Name: homogeneous time-resolved f&#246;rster resonance energy transfer-based assay for detection of insulin secretion
Uploaded: 2018-05-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Homogeneous Time-resolved FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion at JoVE.com

De auteurs hebben niets te onthullen.

1. INS-1E cellen: onderhoud en beplating
<ol><li>Handhaven INS-1E cellen in een bevochtigde 37 ˚C/5% CO2 incubator en gekweekte met RPMI 1640 medium aangevuld met 5% (v/v) warmte-geïnactiveerd foetale runderserum, 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, 1 mM natrium pyruvaat, 100 U/mL penicilline/streptomycine oplossing, 50 µM β-mercaptoethanol. Cultuur cellen in de volledige RPMI 1640 10 mL medium (per plaat), totdat ze bij 80-90% samenvloeiing, wanneer ze kunnen worden trypsinized en gepasseerd of voor de insul...

<ol>
	<li>Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+nodes+in+signalling+pathways:+Insights+into+insulin+action.">Critical nodes in signalling pathways: Insights into insulin action.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (2), 85-96 (2006).</li><li>Vetere, A., Choudhary, A., Burns, S. M., Wagner, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+pancreatic+beta-cell+to+treat+diabetes.">Targeting the pancreatic beta-cell to treat diabetes.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (4), 278-289 (2014).</li><li>Despres, J. P., Lemieux, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abdominal+obesity+and+metabolic+syndrome.">Abdominal obesity and metabolic syndrome.</a> Nature. 444 (7121), 881-887 (2006).</li><li>Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes.">Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).</li><li>Barg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+exocytosis+in+insulin-secreting+B-cells+and+glucagon-secreting+A-cells.">Mechanisms of exocytosis in insulin-secreting B-cells and glucagon-secreting A-cells.</a> Pharmacol Toxicol. 92 (1), 3-13 (2003).</li><li>Braun, M., Ramracheya, R., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autocrine+regulation+of+insulin+secretion.">Autocrine regulation of insulin secretion.</a> Diabetes Obes Metab. 14 Suppl 3, 143-151 (2012).</li><li>Farino, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+rapid+insulin+assay+by+homogenous+time-resolved+fluorescence.">Development of a rapid insulin assay by homogenous time-resolved fluorescence.</a> PLoS One. 11 (2), e0148684 (2016).</li><li>Simpson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine-mediated+autocrine+inhibitory+circuit+regulating+human+insulin+secretion+in+vitro.">Dopamine-mediated autocrine inhibitory circuit regulating human insulin secretion in vitro.</a> Mol Endocrinol. 26 (10), 1757-1772 (2012).</li><li>Heyduk, E., Moxley, M. M., Salvatori, A., Corbett, J. A., Heyduk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+insulin+and+C-Peptide+sensors+for+rapid+assessment+of+insulin+and+C-peptide+secretion+by+the+islets.">Homogeneous insulin and C-Peptide sensors for rapid assessment of insulin and C-peptide secretion by the islets.</a> Diabetes. 59 (10), 2360-2365 (2010).</li><li>Heyduk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein+conformational+changes+by+FRET/LRET.">Measuring protein conformational changes by FRET/LRET.</a> Curr Opin Biotechnol. 13 (4), 292-296 (2002).</li><li>Degorce, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTRF((R)):+Pioneering+technology+for+high-throughput+screening.">HTRF((R)): Pioneering technology for high-throughput screening.</a> Expert Opin Drug Discov. 1 (7), 753-764 (2006).</li><li>Degorce, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTRF:+A+technology+tailored+for+drug+discovery+-+a+review+of+theoretical+aspects+and+recent+applications.">HTRF: A technology tailored for drug discovery - a review of theoretical aspects and recent applications.</a> Curr Chem Genomics. 3, 22-32 (2009).</li><li>Mathis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HTRF(R)+Technology.">HTRF(R) Technology.</a> J Biomol Screen. 4 (6), 309-314 (1999).</li><li>Daijo, J. E., Sportsman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-resolved+fluorescence+immunoassay+for+insulin+in+rodent+plasma.">A time-resolved fluorescence immunoassay for insulin in rodent plasma.</a> J Pharm Biomed Anal. 19 (3-4), 335-342 (1999).</li><li>Merglen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+sensitivity+and+metabolism-secretion+coupling+studied+during+two-year+continuous+culture+in+INS-1E+insulinoma+cells.">Glucose sensitivity and metabolism-secretion coupling studied during two-year continuous culture in INS-1E insulinoma cells.</a> Endocrinology. 145 (2), 667-678 (2004).</li><li>Ustione, A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+synthesis+and+D3+receptor+activation+in+pancreatic+beta-cells+regulates+insulin+secretion+and+intracellular+[Ca(2+)]+oscillations.">Dopamine synthesis and D3 receptor activation in pancreatic beta-cells regulates insulin secretion and intracellular [Ca(2+)] oscillations.</a> Mol Endocrinol. 26 (11), 1928-1940 (2012).</li><li>Ustione, A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+introduction+to+multiphoton+microscopy.">A simple introduction to multiphoton microscopy.</a> J Microsc. 243 (3), 221-226 (2011).</li><li>Ustione, A., Piston, D. W., Harris, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Dopaminergic+regulation+of+insulin+secretion+from+the+pancreatic+islet.">Minireview: Dopaminergic regulation of insulin secretion from the pancreatic islet.</a> Mol Endocrinol. 27 (8), 1198-1207 (2013).</li><li>Rubi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D2-like+receptors+are+expressed+in+pancreatic+beta+cells+and+mediate+inhibition+of+insulin+secretion.">Dopamine D2-like receptors are expressed in pancreatic beta cells and mediate inhibition of insulin secretion.</a> J Biol Chem. 280 (44), 36824-36832 (2005).</li><li>Garcia-Tornadu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+dopamine+d2+receptor+impairs+insulin+secretion+and+causes+glucose+intolerance.">Disruption of the dopamine d2 receptor impairs insulin secretion and causes glucose intolerance.</a> Endocrinology. 151 (4), 1441-1450 (2010).</li><li>Garcia-Tornadu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+endocrine+and+metabolic+roles+of+dopamine+D2+receptors+gained+from+the+Drd2+mouse.">New insights into the endocrine and metabolic roles of dopamine D2 receptors gained from the Drd2 mouse.</a> Neuroendocrinology. 92 (4), 207-214 (2010).</li><li>Lopez Vicchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+drugs+in+type+2+diabetes+and+glucose+homeostasis.">Dopaminergic drugs in type 2 diabetes and glucose homeostasis.</a> Pharmacol Res. 109, 74-80 (2016).</li><li>Kalra, S., Kalra, B., Agrawal, N., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine:+The+forgotten+felon+in+type+2+diabetes.">Dopamine: The forgotten felon in type 2 diabetes.</a> Recent Pat Endocr Metab Immune Drug Discov. 5 (1), 61-65 (2011).</li><li>Mahajan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bromocriptine+mesylate:+FDA-approved+novel+treatment+for+type-2+diabetes.">Bromocriptine mesylate: FDA-approved novel treatment for type-2 diabetes.</a> Indian J Pharmacol. 41 (4), 197-198 (2009).</li><li>Caicedo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+and+autocrine+interactions+in+the+human+islet:+more+than+meets+the+eye.">Paracrine and autocrine interactions in the human islet: more than meets the eye.</a> Semin Cell Dev Biol. 24 (1), 11-21 (2013).</li><li>Ballon, J. S., Pajvani, U., Freyberg, Z., Leibel, R. L., Lieberman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathophysiology+of+metabolic+effects+of+antipsychotic+medications.">Molecular pathophysiology of metabolic effects of antipsychotic medications.</a> Trends Endocrinol Metab. , (2014).</li><li>Freyberg, Z., Aslanoglou, D., Shah, R., Ballon, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+antipsychotic+drug-induced+metabolic+dysfunction+in+schizophrenia.">Intrinsic and antipsychotic drug-induced metabolic dysfunction in schizophrenia.</a> Front Neurosci. 11, 432 (2017).</li><li>de Leeuw van Weenen, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopamine+receptor+D2+agonist+bromocriptine+inhibits+glucose-stimulated+insulin+secretion+by+direct+activation+of+the+alpha2-adrenergic+receptors+in+beta+cells.">The dopamine receptor D2 agonist bromocriptine inhibits glucose-stimulated insulin secretion by direct activation of the alpha2-adrenergic receptors in beta cells.</a> Biochem Pharmacol. 79 (12), 1827-1836 (2010).</li></ol>

De HTRF insuline assay hier beschreven biedt een snelle, efficiënte systeem voor het meten van de insuline secretie van een gekweekte cel-gebaseerd systeem. Onder zijn belangrijkste voordelen biedt deze test een signaal van de laag achtergrond als gevolg van de hoge signaal-/ ruisverhouding. Bovendien, we hebben bevestigd dat het HTRF signaal stabiel voor langere tijd (> 24 h)7. Niettemin, aangezien snel de insuline-bindende monoclonal antilichamen bindende verzadiging na toevoeging aan de bepali...

De regulering van de energie-stofwisseling is verfijnd door een grote anabole hormoon, insuline. Insuline wordt gesynthetiseerd en uitgebracht door alvleesklier beta cellen in reactie op de toegenomen extracellulaire glucoseniveaus. De vrijgegeven insuline activeert de opname van glucose door insuline-gevoelige weefsels1,2. Fysiologisch, is dit gekoppeld aan de hoogte van glucose concentratie na een maaltijd, gevolgd door de secretie van insuline te reguleren van glucose-opname. Verstoringen in glucose homeostase leiden tot metabole waardeverminderingen culminerend in insulineresistentie en uiteindelijk in het begin van type 2 diabetes2,3,4.
Hoewel insuline secretie is uitgebreid bestudeerd, blijven de regulerende mechanismen slecht begrepen. Een cruciaal gebied van onderzoek is identificatie van roman modulatoren van insuline secretie door beta cellen5,,6,,7,8. Deze studies vereisen een beter begrip van de relatie van de koppeling tussen stimulatie van glucose en insuline secretie. Daarom is de mogelijkheid om nauwkeurig controleren en kwantificeren van de niveaus van de glucose-gestimuleerd insuline secretie (GSIS) essentieel geweest. Tot op heden, waren echter slechts een beperkt aantal methoden om een kwantificering van GSIS met behulp van insuline-afscheidende cellijnen en/of de alvleesklier eilandjes. Een is de radioimmunoanalyse (RIA), die gebruik maakt van de isotoop-gelabeld insuline en antilichamen. De belangrijkste beperkingen van deze aanpak zijn veiligheidsproblemen als gevolg van de behandeling en de verwijdering van radioactieve materialen. Bovendien, is deze methode arbeidsintensief, waarbij meerdere lange wassen en incubatie stappen. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is een andere duur en arbeidsintensief benadering die gebruikmaakt van antilichamen voor insuline detectie. Variatie in antilichaam affiniteiten en de efficiëntie van de erkenning van insuline factoren van deze methode zijn beperkt, en de reproduceerbaarheid van de resultaten kan beïnvloeden. ELISA noch RIA is ontworpen voor high-throughput experimenten. AlphaScreen is een homogene test gebruikt voor het opsporen en het meten van niveaus van insuline secretie. AlphaScreen technologie is gebaseerd op de omzetting van ambient zuurstof in een opgewonden zuurstof singlet staat die met chemiluminescentie soorten reageren kan, resulterend in de generatie van Chemoluminescentie. Omdat de bepaling homogeen is, worden veel van de stappen van de Supermarket gekoppeld RIA en ELISA geëlimineerd. De instabiliteit van het signaal door de aard van de reactie is echter een beperkende factor die invloed kan hebben op de uitlezing van de bepaling. (TR-Tang, ontwikkeld door Heyduk en collega's9, is een andere homogene aanpak van insuline waarderingsmethode op basis van de binding van twee aparte antilichamen tegen verschillende epitopen op de insuline-molecuul. De antilichamen zijn elk chemisch verbonden met dubbele gestrande DNA met korte overhangen voor aanvullende gestrande enkele DNA. Binding van de antilichamen aan insuline brengt hen samen en leidt tot een dubbele duplex voor gestrande DNA. Elke antilichaam wordt ook geassocieerd met een respectieve donor of acceptor fluorophore en de vereniging van de DNA-duplex verenigt deze fluorophores te genereren Förster resonance energy transfer (FRET). Een mogelijke beperking van TR-Tang, berust echter bij de FRET zelf. Het onvermogen om snel het verdrijven van achtergrond fluorescentie tijdens de FRET reactie kan leiden tot relatief hoge achtergrond fluorescentie en een lage signaal / ruisverhouding binnen de bepaling. Daarom bestaat een noodzaak nog steeds voor een betrouwbare, robuuste en rendabele assay voor het kwantificeren GSIS zodanig hoge gegevensdoorvoer.
Recente vooruitgang in de biofysica hebben geresulteerd in de ontwikkeling van een homogene time-resolved fluorescentie energie resonantie overdracht (HTRF) gebaseerd assay. Specifiek, terwijl de energie overdracht binnen kan de bepaling worden omschreven als FRET gebaseerde, nauwkeuriger, dat HTRF afhankelijk van luminescentie energie resonantie overdracht (LRET)10 die de niet-stralingstransport van energie tussen de donor en de acceptor soorten11,12,13. Dit onderscheid is belangrijk, aangezien de timing van een fluorescentie of blussen gebaseerde FRET interactie is veel anders dan die van LRET, hoewel het dezelfde soorten gating kunnen worden gebruikt voor de FRET en LRET. Bovendien, het gebruik van zeldzame aarden lanthanide cryptate verbindingen zoals europium of terbium cryptate in HTRF produceert lange fluorescentie halfwaardetijd12,14. Dit biedt het unieke voordeel van de invoering van een vertraging (µsec) tussen excitatie van de donor en de meting van de emissie van de acceptor (dat wil zeggen, time-resolved assay). Deze vertraging zorgt voor voldoende tijd voor de achtergrond fluorescentie te verdrijven voorafgaand aan de meting van de acceptor emissie fluorescentie. Bijgevolg, de uitlezing is gratis voor niet-specifieke fluorescentie en dus een hoge signaal-/ ruisverhouding wordt bereikt (Figuur 1). Bovendien, het homogene karakter van de HTRF elimineert de noodzaak voor het wassen van de stappen aan het afwassen van de niet-afhankelijke soorten, het maken van de test veel sneller dan ELISA of RIA gebaseerde methoden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57531/57531fig1.jpg"> Figuur 1: schematische van het mechanisme voor HTRF insuline detectie. Twee onafhankelijk gegenereerde monoklonale antilichamen specifiek herkennen en binden aan insuline op afzonderlijke sites. Deze antilichamen zijn geconjugeerd aan hetzij de europium cryptate donor of de XL665 acceptor. Excitatie van de donor op 337 nm resultaten in emissie bij 620 nm. De resulterende energieoverdracht veroorzaakt XL665 te stoten bij een langere golflengte, 665 nm. <a href="/files/ftp_upload/57531/57531fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het bepalen van de niveaus van GSIS van INS-1E cellen met een HTRF gebaseerde benadering, een gevestigde insuline-afscheidende bèta cel-afgeleide rat Insulinoom cel lijn15. Bovendien, kan deze bepaling worden gebruikt voor de identificatie van het farmacologisch profiel van moleculaire regulatoren van insuline secretie. We passen deze test van de HTRF gebaseerde insuline te onderzoeken van dopamine D2-like receptor regulering van GSIS. Steeds meer studies hebben aangetoond dat de neurotransmitter dopamine een belangrijke regulator van GSIS8,16,17,18,19,20, 21 , 22. dopamine beïnvloedt GSIS op een negatieve wijze van de autocrine/paracrine via acties op de dopamine D-2-receptoren (D2, D3D4 receptoren) uitgedrukt op het oppervlak van beta cellen van de alvleesklier8 graag , 16 , 19. met behulp van deze test, wij bevestigen dopamine de rol als een negatieve regulator van GSIS en aantonen dat de dopamine D2-like receptor agonisten bromocriptine en quinpirole ook GSIS verminderen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="773">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-well white half area plate</td>
			<td style="width:104px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:139px;">82050-042</td>
			<td style="width:315px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">384-well white low-volume, round-bottom plate</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td>15100157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Insulin High Range Kit</td>
			<td style="width:104px;">Cisbio Bioassays</td>
			<td style="width:139px;">62IN1PEH&#160;</td>
			<td>10,000 test HTRF-based insulin assay kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PHERAstar FSX plate reader</td>
			<td style="width:104px;">BMG Labtech</td>
			<td>FSX</td>
			<td>Plate reader adapted for HTRF-based assay readings</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Plate sealers</td>
			<td style="width:104px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:139px;">DY992</td>
			<td>To seal plate while antibodies incubate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:104px;">Hausser Scientific</td>
			<td style="width:139px;">3100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RPMI Medium 1640 (1x)</td>
			<td style="width:104px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:139px;">11875-093</td>
			<td>[+] L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin 0.05%&#160;</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td style="width:139px;">25-052-CI</td>
			<td>0.53 mM EDTA, (-) sodium bicarbonate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DPBS (Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline)</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td style="width:139px;">21-031-CV</td>
			<td>Without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td style="width:139px;">35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:104px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:139px;">156-30-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium pyruvate</td>
			<td style="width:104px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:139px;">11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin solution 100x</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td style="width:139px;">30-002 CT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">M1348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypan Blue Stain (0.4%)</td>
			<td style="width:104px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:139px;">15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dopamine hydrochloride</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">8502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bromocriptine mesylate</td>
			<td style="width:104px;">Tocris</td>
			<td style="width:139px;">427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">(-)-Quinpirole hydrochloride</td>
			<td style="width:104px;">Tocris</td>
			<td style="width:139px;">1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:104px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:139px;">12659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">P4832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td>
			<td style="width:104px;">Sigma</td>
			<td style="width:139px;">276855</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

homogeneous time-resolved f&#246;rster resonance energy transfer-based assay for detection of insulin secretion

De detectie van insuline secretie is essentieel voor informatief mechanismen van gereglementeerde secretie zo goed zoals in de studie van het metabolisme. Hoewel talrijke insuline tests hebben al tientallen jaren bestaan, heeft de recente komst van homogene time-resolved Förster Resonance Energy Transfer (HTRF) technologie deze metingen aanzienlijk vereenvoudigd. Dit is een snelle, rendabele, reproduceerbare en robuuste optische test afhankelijker van antilichamen geconjugeerd met heldere fluorophores met langdurige emissie die time-resolved Förster Resonance Energy Transfer vergemakkelijkt. Bovendien is HTRF insuline detectie vatbaar voor de ontwikkeling van high-throughput screening tests. Hier gebruiken we HTRF om het detecteren van insuline secretie in INS-1E cellen, een rat Insulinoom afkomstige cellijn. Dit kan we schatten van basale niveaus van insuline en hun veranderingen in reactie op de stimulatie van de glucose. Daarnaast gebruiken wij deze insuline-detectiesysteem om te bevestigen de rol van dopamine als een negatieve regulator van glucose-gestimuleerd insuline secretie (GSIS). Op een vergelijkbare manier, andere dopamine D2-like receptor agonisten, quinpirole en bromocriptine, GSIS in een concentratie-afhankelijke manier verminderen. Onze resultaten wijzen op het nut van het HTRF insuline assay formaat bij het bepalen van de rol van talrijke drugs in GSIS en hun farmacologische profielen.

We onze insuline HTRF assay gevalideerd door het genereren van een insuline standaard curve met behulp van gezuiverde menselijke insuline normen van vooraf gedefinieerde concentraties (Figuur 2). Generatie van de standaard curve toegestaan ons om te extrapoleren de ratiometric fluorescentie lezingen en dus om te bepalen van de secreted insulineniveaus in reactie op de behandelingen van de drug (Figuur 2). Intraplate variatie voor...

Watch this Scientific Journal Video about Homogeneous Time-resolved FÃƒÂ¶rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion at JoVE.com

Homogeneous Time-resolved FÃƒÆ’Ã†'Ãƒâ€šÃ‚Â¶rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

Homogene Time-resolved Förster Resonance energie overdracht gebaseerde Assay voor detectie van insuline secretie

Hier presenteren we homogene tijd opgelost FRET (HTRF) als een efficiënte methode voor snelle detectie van insuline afgescheiden uit cellen.

The detection of insulin secretion is critical for elucidating mechanisms of regulated secretion as well as in studies of metabolism. Though numerous ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Homogeneous Time-resolved F&#246;rster Resonance Energy Transfer-based Assay for Detection of Insulin Secretion

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Productie en detectie van reactive oxygen species (ROS) in kanker

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

Improving IV Insulin Administration in a Community Hospital

Verbetering van de IV toediening van insuline aan een communautair Ziekenhuis

Diabetes mellitus is a major independent risk factor for increased morbidity and mortality in the hospitalized patient, and elevated blood glucose ...

Cerenkov Luminescence Imaging (CLI) for Cancer Therapy Monitoring

Cerenkov Luminescence Imaging CLI for Cancer Therapy Monitoring

Cerenkov Luminescentie Imaging (CLI) voor kankertherapie Monitoring

In  molecular imaging, positron emission tomography (PET) and optical imaging (OI)  are two of the most important and thus most widely used modalities1-3. ...

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

Coculture Analyse van extracellulaire eiwit interacties met invloed op de insulinesecretie door bètacellen in de pancreas

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion

Gecombineerde Intravital microscopie en Contrast-enhanced Ultrasonografie van het stuk van de muis om te bestuderen van de insuline-geïnduceerde vasodilatatie en spier perfusie

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate ...

Cardiac Magnetic Resonance Imaging at 7 Tesla

Cardiale magnetische resonantie beeldvorming bij 7 Tesla

CMR at an ultra-high field (magnetic field strength B0&#160;&#8805; 7 Tesla) benefits from the signal-to-noise ratio (SNR) advantage inherent at higher ...

Studying the Hypothalamic Insulin Signal to Peripheral Glucose Intolerance with a Continuous Drug Infusion System into the Mouse Brain

Bestuderen van het signaal van de hypothalamische insuline naar perifere Glucose-intolerantie met een continue Drug infusie-systeem in de hersenen van de muis

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues ...

Endotoxin Activity Assay for the Detection of Whole Blood Endotoxemia in Critically Ill Patients

Endotoxine activiteit test voor de detectie van volbloed Endotoxemie bij ernstig zieke patiënten

Lipopolysaccharide, also known as endotoxin, is a fundamental component of gram-negative bacteria and plays a crucial role in the development of sepsis ...

Mechanisms Underlying Gut Hormone Secretion Using the Isolated Perfused Rat Small Intestine

Mechanismen die ten grondslag liggen aan de Gut hormoon afscheiding met behulp van de geïsoleerde geperfundeerd Rat dunne darm

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, ...

Cardiac Magnetic Resonance for the Evaluation of Suspected Cardiac Thrombus: Conventional and Emerging Techniques

Cardiale magnetische resonantie voor de evaluatie van vermoede cardiale trombus: conventionele en opkomende technieken

We present the conventional cardiac magnetic resonance (CMR) protocol for evaluating a suspected thrombus and highlight emerging techniques.&#160;The ...