753-764 (2006).</li><li>Degorce, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTRF:+A+technology+tailored+for+drug+discovery+-+a+review+of+theoretical+aspects+and+recent+applications.">HTRF: A technology tailored for drug discovery - a review of theoretical aspects and recent applications.</a> Curr Chem Genomics. 3, 22-32 (2009).</li><li>Mathis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTRF(R)+Technology.">HTRF(R) Technology.</a> J Biomol Screen. 4 (6), 309-314 (1999).</li><li>Daijo, J. E., Sportsman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-resolved+fluorescence+immunoassay+for+insulin+in+rodent+plasma.">A time-resolved fluorescence immunoassay for insulin in rodent plasma.</a> J Pharm Biomed Anal. 19 (3-4), 335-342 (1999).</li><li>Merglen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+sensitivity+and+metabolism-secretion+coupling+studied+during+two-year+continuous+culture+in+INS-1E+insulinoma+cells.">Glucose sensitivity and metabolism-secretion coupling studied during two-year continuous culture in INS-1E insulinoma cells.</a> Endocrinology. 145 (2), 667-678 (2004).</li><li>Ustione, A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+synthesis+and+D3+receptor+activation+in+pancreatic+beta-cells+regulates+insulin+secretion+and+intracellular+[Ca(2+)]+oscillations.">Dopamine synthesis and D3 receptor activation in pancreatic beta-cells regulates insulin secretion and intracellular [Ca(2+)] oscillations.</a> Mol Endocrinol. 26 (11), 1928-1940 (2012).</li><li>Ustione, A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+introduction+to+multiphoton+microscopy.">A simple introduction to multiphoton microscopy.</a> J Microsc. 243 (3), 221-226 (2011).</li><li>Ustione, A., Piston, D. W., Harris, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Dopaminergic+regulation+of+insulin+secretion+from+the+pancreatic+islet.">Minireview: Dopaminergic regulation of insulin secretion from the pancreatic islet.</a> Mol Endocrinol. 27 (8), 1198-1207 (2013).</li><li>Rubi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D2-like+receptors+are+expressed+in+pancreatic+beta+cells+and+mediate+inhibition+of+insulin+secretion.">Dopamine D2-like receptors are expressed in pancreatic beta cells and mediate inhibition of insulin secretion.</a> J Biol Chem. 280 (44), 36824-36832 (2005).</li><li>Garcia-Tornadu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+dopamine+d2+receptor+impairs+insulin+secretion+and+causes+glucose+intolerance.">Disruption of the dopamine d2 receptor impairs insulin secretion and causes glucose intolerance.</a> Endocrinology. 151 (4), 1441-1450 (2010).</li><li>Garcia-Tornadu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+endocrine+and+metabolic+roles+of+dopamine+D2+receptors+gained+from+the+Drd2+mouse.">New insights into the endocrine and metabolic roles of dopamine D2 receptors gained from the Drd2 mouse.</a> Neuroendocrinology. 92 (4), 207-214 (2010).</li><li>Lopez Vicchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+drugs+in+type+2+diabetes+and+glucose+homeostasis.">Dopaminergic drugs in type 2 diabetes and glucose homeostasis.</a> Pharmacol Res. 109, 74-80 (2016).</li><li>Kalra, S., Kalra, B., Agrawal, N., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine:+The+forgotten+felon+in+type+2+diabetes.">Dopamine: The forgotten felon in type 2 diabetes.</a> Recent Pat Endocr Metab Immune Drug Discov. 5 (1), 61-65 (2011).</li><li>Mahajan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bromocriptine+mesylate:+FDA-approved+novel+treatment+for+type-2+diabetes.">Bromocriptine mesylate: FDA-approved novel treatment for type-2 diabetes.</a> Indian J Pharmacol. 41 (4), 197-198 (2009).</li><li>Caicedo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+and+autocrine+interactions+in+the+human+islet:+more+than+meets+the+eye.">Paracrine and autocrine interactions in the human islet: more than meets the eye.</a> Semin Cell Dev Biol. 24 (1), 11-21 (2013).</li><li>Ballon, J. S., Pajvani, U., Freyberg, Z., Leibel, R. L., Lieberman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathophysiology+of+metabolic+effects+of+antipsychotic+medications.">Molecular pathophysiology of metabolic effects of antipsychotic medications.</a> Trends Endocrinol Metab. , (2014).</li><li>Freyberg, Z., Aslanoglou, D., Shah, R., Ballon, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+antipsychotic+drug-induced+metabolic+dysfunction+in+schizophrenia.">Intrinsic and antipsychotic drug-induced metabolic dysfunction in schizophrenia.</a> Front Neurosci. 11, 432 (2017).</li><li>de Leeuw van Weenen, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopamine+receptor+D2+agonist+bromocriptine+inhibits+glucose-stimulated+insulin+secretion+by+direct+activation+of+the+alpha2-adrenergic+receptors+in+beta+cells.">The dopamine receptor D2 agonist bromocriptine inhibits glucose-stimulated insulin secretion by direct activation of the alpha2-adrenergic receptors in beta cells.</a> Biochem Pharmacol. 79 (12), 1827-1836 (2010).</li></ol>

تحليل الأنسولين هترف الموصوفة هنا يوفر نظام سريع وفعال لقياس إفراز الأنسولين من نظام قائم على الخلايا المزروعة. من بين أهم مزاياها، يوفر هذا التحليل إشارة خلفية منخفضة بسبب ارتفاع نسبة الإشارة إلى الضجيج. بالإضافة إلى ذلك، ونحن قد أكدت أن إشارة هترف مستقرة لفترات طويلة من الزمن (> ح 24)<sup clas...

وقد جرى ضبطه تنظيم استقلاب الطاقة بهرمون الابتنائية رئيسية، الأنسولين. الأنسولين هو توليف وصدر عن خلايا البنكرياس بيتا ردا على مستويات الغلوكوز خارج الخلية زيادة. مشغلات الأنسولين المفرج عنهم امتصاص الجلوكوز من الأنسجة حساسة للأنسولين1،2. الناحية الفسيولوجية، وهذا يرتبط بارتفاع تركيز الجلوكوز بعد تناول وجبة، متبوعاً بإفراز الأنسولين لتنظيم امتصاص الجلوكوز. اضطرابات في التوازن الجلوكوز تؤدي إلى الاعتلالات الأيضية التي توجت بمقاومة الأنسولين، وفي نهاية المطاف في بداية نوع 2 مرض السكري2،،من34.
على الرغم من إفراز الأنسولين وقد درست على نطاق واسع، وآلياتها التنظيمية تظل غير مفهومة. وكان مجالاً حيويا للتحقيق تحديد رواية المغيرون من إفراز الأنسولين من خلايا بيتا5،6،،من78. وتتطلب هذه الدراسات إلى فهم أفضل للعلاقة اقتران بين تنشيط الجلوكوز وإفراز الأنسولين. ولذلك كان من الضروري القدرة على دقة رصد وقياس مستويات إفراز الأنسولين الجلوكوز-وحفز (نظام خدمات التأمين الحكومية). حتى الآن، ومع ذلك، سوى عدد محدود من الأساليب متاحة للسماح للتحديد الكمي لنظام خدمات التأمين الحكومية باستخدام خطوط الخلايا إفراز الأنسولين و/أو جزيرات البنكرياس. واحد هو radioimmunoassay (ريا)، الذي يستخدم الأنسولين معلم النظائر المشعة والأجسام المضادة. وتشمل أوجه القصور الرئيسية في هذا النهج قضايا السلامة بسبب معالجة والتخلص من المواد المشعة. بالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب ذات العمالة الكثيفة، التي تشمل الغسيل الطويل وحضانة خطوات متعددة. المرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم (ELISA) هو نهج آخر مكلف وكثيفة العمالة التي تستخدم الأجسام المضادة لاكتشاف الأنسولين. التباين في الانتماءات جسم وكفاءة الاعتراف بالانسولين تعمل على الحد من العوامل لهذا الأسلوب، ويمكن أن تؤثر على إمكانية تكرار نتائج نتائج. أليسا ولا ريا صمم لتجارب الفائق. الفاسكرين مقايسة متجانسة المستخدمة لكشف وقياس مستويات إفراز الأنسولين. وتستند التكنولوجيا الفاسكرين تحويل الأكسجين المحيطة إلى دولة القميص الأوكسجين السعادة التي يمكن أن تتفاعل مع الأنواع تشيميلومينيسسينت، أدى إلى توليد تشيميلومينيسسينسي. نظراً للفحص متجانسة، تم القضاء على العديد من الخطوات الغسيل المرتبطة ريا وإليزا. عدم استقرار إشارة نظراً لطبيعة رد الفعل غير عاملاً يحد من التي قد تؤثر قراءات المقايسة. (TR-الكماشة، وضعته هييدوك والزملاء9، نهج متجانس آخر لقياس الأنسولين استناداً إلى ربط اثنين أضداد منفصل لمختلفة [ابيتوبس] في جزيء الأنسولين. الأضداد: هي كل الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل مرتبطة كيميائيا لمزدوجة مع قصيرة متكاملة واحدة الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي يتدلى. يجمع لهم ملزمة من الأجسام المضادة للأنسولين ويؤدي إلى مزدوجة الاتجاه الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل. كل جسم مضاد يرتبط أيضا مع fluorophore المانحة أو يقبلون كل منهما، ورابطة الحمض النووي مزدوج يجمع بين هذه فلوروفوريس لتوليد فورستر الرنين نقل الطاقة (الحنق). ومع ذلك، واحد الحد المحتملة من TR-الكماشة، تقع على عاتق الحنق نفسه. قد يؤدي عدم القدرة على سرعة تبديد fluorescence الخلفية أثناء عملية التفاعل الحنق إلى مستويات عالية نسبيا من الأسفار الخلفية وإشارة منخفضة إلى نسبة الضوضاء داخل المقايسة. ولذلك، لا يزال موجوداً حاجة مقايسة موثوق بها وقوية وفعالة من حيث التكلفة للتحديد الكمي لنظام خدمات التأمين الحكومية بطريقة الفائق.
توجت التقدم الذي أحرز مؤخرا في الفيزياء الحيوية في تطوير متجانسة الأسفار وقت حل الطاقة الرنين نقل (هترف) على أساس المقايسة. على وجه التحديد، بينما نقل الطاقة داخل الإنزيم قد يمكن وصفها بأنها المستندة إلى الحنق، أكثر دقة، هترف يعتمد على التﻷلؤ الطاقة الرنين نقل (بعيد)10 الذي هو غير الإشعاعي نقل الطاقة بين المانحين ويقبلون الأنواع11،،من1213. هذا التمييز مهم، منذ توقيت الأسفار أو تبريد استناداً إلى الحنق التفاعل يختلف كثيرا مما عليه للانتقال، على الرغم من أن يمكن استخدام نفس أنواع النابضة للحنق والانتقال. وعلاوة على ذلك، استخدام التراب النادر لانثانيدات كريبتاتي المركبات مثل اليوروبيوم أو كريبتاتي تيربيوم في هترف تنتج fluorescence طويلة نصف عمر12،14. وهذا يوفر ميزة فريدة من نوعها للأخذ بتأخير زمني (µsec) بين المانحين الإثارة، وقياس الانبعاثات من يقبلون (أي حل وقت الفحص). يسمح هذا التأخير الزمني لوقت كاف للأسفار الخلفية لتبديد قبل قياس يقبلون الانبعاثات الأسفار. ونتيجة لذلك، هو قراءات مجاناً من الأسفار غير محددة، وهكذا، هو تحقيق نسبة الإشارة إلى الضوضاء عالية (الشكل 1). وعلاوة على ذلك، طبيعة متجانسة هترف يلغي الحاجة للغسيل الخطوات يغسل الأنواع غير منضم، مما يجعل المقايسة الكثير أكثر سرعة من أليسا أو الأساليب المستندة إلى ريا.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57531/57531fig1.jpg"> رقم 1: التخطيطي لآلية لاكتشاف الأنسولين هترف- الأجسام المضادة التي تم إنشاؤها بشكل مستقل اثنين تعترف على وجه التحديد، وربط للأنسولين في مواقع منفصلة. يتم مترافق هذه الأجسام المضادة إلى الجهة المانحة كريبتاتي يوروبيوم أو يقبلون XL665. الإثارة للجهات المانحة في نتائج نانومتر 337 في الانبعاثات في 620 نانومتر. نقل الطاقة الناتجة عن أسباب XL665 تنبعث منها في طول موجي أطول، 665 شمال البحر الأبيض المتوسط. <a href="/files/ftp_upload/57531/57531fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصل لاستخدام نهج القائم على هترف لتحديد مستويات نظام خدمات التأمين الحكومية من الخلايا الإضافية-1E، راسخة الأنسولين إفراز المستمدة من خلية بيتا الفئران insulinoma الخلية خط15. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذا التحليل لتحديد التشكيل الجانبي الدوائي من المنظمين الجزيئية لإفراز الأنسولين. نقوم بتطبيق هذا التحليل الأنسولين المستندة إلى هترف لدراسة الدوبامين د2-مثل تنظيم مستقبلات نظام خدمات التأمين الحكومية. وأظهرت الدراسات زيادة أن الدوبامين العصبي منظم هام لنظام خدمات التأمين الحكومية8،،من1617،،من1819،20، 21 , 22-الدوبامين يؤثر على نظام خدمات التأمين الحكومية بطريقة أوتوكريني/باراكريني سلبية عبر إجراءات على الدوبامين د2-مثل مستقبلات (د2، د3، د4 مستقبلات) أعربت في سطح خلايا البنكرياس بيتا8 , 16 , 19-استخدام هذا الفحص، تأكيد دور الدوبامين في كمنظم سلبية لنظام خدمات التأمين الحكومية، وإثبات أن الدوبامين د2-مثل مستقبلات يضع بروموكريبتين وكوينبيرولي أيضا الحد من نظام خدمات التأمين الحكومية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="773">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-well white half area plate</td>
			<td style="width:104px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:139px;">82050-042</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">384-well white low-volume, round-bottom plate</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td>15100157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Insulin High Range Kit</td>
			<td style="width:104px;">Cisbio Bioassays</td>
			<td style="width:139px;">62IN1PEH&#160;</td>
			<td>10,000 test HTRF-based insulin assay kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PHERAstar FSX plate reader</td>
			<td style="width:104px;">BMG Labtech</td>
			<td>FSX</td>
			<td>Plate reader adapted for HTRF-based assay readings</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plate sealers</td>
			<td style="width:104px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">DY992</td>
			<td>To seal plate while antibodies incubate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:104px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:139px;">3100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RPMI Medium 1640 (1x)</td>
			<td style="width:104px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:139px;">11875-093</td>
			<td>[+] L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin 0.05%&#160;</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td style="width:139px;">25-052-CI</td>
			<td>0.53 mM EDTA, (-) sodium bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DPBS (Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline)</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td style="width:139px;">21-031-CV</td>
			<td>Without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td style="width:139px;">35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:104px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:139px;">156-30-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:104px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:139px;">11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin solution 100x</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td style="width:139px;">30-002 CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">M1348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td style="width:104px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:139px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dopamine hydrochloride</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">8502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bromocriptine mesylate</td>
			<td style="width:104px;">Tocris</td>
			<td style="width:139px;">427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">(-)-Quinpirole hydrochloride</td>
			<td style="width:104px;">Tocris</td>
			<td style="width:139px;">1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:104px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:139px;">12659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">P4832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">276855</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

homogeneous time-resolved f&#246;rster resonance energy transfer-based assay for detection of insulin secretion

الكشف عن إفراز الأنسولين ضروري لتوضيح آليات إفراز الخاضعة للتنظيم، وكذلك كما هو الحال في دراسات الأيض. على الرغم من أن العديد من فحوصات الأنسولين كانت موجودة منذ عقود، مبسطة الأخيرة ظهور التكنولوجيا فورستر الرنين الطاقة نقل (هترف) حل الوقت متجانسة إلى حد كبير هذه القياسات. وهذا هو مقايسة ضوئية السريعة والفعالة من حيث التكلفة واستنساخه وقوية تعتمد على الأجسام المضادة مترافق ل fluorophores مشرق مع الانبعاثات طويلة الأمد التي يسهل حلها وقت "فورستر الرنين الطاقة نقل". وعلاوة على ذلك، اكتشاف الأنسولين هترف قابلة لتطوير فحوصات الفرز الفائق. هنا نستخدم هترف للكشف عن إفراز الأنسولين في الخلايا الإضافية-1E، خط خلية المستمدة من insulinoma الفئران. وهذا يسمح لنا تقدير المستويات القاعدية للأنسولين، وهذه التغييرات استجابة للتحفيز الجلوكوز. وبالإضافة إلى ذلك، نحن نستخدم هذا النظام اكتشاف الأنسولين لتأكيد دور الدوبامين كمنظم سلبية لإفراز الأنسولين الجلوكوز-وحفز (نظام خدمات التأمين الحكومية). بطريقة مماثلة أخرى الدوبامين د2-مثل يضع مستقبلات وكوينبيرولي وبروموكريبتين، خفض نظام خدمات التأمين الحكومية بطريقة تعتمد على التركيز. نتائجنا إبراز فائدة تنسيق المقايسة الأنسولين هترف في تحديد دور المخدرات عديدة في نظام خدمات التأمين الحكومية وملفاتهم الدوائي.

علينا التحقق من صحة لدينا الإنزيم هترف الأنسولين عن طريق توليد منحنى المعياري الأنسولين استخدام معايير تنقية الأنسولين البشري من التركيزات المحددة مسبقاً (الشكل 2). جيل من المنحنى القياسي يسمح لنا باستقراء القراءات الأسفار راتيوميتريك، ومن ثم تحديد مست?...

Watch this Scientific Journal Video about Homogeneous Time-resolved FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion at JoVE.com

Homogeneous Time-resolved FÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¶rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

متجانسة فورستر حل وقت الرنين الطاقة القائم على نقل التحليل للكشف عن إفراز الأنسولين

هنا، فإننا نقدم متجانسة وقت حل الحنق (هترف) كطريقة فعالة للكشف السريع عن الأنسولين يفرز من الخلايا.

The detection of insulin secretion is critical for elucidating mechanisms of regulated secretion as well as in studies of metabolism. Though numerous ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Homogeneous Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

الإنتاج والكشف عن أنواع الاكسجين التفاعلية (ريوس) في السرطان

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

Improving IV Insulin Administration in a Community Hospital

رابعا تحسين إدارة الأنسولين في مستشفى محلي

Diabetes mellitus is a major independent risk factor for increased morbidity and mortality in the hospitalized patient, and elevated blood glucose ...

Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for Cancer Therapy Monitoring

Cerenkov Luminescence Imaging CLI for Cancer Therapy Monitoring

كيرينكوف التصوير التلألؤ (CLI) لرصد علاج السرطان

In  molecular imaging, positron emission tomography (PET) and optical imaging (OI)  are two of the most important and thus most widely used modalities1-3. ...

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

تحليل Coculture من تفاعلات البروتين خارج الخلية التي تمس افراز الانسولين من قبل خلايا بيتا في البنكرياس

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion

جنبا إلى جنب إينترافيتال المجهري وتخطيط الصدى محسنة على النقيض من اللكتات الماوس على دراسة توسع الأوعية التي يسببها الأنسولين ونضح العضلات

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate ...

Cardiac Magnetic Resonance Imaging at 7 Tesla

القلب التصوير بالرنين المغناطيسي في 7 تسلا

CMR at an ultra-high field (magnetic field strength B0&#160;&#8805; 7 Tesla) benefits from the signal-to-noise ratio (SNR) advantage inherent at higher ...

Studying the Hypothalamic Insulin Signal to Peripheral Glucose Intolerance with a Continuous Drug Infusion System into the Mouse Brain

دراسة إشارة الأنسولين طائي لتعصب الجلوكوز الطرفية مع نظام حقن المخدرات مستمرة في الدماغ الماوس

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues ...

Endotoxin Activity Assay for the Detection of Whole Blood Endotoxemia in Critically Ill Patients

فحص نشاط إندوتوكسين للكشف عن بطانة الدم الكاملة في المرضى الذين يعانون من أمراض خطيرة

Lipopolysaccharide, also known as endotoxin, is a fundamental component of gram-negative bacteria and plays a crucial role in the development of sepsis ...

Mechanisms Underlying Gut Hormone Secretion Using the Isolated Perfused Rat Small Intestine

الآليات الأساسية لإفراز هرمون الأمعاء التي تستخدم عزل Perfused الفئران الأمعاء

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, ...

Cardiac Magnetic Resonance for the Evaluation of Suspected Cardiac Thrombus: Conventional and Emerging Techniques

الرنين المغناطيسي القلبي لتقييم الجلطات القلبية المشتبه بها: التقنيات التقليدية والناشئة

We present the conventional cardiac magnetic resonance (CMR) protocol for evaluating a suspected thrombus and highlight emerging techniques.&#160;The ...